cDNA末端快速扩增技术的研究进展

cDNA末端快速扩增技术是一种基于多聚酶链式反应的技术 ,它的发展大大便利了应用其它方法获得的部分cDNA序列后克隆全长cDNA 5’和 3’末端的工作。不仅RACE方法能在短时间内得到完整的cDNA末端序列 ,而且一些截短的cDNA末端常常也能在RACE的过程中被扩增 ,而这些截短的产物破坏了全长cDNA克隆的获取。许多研究者对RACE的流程提出了改进方案 ,从而提高了该技术的效力。本文介绍了许多已发表的RACE技术关键步骤的改良 ,包括一些具体有效的操作流程 ,如RNA连接酶介导的RACE/连接锚定PCR等 ,还有其有效性的例证。     

cDNA末端快速扩增试剂盒研发进展

DNA扩增的方法有许多种,其中cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）因其操作简单、成功率相对较高、重复性好,被广泛应用于真核生物基因全长的克隆与分析。本文比较了市售的RACE试剂盒所采用的模板制备策略及改进的扩增方法。     

一种新的cDNA末端快速扩增获取全长cDNA的方法

为克隆精子发生相关基因的全长cDNA,根据mRNA差异显示获得的ESTs设计引物。利用一种新的cDNA末端快速扩增方法（SMART RACE）扩增该EST的5′末端,并进行克隆测序,与cDNA差异显示获得ESTs拼接后,获得了三个新的全长cDNA。结果表明：SMAR RACE是一种简便、有效的克隆cDNA5′末端未知序列的技术。     

cDNA末端快速扩增技术研究进展

全长 cDNA 的获得是基因克隆的重要内容,也是基因组研究中的一个重要方面．cDNA 末端快速扩增技术(RACE)是获得全长 cDNA 的主要辅助手段之一,从 RACE 的原理出发,指出该技术本身存在的优缺点,阐述 RACE 操作中不容忽视的技术要点,对前人对 RACE 的改进加以总结．     

cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良

cDNA末端的快速扩增(RACE)法是延伸已知部分外显子序列和克隆全长cDNA基因的主要方法之一。广泛用于许多已知功能基因片段的进一步延伸和全长cDNA的克隆。但由于其过程复杂、涉及多步连续的酶促过程,如反转录、TdT加尾、第二链合成、RACE-PCR扩增及RACE产物克隆等,在实际应用中有许多问题和相当难度,主要针对RACE各步骤中存在的问题进行了分析,并对其优化和改良进行了综述。     

一种新的cDNA 末端快速扩增获取全长cDNA的方法

为克隆精子发生相关基因的全长cDNA,根据mRNA差异显示获得的ESTs设计引物,利用一种新的cDNA末端快速扩增方法(SMARTRACE)扩增该EST的5′末端,并进行克隆测序,与mRNA差异显示获得ESTs拼接后,获得了三个新的全长cDNA.结果表明,SMARTRACE是一种简便、有效的克隆cDNA5′末端未知序列的技术. Abstract:To clone the full-length cDNAs of genes related to spermatogenesis,ESTs obtained by mRNA differential display were used to design gene-specific primer.Then SMART RACE was performed to obtain the 5′ region of these ESTs.After cloning,sequencing and splicing with ESTs obtained by mRNA differential display,three full-length cDNAs were obtained.The results indicate that SMART RACE is a simple and an effective technique for cloning 5′-end unknown sequence of gene.     

简化cDNA末端快速扩增技术测定基因III、VIb和VIId型新城疫病毒基因组末端序列及分析

摘要: 【目的】简化cDNA末端快速扩增技术（Rapid amplification of cDNA ends, RACE）流程,测定基因III、VIb和VIId型新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）基因组两侧末端序列,并对NDV的leader和trailer进行分析。【方法】利用T4 RNA连接酶将特定寡聚核苷酸片段的连接于病毒基因组RNA和cDNA,再利用RT-PCR或PCR方法对病毒基因组的末端进行快速的扩增。【结果】建立一套操作简单、低成本、可重复性高的RACE方法,测定了三种基因型5株NDV 3’末端leader和5’末端trailer序列比对分析。【结论】本实验测定的鹅源VII型毒株JS/7/05/Ch基因组的15,184 nt由一个T变为了C,5’端trailer与3’端leader的连续互补序列由8 nt变为12 nt,而其它4株基因III型和VI型NDV均未发现该突变。通过RNA的二级结构分析,NDV基因组和反向基因组RNA的3’末端形成一个发卡结构。JS/7/05/Ch等3株NDV U→C（T→C）的突变位于发卡环上,不影响二级结构的形成,发卡环的RNA序列突变为3’-UCUC-5’,与基因组3’端发卡环的3’-UCUUA-5’相似,推测可能影响了基因组RNA的复制速度。     

