2,5-DKG还原酶Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

参照文献上的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸（简称2,5-DKG）还原酶II基因序列,合成两个引物序列并在两端加上EcoRI和BamHI两个酶切位点,抽提棒状杆菌SCB3058菌株的染色体为模板进行PCR反应,克隆得到2,5-DKG还原酶II基因,酶切验证与预期的结果相符合。将此片段克隆到pGEM-T载体上保存．将2,5-DKG还原酶II基因用EcoRI和BamHI内切酶切下,连接到pBV220载体上,构建成表达载体。42℃诱导不能得到稳定的蛋白表达条带和酶活力,测序发现基因的3’末端的原PCR引物外少合了一个碱基,终止密码子发生移码突变而消失。此外在5’端的启始密码子ATG前有三个碱基与pBV220载体上的SD序列发生配对。据此,重新设计和合成了PCR引物,并用pBV220和pBL4载体构建了两个表达载体。42℃诱导表达均得到了稳定的表达条带和较高的酶活力．     

2,5—KDG还原菌Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

参照文献上的２,５－二基－Ｄ－葡萄糖酸还原酶Ⅱ基因序列,合成两个引物序列并在两端加上ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ两个酶切位点,抽提棒状杆菌ＳＣＢ３０５８菌株的染色体灯反进行ＰＣＲ反应,克 得到２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅱ基因,酶切验民预期的结果相符合。将此片段克隆到ＰＧＥＭ－Ｔ载体上保存将２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅱ基因用ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨＩｍ内切酶切下,连接到ＰＢＶ２２０载体上,构建成表达载体,４２℃诱导不能得     

L—山梨酮脱氢酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

参照已知的Ｌ－山梨酮脱氢酶基因序列,合成了两个引物序列,以ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｌｉｑｕｅｆｉｃｉｅｎｓＩＦ０１２２５８的染色体ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ反应,克隆得到了Ｌ－山梨酮脱氢酶基因,经酶切验证与预期结果相同,序列测定结果也与已知序列一致,采用ＰＣＲ方法在此基因的两端加上了Ｅ．ｃｏＲＩ和ＨｉｎｄＩＩ两个酶切位点,经Ｅ．ｃｏＲＩ和ＨｉｎｄＩＩ酶切后去掉了两端的多余序列后,将此片段连接到ｐＫＫＨｈ     

L─山梨酮脱氢酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

参照已知的L－山梨酮脱氢酶基因序列,合成了两个引物序列,以AcetobacterliqueficiensIF012258的染色体DNA为模板进行PCR反应,克隆得到了L－山梨酮脱氢酶基因,经酶切验证与预期结果相同,序列测定结果也与已知序列一致。采用PCR方法在此基因的两端加上了E．coRI和HindⅢ两个酶切位点,经E．coRI和HindⅢ酶切后去掉了两端的多余序列后,将此片段连接到pKKH上,经诱导无蛋白表达,采用RcaI酶切启动子端,对载体pKKH则采用Mcol酶切,使表达载体的SD序列     

-L-古龙酸的研究—Ⅱ.2,5-DKG产酸菌株发酵条件

本文研究了D-葡萄糖两步串联发酵中前一步菌株的发酵产酸条件。实验结果表明,在含有D-葡萄糖、适量的玉米浆、碳酸钙和磷酸盐的培养基中,摇瓶培养48小时,一株葡萄糖酸杆菌突变株SCB611可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸25—30mg/ml,克分子转化率为25%左右;另一株欧文氏菌突变株SCB247可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸45—50mg/ml,克分子转化率为40%。随发酵时间适当延长,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸可逐渐增高。温度28℃,种龄15小时,接种量10%及良好的通气条件,有利于菌株产生2,     

棒状杆菌2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的克隆与表达

从棒状杆菌(Corynebacterium sp.SCB3058)初步纯化得到两个2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5 DKG)还原酶,在此基础上利用PCR技术,以基因组DNA为模板,扩增得到含有2,5-DKG还原酶Ⅰ基因的片段,定向连接到PGEM3Zf(+)并转化大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性克隆pGEM813.序列分析表明,片段全长1107bp,含有一个834bp的开放阅读框架,编码产生由278个氨基酸组成的分子量为34kD的蛋白.将目的基因的调控序列进行缺失突变后,克隆到原核表达载体pBL上获得表达质粒pBL4.通过温度诱导,经SDS-PAGE分析有明显的表达条带,约占菌体总蛋白的20%,并且表达的蛋白具有较高的酶活力.构建的优良基因工程菌为最终实现从葡萄糖一步发酵产生维生素C前体2-酮基-L-古龙酸打下了基础.     

