无色杆菌蛋白酶Ⅰ突变体的结构与稳定性研究

报道了用定位诱变技术，改变无色杆蛋白酶Ⅰ的酶原加工位点，使其向左或向右移动，导致突变体成熟酶的肽链从Ｎ端延长或缩短若干氨基酸残基。所获突变体显示了低于野生酶的活性。突变体的园二色谱和荧光光说研究表明，它们的结构发生了某些微小的改变。在不同的ＰＨ值的，温度和不同浓度的ＳＤＳ和盐酸胍条件下，也表现了低于天然酶的稳定性。     

无色杆菌蛋白酶Ⅰ肽链N端作用的突变研究

无色杆菌蛋白酶Ⅰ是高度专一于赖氨酸的丝氨酸蛋白酶,比较其它典型同类蛋白酶的一级结构,该酶的成熟体肽链在Ｎ端和Ｃ端分别长出９个和２６个氨基酸残基。在其Ｎ端设计和构建一些突变体。它们分别具有缩短或延长的Ｎ端。这此突变体低于天然酶的活性和稳定性的结果揭示,Ｎ端这部分延长在稳定该酶的活性构象方面起着重要作用。     

无色杆菌蛋白酶Ⅰ肽链N端作用的突变研究

无色杆菌蛋白酶Ⅰ（AchromobacterproteaseⅠ,APⅠ）是高度专一于赖氨酸的丝氨酸蛋白酶．比较其它典型同类蛋白酶的一级结构,该酶的成熟体肽键在N端和C端分别长出9个和26个氨基酸践基．在其N端设计和构建了一些突变体,它们分别具有缩短或延长的N端．这些突变体低于天然酶的活性和稳定性的结果揭示,N端这部分延长在稳定该酶的活性构象方面起着重要作用．     

一株地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究Ⅰ.

从皖北盐碱地土术中分离到011菌株,对其进行了菌种鉴定以及胞外碱性蛋白酶的初步研究。结果表明：011菌株符合地衣芽孢杆菌种的特征,但该菌芽孢端生、孢囊膨大、中度耐盐、高度耐碱,可在NaCl浓度为13％和pH11的培养基中生长,这些特征又不同于该种几个模式株,因而将011菌株鉴定为地衣芽孢杆菌的一个亚种,命名为地衣芽孢杆菌砀山亚种（Bacillus licheniformis subsp.dangshanensis）。该菌在发酵培养基中能产生较高产量的胞外碱性蛋白酶（725u/mL）。酶的最适作用条件：60℃、pH9.0,该酶在pH6.0-11范围内稳定。     

一株符合无色杆菌科性状的球杆菌描述

本文报告了自烧伤病人创面感染分离出编号为'64-320'的、1株符合无色杆菌科性状的、无动力球状双杆菌的鉴定结果,并讨论其在分类学中的位置和致病力,认为这一菌株与粘液无色杆菌和溶血无色杆菌,或称为硝酸盐阴性杆菌、粘液双球菌和阴道海雷氏菌的一类微生物近似。试验表明:'64-320'菌株在含胨培养基内对糖(崞)类的反应时间显著延迟,甚或不规则地出现阴性结果,故以在不含胨的Board氏培养基内进行观察较为适宜,在鉴定类似细菌的工作中应引起注意。     

枯草蛋白酶E的突变体

Ser236位于横贯枯草蛋白酶E的α螺旋末端,远离催化活性中心,Ser236的突变不会对酶的活性产生大的影响。用定点突变的方法对枯草蛋白酶E的基因进行改造引入Ser236Cys,可能会形成分子间二硫键,有利于提高酶的稳定性。Ser236Cys变体酶(BP1)活性是野生型蛋白酶E的15倍,热稳定性提高3倍;进一步在其他位点引入突变的变体酶BU1(A1a15Asp/Gly20His/Ser236Cys)和BW1(Ser24His/Lys27Asp/Ser236Cys)活性都比野生型蛋白酶E低,但BW1的稳定性稍高于野生型蛋白酶E。     