简化cDNA末端快速扩增技术测定基因Ⅲ、Ⅵb和Ⅶ d型新城疫病毒基因组末端序列及分析

[目的]简化cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,fLAcE)流程,测定基因Ⅲ、VIb)和VIId型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因组两侧末端序列,并对NDV的leader和trailer进行分析.[方法]利用T4 RNA连接酶将特定寡聚核苷酸片段的连接于病毒基因组RNA和eDNA,再利用RT-PCR或PCR方法对病毒基因组的末端进行快速的扩增.[结果]建立一套操作简单、低成本、可重复性高的RACE方法,测定了三种基因型5株NDV 3'末端leader和5'末端trailer序列比对分析.[结论]本实验测定的鹅源VII型毒株JS/7/05/Ch基因组的15,184 nt由一个T变为了C,5'端trailer与3'端leader的连续互补序列由8 nt变为12 nt,而其它4株基因Ⅲ型和VI型NDV均未发现该突变.通过RNA的二级结构分析,NDV基因组和反向基因组RNA的3'末端形成一个发卡结构.JS/7/05/Ch等3株NDV U→C(T→C)的突变位于发卡环上,不影响二级结构的形成,发卡环的RNA序列突变为3'-UCUC-5',与基因组3'端发卡环的3'-UCUUA-5'相似,推测可能影响了基因组RNA的复制速度.     

cDNA末端快速扩增技术及其应用*

摘要：cDNA末端快速扩增（RACE）技术是一种快速获得cDNA的3′和5＇端的方法。本文从RACE的原理出发,指出其技术本身存在的优缺点,阐述了RACE操作中须注意和不容忽视的技术要点,并对前人对RACE技术所做的改进加以总结,最后对RACE技术的应用前景给予了展望。Abstract: Rapid amplification of cDNA end (RACE) technique is a method of which the 3’ and 5’ fragments of cDNA can be rapidly obtained. In this review, the advantages and shortcomings RACE manipulation were pointed out and some important technical points in RACE protocols in the previous literatures were summarized.     

大乳头水螅RACE cDNA文库的构建

目的:为筛选和克隆大乳头水螅发育调控相关基因的全长cDNA,构建大乳头水螅RACE cDNA文库.方法:提取大乳头水螅总RNA后从其中分离mRNA,运用SMART技术构建RACE cDNA文库.为鉴定所构建文库的质量,根据GenBank中大乳头水螅actin基因cDNA序列设计5'RACE和3'RACE的引物及用于扩增actin基因编码区全长序列的引物.结果:琼脂糖凝胶电泳结果表明,RACE cDNA文库中全长cDNA的长度集中在500-2 000bp之间.5'RACE、3'RACE PCR及扩增actin基因编码区全长序列时均以本文构建的大乳头水螅RACE cDNA文库为模板,这3个PCR反应均能扩增出产物,产物大小与目标片段预计大小相似.PCR产物分别经T/A克隆及测序后证明为大乳头水螅actin基因cDNA的相应序列.结论:RACE cDNA文库的成功构建为通过RACE方法获得大乳头水螅功能基因cDNA全长序列奠定了基础.     

基于模板切换的mRNA5'末端全长扩增方法

本文介绍一种称为CapFinder的技术,可用于克隆基因mRNA序列的5'末端非翻译区全长。该技术是利用某些反转录酶在反转录达到mRNA的5'末端帽结构时表现出很高的加尾活性(主要添加dC)这一特点,在反转录体系中加入一种带GGG的寡核苷酸序列,当反转录反应到达mRNA模板的5'末端帽结构时,切换到以该寡核酸为模板继续进行反转录反应,即可合成完整的cDNA一链,且在其3'末端还带有一段额外的寡核苷酸序列。用GGG寡核苷酸序列为上游引物和基因特异性的下游引物进行PCR即可扩增得到mRNA5'末端非翻译区的全长。利用该技术克隆了棉铃虫幼虫中肠Bt毒素受体E-钙粘素基因的5'末端非翻译区序列。     