2,5-DKG还原酶I的分离纯化与性质研究*

欧文氏菌ER97高效表达了从棒状杆菌SCB3058克隆的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-DKG)还原酶I基因,5 L罐发酵后,收集菌体破碎,将胞内可溶性的蛋白通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析和Phenyl Sepharose CL-4B疏水柱层析后分离纯化到了2,5-DKG还原酶I,纯化了5倍,得率27%,比活力为3,418 U/mg。测定了该酶的一些特性参数:分子量为34 kD,等电点为6.0,它以NADPH为辅酶,将2,5-DKG还原为2-酮基-L-古龙     

mel基因在酿酒酵母菌中的克隆和表达*

构建了含mel基因的重组质粒pAJM,并转化到酿酒酵母菌中,获得了在平板上产生黑色表型的转化重组子,为酵母菌的遗传操作提供了一种新的选择标记。由于mel基因经酪氨酸产生的黑色素无毒、无害,安全稳定,无需另外加显色化合物或使用特殊的仪器设备,直接在平板上观察结果。因此,是一种便捷、价廉、无污染的新型报告基因。此外,实验中还发现含mel基因的酵母菌生长迅速,这不仅作为报告基因更能显示其优势,而且也为进一步研究其在酵母菌中的功能提出了新的内容。     

棒状杆菌2，5-DKG还原酶基因在欧文氏菌中的表达

将能够在大肠杆菌内高效表达棒状杆菌2,5-DKG还原酶I基因的质粒pBL4改造成为具有链霉素抗性的质粒pBLS,采用改进的感受态转化法将pBLS导入能够利用葡萄糖高产2,5-DKG的欧文氏菌SCB125中,通过提高温度诱导,经SDS-PAGE分析2,5-DKG还原酶I获得了高效表达,占菌体总蛋白的22%,不形成包涵体。体外酶活测定结果表明表达的酶具有较高的活力。同时,通过凝胶活力染色发现了宿主欧文氏菌SCB125中存在一个活力较强的2-酮基醛糖还原酶。     

D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的研究——Ⅱ.2,5-DKG产酸菌株发酵条件

本文研究了D-葡萄糖两步串联发酵中前一步菌株的发酵产酸条件。实验结果表明,在含有D-葡萄糖、适量的玉米浆、碳酸钙和磷酸盐的培养基中,摇瓶培养48小时,一株葡萄糖酸杆菌突变株SCB611可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸25—30mg/ml,克分子转化率为25%左右;另一株欧文氏菌突变株SCB247可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸45—50mg/ml,克分子转化率为40%。随发酵时间适当延长,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸可逐渐增高。温度28℃,种龄15小时,接种量10%及良好的通气条件,有利于菌株产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸。     

麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因在大肠杆菌中的表达

用PCR法扩增麦迪霉素产生菌酮基还原酶（MKR）基因,得到约0．8kb的DNA片段,扩增片段重组到利用依赖T7RNA聚合酶的高效表达载体pT7－7中,在大肠杆菌中表达出28．9kD的蛋白质。表达的蛋白质具有生物活性。     

棒状杆菌2,5—二酮基—D—葡萄糖酸还原酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的克隆？…

从棒状杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＳＣＢ３０５８）初步纯化得到两个２,５－二酮基－Ｄ－葡萄糖酸（２,５－ＤＫＧ）还原酶,在此基础上利用ＰＣＲ技术,以基因组ＤＮＡ为模板,扩增得到含有２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅰ基因的片段,定向连接到ＰＧＥＭ３Ｚｆ（＋并转化大肠杆菌ＤＨ５α,是到阳性克隆ｐＧＥＭ８１３。     

近平滑假丝酵母(R)-专一性羰基还原酶基因的克隆与表达*

根据纯化得到的（R）-专一性羰基还原酶（rCR）蛋白质测序结果推导出的核苷酸序列设计引物,以筛选得到的近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC M203011基因组为模板,通过PCR扩增目的片段,克隆后测序。核苷酸序列测定结果表明rcr基因全长1011bp,共编码336个氨基酸,分子量为35．9kD。将序列递交NCBI比对,与醇脱氢酶超家族成员序列同源性达99％。在大肠杆菌（Escherichia coli）JM109中表达rcr基因,重组菌可还原β-羟基苯乙酮得到（R）-苯乙二醇,光学纯度为100％e．e,摩尔产率为80．4％,在反应体系中无需外加辅酶再生系统即可完成转化。     