Kunitz 型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构与功能研究

蛋白酶抑制剂在酶学及蛋白质的结构与功能关系研究中有重要意义,Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂是其中最重要的,也是研究最广泛的蛋白酶抑制剂之一．该类蛋白酶抑制剂三维结构高度保守：由一个明显的疏水核心、三对高度保守的二硫键桥、三链β-折叠和一个N端3 10螺旋及一个C端α-螺旋组成．3对二硫键对分子空间结构的稳定起着非常重要的作用．这一类型抑制剂有5个主要的活性位点：P1、P1’、P3、P3’、P4,它们都位于一个溶剂暴露的环上．P1位点是抑制作用的关键活性位点,抑制剂的专一性由P1位点氨基酸残基的性质决定;P1’位点氨基酸残基的侧链大小对抑制剂．酶的结合常数有很大影响,用大的侧链残基取代会导致结合常数降低;P4位点残基被取代经常产生负效应,会导致活性区域环的构象发生很大改变,从而影响酶与抑制剂的结合．     

1株枯草芽胞杆菌的鉴定及其弹性蛋白酶结构研究

鉴定弹性蛋白酶产生菌株EL32,确定该酶的基本结构。采用分子生物学、形态学及生理生化性质对菌株EL32进行鉴定;用硫酸铵沉淀、离子交换层析和分子筛层析纯化酶蛋白;借助肽指纹图谱及酶基因克隆技术研究该酶的一级结构;利用同源建模的方法研究该酶的空间结构。菌株EL32的16S rDNA与枯草芽胞杆菌16S rDNA的同源性达到99%,其菌落呈乳白色,其细胞革兰染色阳性,具有芽胞;发酵葡萄糖试验产酸不产气,明胶水解试验呈阳性,能够水解淀粉,V-P反应呈阳性,鉴定为枯草芽胞杆菌。从菌株BL32发酵液中纯化得到了弹性蛋白酶,SDS-PAGE分析显示其分子量为31 ku。用LTQ-MS测定肽指纹图谱表明该弹性蛋白酶是枯草芽胞杆菌蛋白酶subtilisin,该酶的基因和蛋白质序列与枯草芽胞杆菌蛋白酶subtilisin的同源性都高达99%。菌株EL32弹性蛋白酶的三维结构含有6个α-螺旋,7个扭曲的平行β-折叠以及2个反平行的β-折叠,His、Asp和Ser是其活性中心的关键基团。鉴定了1株产弹性蛋白酶的枯草芽胞杆菌,确定了其弹性蛋白酶是蛋白酶subtilisin,为该枯草芽胞杆菌蛋白酶的应用提供了基础。     

地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究 Ⅰ.碱性蛋白酶高产菌的筛选及产酶条件初探

从成都佳丰食品厂等处采集的样品中平板分离初筛到124株碱性蛋白酶产生菌,进一步复筛出一株高产,且稳定的碱性蛋白酶产生菌株B．L．JF-ld,初步鉴定为地衣穿孢杆菌（Bacilluslicheniformis）。该菌的最适产酶条件为：培养基（％）为麦芽糖7．5,酵母膏3,NaCl0．5,K2HPO4·3H2O0．53,NaHPO4·2H2O0．03,Na2CO30．056,MnSO4l×10－4mol／L,pH8．7,通气量为（1：0．5）～（1：1）（v／v）,37℃发酵40h,酶活力单位高达7180U／ml。     

地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究Ⅱ碱性蛋白酶的提纯和性质研究

地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｂ．Ｌ ＪＦ－１ｄ三级发酵的发酵液经离心去菌体,（ＮＨ４）２ＳＯ４分段盐析,透析后进行Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００柱层析得粗酶制剂。比活力从１８７８Ｕ／ｍｇ提高到６７９５Ｕ／ｍｇ,酶活力回收率为３５．３％。该酶水解酷蛋白的最适反应温度为５５℃,最适ｐＨ为１０．５,具有较高的热稳定性,对ＳＤＳ有较强的耐受性。     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶的提纯和性质的研究