天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA克隆

旨在克隆天祝白牦牛胰岛素样生长因子2(IGF-2)基因编码区全长cDNA序列,为研究该基因的生理功能奠定基础。运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列。扩增获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列为1 060 bp(GenBank登录号:KF682139),ORF长540 bp,编码179个氨基酸。其编码的氨基酸与已报道哺乳动物IGF-2氨基酸序列同源性在80%-92%之间。天祝白牦牛IGF-2基因的成功克隆为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

两步PCR快速扩增东亚钳蝎BmKIT3 3′cDNA末端序列

对3′-RACE方法进行了修改,采用一条特异性引物和一条通用Oligo dT引物成功地克隆了东亚钳蝎BmKIT3 3′cDNA末端,与常规3′-RACE方法相比,两步PCR方法具有节约成本、节省时间、增加反应特异性等优点,尤其适用于生物活性肽基因的快速克隆和鉴定.     

利用Y-RACE法进行棉花胚珠cDNA末端快速扩增

在YADE(Y shapedadaptordependentextension)方法的基础上 ,设计了一种新的cDNA末端快速扩增方法 ,称为Y RACE法 .利用该方法只需一次cDNA合成就能进行多个基因的 3′和 5′末端的扩增 .分别利用Y RACE方法和RACE试剂盒 (TaKaRa)扩增了一个棉花胚珠cDNA片段F0 2 7的末端序列 .序列比较表明 ,用Y RACE方法扩增的末端序列较试剂盒所得序列在最末端稍短 ,但同样能进行正确拼接并获得全长编码序列 .对Y RACE法的优缺点和可能的改进作了进一步讨论 .     

胃癌相关cDNA片段的快速克隆和表达分析

利用差异显示PCR技术获得的一条在胃癌和正常组织有差异表达的表达序列标签(EST)-W123(GenBank登录号为AF150631),通过与GenBank的dbest库进行电子杂交,选取了与其同源度高的若干EST,在它们共有的保守序列设计了用于扩增的寡聚核苷酸引物,利用cDNA末端快速扩增PCR（RACE）技术得到了7条带有polyA尾的3′EST,进行序列分析后,发现它们均是代表新基因或不同剪接体的EST,且具有共同的保守序列,已登录GenBank.采用RNA印迹对目的序列进行初步鉴定,并进行了这些基因的组织分布分析.RACE技术和生物信息学相结合,具有快速、高效的特点,有助于疾病相关基因的克隆.     

人脑红蛋白(NGB)全长cDNA序列的克隆

人脑红蛋白(neuroglobin, NGB)是新发现的神经系统特异的携氧蛋白, 然而其全长cDNA序列一直未见报道. 采用电子序列延伸技术和cDNA序列末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)研究发现, 人NGB全长cDNA序列为1 909 bp, 5′非编码区为375 bp, 编码区(456 bp)可编码151个氨基酸, 3′非编码区为1 078 bp, 其中含27 bp的poly(A)(GenBank接受号: AF422797). 综合采用电子序列延伸技术与RACE技术是获得全长cDNA序列的有效方法, 为后续的功能研究提供了重要基础.     

由EST到全长cDNA--RACE及相关技术进展

由EST出发获得全长cDNA是基因组和功能基因组研究的重要内容之一,cDNA末端扩增技术（RACE）是实现此目的的重要方法。本文对RACE的基本原理及其改进,尤其是AM－MV酶TS（template switch)功能的应用带来的技术革新进行了综述。     

落叶松cDNA扩增因素优化组合的研究

为了探讨落叶松cDNA扩增因素优化组合,以落叶松总RNA为模板逆转录为cDNA,然后进行PCR扩增,采用四因素三水平正交试验设计,分析比较了几种因素对PCR扩增的影响,结果显示,主要影响因素是Taq酶和Mg^2 ,随机引物和dNTP的影响较小,不同水平的影响作用是：Taq酶以高水平,即用量为2U,Mg^2 以中低水平,即用量为1.5-2.0mmol/L,可以得到多而清晰的条带;反之,则扩增效果差。     

利用RACE技术和生物信息学资源快速钓取多个侯选同源基因

利用差异显示PCR技术获得的一条在胃癌癌旁和正常组织表达量高的EST－W123,通过与GenBank的dbest库进行电子交,选取了与W123同源度高的若干EST,在它们共有的保守序列设计了用于扩增的寡聚核苷酸引物,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术得到了7条带有polyA尾的3'EST,进行序列分析后,发现它们均是代表新基因或不同剪接体的EST,且具有共同的保守序列,已登录GenBank。