麦长管蚜羧酸酯酶基因cDNA片段克隆及吡虫啉胁迫对其表达的影响

羧酸酯酶在昆虫对杀虫剂的解毒代谢过程中发挥重要作用,本研究旨在分析吡虫啉胁迫对麦长管蚜羧酸酯酶基因表达的影响。采用同源克隆方法克隆麦长管蚜羧酸酯酶基因cDNA片段,实时荧光定量PCR技术检测羧酸酯酶基因在不同吡虫啉剂量下的表达量变化。扩增所得麦长管蚜羧酸酯酶基因cDNA片段大小为392 bp,命名为SaEST 3(GenBank登录号KY 441614),该片段编码130个氨基酸残基,分子量14 kD,等电点4.93。序列同源性比对及生物信息学分析表明SaEST3推导的氨基酸序列与豌豆长管蚜、麦双尾蚜、夹竹桃蚜、桃蚜的羧酸酯酶氨基酸序列相似性较高,分别为94%、85%、80%和80%。实时荧光定量PCR结果显示,不同吡虫啉处理剂量下,SaEST3 m RNA的相对表达量均上调。克隆得到的基因片段为麦长管蚜羧酸酯酶基因片段,吡虫啉对麦长管蚜羧酸酯酶基因SaEST3表达有一定的影响。     

斜纹夜蛾羧酸酯酶基因的克隆、序列分析及表达水平

为了明确斜纹夜蛾Spodoptera litura对溴氰菊酯产生抗性的分子机理, 本研究利用RT-PCR技术和RACE方法获得了1个斜纹夜蛾羧酸酯酶基因的全长cDNA序列, 命名为Slest2。序列分析表明, 该cDNA全长1 796 bp（GenBank 登录号: DQ445461）, 5′和3′UTR区分别长63和119 bp,开放阅读框编码一个由537个氨基酸残基组成的羧酸酯酶蛋白。通过对氨基酸同源性分析表明, 该羧酸酯酶与其他物种的酯酶均具有很高的氨基酸相似性,并具有多个在不同酯酶蛋白家族中均保守的区域。采用实时定量PCR技术比较了Slest2在斜纹夜蛾抗、感品系中的表达水平。当以cDNA为模板检测mRNA转录水平时发现, Slest2在抗性品系中的转录水平是敏感品系的46.85倍; 以基因组DNA为模板检测Slest2基因的拷贝数时发现, Slest2在抗、感性品系中的拷贝数无显著差异（前者为后者的1.16倍）。这些结果表明, 抗性与敏感品系具有相似的Slest2基因拷贝数, 但它们在抗性品系中的转录水平显著升高。由此推测Slest2基因的转录水平升高与斜纹夜蛾对溴氰菊酯的抗药性密切相关。     

嗜热脂肪芽孢杆菌羧酸酯酶的异源表达及酶学性质研究

运用生物信息学技术从嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus) CICC 20156中克隆获得羧酸酯酶基因,构建黑曲霉和毕氏酵母表达质粒,将重组质粒分别转化毕氏酵母GS115和黑曲霉pyrG基因缺陷株M54．SDS-PAGE和Western blot检测显示：携带His标记的外源蛋白在转化真菌宿主中均获得了高效分泌性表达,毕氏酵母和黑曲霉表达的外源蛋白分子质量均约为29 ku,蛋白质浓度分别为30.7 mg/L和15.3 mg/L．生物学活性测定表明,毕氏酵母与黑曲霉表达的羧酸酯酶单位蛋白酶活分别为22 671 U/mg和21 438 U/mg．酶学性质研究显示,两种表达系统表达的重组羧酸酯酶的酶学特性基本一致,它们在40～70℃范围内均显示较好的酶活性,最适反应温度为60℃．70℃处理30 min,毕氏酵母和黑曲霉表达重组羧酸酯酶残余酶活分别为 76.7%和67.6%,显示出良好的热稳定性．在pH 6.5～8.5的范围内显示较高酶活性,最适pH为8.0．上述研究首次实现了具有良好热稳定性的嗜热脂肪芽孢杆菌羧酸酯酶在黑曲霉和毕氏酵母中高效异源分泌性表达,其中毕氏酵母羧酸酯酶的产量要高于黑曲霉的酶产量,但考虑到重组黑曲霉表达外源性蛋白无需使用任何诱导剂,黑曲霉菌表达热稳定性羧酸酯酶可能具有更好的应用前景．     