由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)209产生的胞外碱性蛋白酶的粗酶制剂(5×10 4u／g),经硼砂NaOH缓冲液抽提,硫酸铵沉淀,Sephadex G一25脱盐,DEAE-纤维素柱层析,冷冻干燥获得部分纯化的酶。纯酶的活力为199x10u/g,比活力提高2,6倍。此酶的最适pH8．5—9．0,在pH6一10之间稳定,因此是属于微碱性蛋白酶“’。最适温度为50℃,在50℃以下稳定,在60℃处理10分钟活力损失95％。0.003村c丑件的存在对酶的热稳定性和pH稳定性均有显著提高。Ag+,Cu2+,Fe2+,Hg+,Zn2+ 对酶有抑制作用;Mn2+有明显的激活作用;1×10-3M的PCMB,IAA,O-PTH,PMSF对活力无影响;1×10-3M EDTA对酶有30％的抑制作用;在40℃用NBS(1×10-4M)、DFP(2．5mM)对醢进行10分钟处理,酶活力完全损失。此酶能水解多种天然蛋白,如酪蛋白、血红蛋白、蛇毒蛋白等,不水解鱼精蛋白和溶菌酶。以酪蛋白为底物测得的km值为0．66×10-2g／ml。在pH7．3进行圆盘凝胶电泳,虽然呈现九条带,但均具有大小不等的蛋白酶活力。     

嗜碱性芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究——Ⅰ.菌种分离、筛选及发酵条件的研究

从38份土样中筛选到一株嗜碱性短小芽孢杆菌R115,能在pH10以上的环境中生长,并在pH10条件下产生较高的碱性蛋白酶。酶反应的最适pH为10.5,最适温度45℃;在pH12条件下最适温度为28℃。     

张家口地区木糖氧化无色杆菌耐药性的相关基因分析

目的：了解张家口地区木糖氧化无色杆菌耐药性的相关基因的基因型别,为临床合理使用抗生素提供实验依据。方法：应用改良三维试验法筛选耐β-内酰胺类药物的菌株,再结合PCR技术和序列测定检测耐药菌ESBLs和AmpC酶的基因型别,最后进行统计学分析。结果：2010年12月~2011年12月本地区临床分离的48株木糖无色杆菌菌株中有32株对β-内酰胺类药物耐药,检出率高达66.7%,其中14株单产ESBLs,5株单产AmpC酶,9株同时产ESBLs和AmpC酶,4株为未知型菌株;筛选出的耐药菌中有24株PCR结果阳性,分属于不同耐药基因型并发现存在多重耐药基因。ESBLs以TEM型检出率最高,均为TEM-1亚型;AmpC酶检出率也较高,均为DHA-1型;多重耐药基因TEM＋CTX-M-1＋AmpC检出率最高。结论：张家口地区木糖氧化无色杆菌的耐药现象严重,临床上应严格掌握头抱菌素类药物的使用以取得更好的治疗效果。     

产碱性蛋白酶芽孢杆菌的鉴定

通过测量比较在碱性蛋白平板上产生的蛋白水解圈直径,从土壤中筛选到一株高产蛋白酶菌株Bacillus sp.HFBL0079,根据生理生化特性、16S rDNA序列,鉴定为B.amyloliquefaciens。其最适培养温度为35°C-37°C,最适生长pH 8.0,在特定培养条件下16 h达到稳定期,菌体生长和蛋白酶合成同步进行。以大豆分离蛋白为氮源时发酵液具有最高酶活。发酵液在pH 10时具有最高酶活,表明为碱性蛋白酶。该菌株产生的碱性蛋白酶可水解多种天然蛋白质,对胶原蛋白水解度高于其他蛋白质,对羽毛角蛋白也有一定水解能力,提示该酶具有一定新颖性。     

嗜热芽孢杆菌XJT9503高温中性蛋白酶的研究──Ⅰ．XJT9503菌的特性

从新疆吐鲁番盆地土壤里分离到一株嗜热芽孢杆菌,代号ＸＪＴ９５０３．能产生胞外高温中性蛋白酶,该菌在旋转式摇床上１１０ｒ／ｍｉｎ,４５℃下培养６０小时,发酵液产酶为５６００单位／ｍｌ,但在４５℃静止培养产酶可达７４００单位／ｍｌ,Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋对产酶有明显促进作用,Ｃｕ２＋等抑制产酶。     

地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶基因的克隆与序列分析

以地衣芽孢杆菌２７０９染色体ＤＮＡ为模板,应用聚合酶链反应方法扩增了碱性蛋白酶基因,ＰＣＲ反应产物在１％琼脂糖凝胶上表现为１条１．１ｋｂ的条带。该片段经电泳纯化后被克隆于大肠杆菌质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ上,获得ａｐｒＬ＾＋克隆株。ＤＮＡ序列分析表明,它与枯草杆菌蛋白酶Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ具有很高的同源性,同样由编码信号肽、前导肽及成熟蛋白的３个部分构成。