食品抗氧剂-D-异抗坏血酸的研究——Ⅱ.产酮产碱菌E54产生2-酮基-D-葡萄糖酸的发酵条件*

2-酮基-D-葡萄糖酸是合成D-异抗坏血酸(简称异维生素C)的前体。而D-异抗坏血酸及其钠盐是广泛应用于食品工业中的优良抗氧剂。本文通过新种产酮产碱菌使葡萄糖发酵产生2-酮基-D-葡萄糖酸,并对该菌发酵的碳源、氮源、通气量、温度、金属离子等影响作了探讨,通过正交试验确定了产生2-酮基-D-葡萄糖酸最佳种子培养基和发酵培养基。并对该菌的发酵代谢作了初步的观察。     

Vc二步发酵中伴生菌的作用机制*

应用细胞培养和膜分离技术研究了Vc两步发酵中伴生菌巨大芽孢杆菌 (Bacillusmegaterium)对氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacteroxydans)产酸作用机制。结果表明 :巨大芽孢杆菌培养液中分子量在 30～ 5 0kD及大于 1 0 0kD组分明显促进产酸 :其组分通过凝胶层析分离纯化 ,自动紫外检测仪检测 ( 280nm) ,聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮兰G2 5 0特异染色 ,初步证实为蛋白质 ,且至少是两种以上蛋白质 ,它们在低温下稳定性较好。     

近平滑假丝酵母(R)-专一性羰基还原酶基因的克隆与表达*

根据纯化得到的?-专一性羰基还原酶(rCR)蛋白质测序结果推导出的核苷酸序列设计引物,以筛选得到的近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011基因组为模板,通过PCR扩增目的片段,克隆后测序。核苷酸序列测定结果表明rcr基因全长1011bp,共编码336个氨基酸,分子量为35·9kD。将序列递交NCBI比对,与醇脱氢酶超家族成员序列同源性达99%。在大肠杆菌(Escherichia coli)JM109中表达rcr基因,重组     

甲状旁腺素相关蛋白cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达*

采用RT-PcR方法从中国人肾癌细胞株中克隆到甲状旁腺素相关蛋白(Parathyroidhonnnoe related protein,PTHrP)cDNA,其核苷酸序列与国外发表资料相比,有6个核苷酸不同．其中仅92位密码子的不同导致氨基酸变异．即由脯氨酸变为丝氨酸。将克隆的PTHrPcDNA插到原核表达载体pET一3a的T7噬菌体启动子下游,转化大肠杆菌后得到高效表达,并经Western blot和生物学活性检测对表达产物作了鉴定。     

猪瘟病毒糖蛋白E0基因的克隆及其表达研究*

用ＲＴ－ＰＣＲＡ法扩增分别获得了中国猪瘟病毒强毒石门株和免化弱毒株糖蛋白Ｅ０基因ｃＤＮＡ,并克隆到ｐＧＥＭ Ｔ载体中测定其核着酸序列和推导出其对应氨基酸序列;结果表明这两个毒株间的Ｅ０基因核着酸序列同源性为９５．３％,氨基酸序列同源性为９４％,有１４个残基的差异;与几个代表毒株ＡＬＤ株、ＧＰＥ株、Ｂｒｅｓｃｉａ株、Ａｌｆｏｒｔ株和国外测得的免化弱毒Ｃ株相应序列进行比较,所测石门病毒核苷酸序列与上述各株对应序列的同源性分别为９８．０％、９７．１％、９２．７％、８６．８％和９５．４％;氨基酸序列同源性分别为９     

牡丹二氢黄酮醇4-还原酶基因PsDFR1的克隆及表达分析

二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）是花色素苷合成途径中的关键酶,在植物花色的形成过程中起重要作用。本研究以牡丹品种‘彩绘’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了一个牡丹DFR基因cDNA全长,命名为PsDFR1,GenBank登录号为HQ283448。序列分析结果表明,PsDFR1全长1242bp,包含一个长为1095bp的开放阅读框,编码364个氨基酸。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白具有典型的DFR蛋白功能结构域,包括多个保守的短链脱氢/还原酶家族的特征位点,属于NADB_Rossmann超家族。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,PsDFR1与葡萄、棉花、毛果杨、梨等植物的DFR相似性都在75%以上。实时荧光定量PCR分析表明,PsDFR1在花色素大量积累的花瓣中表达量最高,其次是萼片和雄蕊,再次是叶片,在心皮中表达量最低。     

枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆及表达*

利用鸟枪法构建了供体菌的基因组文库,通过VP反应显色法进行筛选,从约7000个转化子中选出携带ALDC基因的重组质粒（pBG4～pBG5）．绘制了pBG4插入片段的限制酶图谱．Southern杂交证明该外源片段来源于供体菌。酶活性测定结果表明ALDC基因在大肠杆菌中获得了表达,为构建带有ALDC的啤酒酵母工程菌奠定了基础．