稻纵卷叶螟羧酸酯酶基因的鉴定与表达谱分析

【目的】鉴定稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis的羧酸酯酶基因,并检测这些基因在成虫不同组织中的表达模式。【方法】从稻纵卷叶螟转录组中搜索羧酸酯酶基因,使用生物信息学软件对所获得的基因序列进行分析,使用荧光定量PCR检测这些基因在各组织中的相对表达水平。【结果】获得了15个羧酸酯酶基因,分别命名为Cm Car E1~Cm Car E15。其中Cm Car E12缺少3′区域,其余14个序列均含有完整的开放阅读框。除Cm Car E11外,其余14个基因编码的蛋白均具有羧酸酯酶的典型特征,如保守的五肽结构域,催化三联体和氧阴离子穴等。系统进化分析显示15个Cm Car Es被聚在不同的进化支内,Cm Car E13、Cm Car E14和Cm Car E15聚在"胞内催化类"进化支,其余12个Cm Car Es聚在"分泌催化类"进化支。Cm Car E1、Cm Car E2、Cm Car E3、Cm Car E7、Cm Car E8、Cm Car E10和Cm Car E13特异表达于成虫腹部,而Cm Car E9特异表达于雌雄成虫触角。其他基因的表达没有组织特异性。【结论】Cm Car E1、Cm Car E2、Cm Car E3、Cm Car E7、Cm Car E8、Cm Car E10和Cm Car E13编码的酯酶可能参与了内外源化合物的代谢,而Cm Car E9编码的酯酶可能参与了气味分子的降解。     

家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-9的鉴定与表达分析

羧酸酯酶是一个多功能超家族酶类, 为研究羧酸酯酶基因在家蚕Bombyx mori组织中的功能, 利用5′/3′RACE和RT-PCR方法克隆了一个家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-9, 其GenBank登录号为EU523534。该基因含有一个1 680 bp的ORF, 编码559个氨基酸。BmCarE-9预测的分子量64.2 kD, 等电点7.13, 结构分析表明BmCarE-9存在一个类似的催化三联体, 其中两个残基发生改变。利用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在家蚕5龄第3天幼虫不同组织以及在5龄期各日龄幼虫丝腺组织中的表达水平。结果表明, 该基因在丝腺中特异性高表达, 且主要在中部和后部丝腺中表达。该基因在5龄期随着丝腺的生长发育表达量逐渐增高, 到末期表达水平逐渐降低。据此推测该基因可能与丝腺的生长发育或丝蛋白的合成相关。     

甜菜夜蛾羧酸酯酶基因cDNA的克隆、表达及序列分析

羧酸酯酶是昆虫体内重要的解毒酶系之一,与昆虫抗药性产生相关。利用粉纹夜蛾Trichoplusia ni (Hübner)肠粘蛋白多克隆抗体免疫筛选甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)中肠cDNA表达文库,得到编码羧酸酯酶的全长cDNA克隆。该cDNA克隆全长1 812 bp(GenBank登录号EF580101),开放阅读框长1 605 bp,编码535个氨基酸。该蛋白活性中心包括3个氨基酸残基（催化三联体）： Ser186, Glu319和His443, 3个N-联糖基化位点,具备羧酸酯酶的结构特征,属羧酸酯酶家族（EC: 3.1.1.-）。将该基因与pQE30载体重组,经IPTG诱导,spot-blot鉴定,蛋白获得了表达;以α-醋酸萘酯为底物,检测表达的羧酸酯酶活性为1.3 nmol/100 μL酶液。     

木薯果胶甲基酯酶抑制因子MePMEI1的生物信息学分析

为探讨木薯MePMEI1的分子结构特征。通过PCR扩增和测序技术及生物信息学分析工具对木薯MePMEI1基因进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果表明木薯MePMEI1基因编码区全长609 bp,编码202个氨基酸残基;MePMEI1基因编码蛋白分子量21.78 k D,理论等电点(pI)约为5.51;生物信息学预测发现,木薯MePMEI1蛋白是稳定的亲水蛋白;具有跨膜区为分泌蛋白;含有1个PMEI结构域,1个糖基化位点,31个磷酸化位点;二、三级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。该蛋白的生物功能可能与细胞被膜、酶和生长因子等相关。木薯MePMEI1基因的生物信息学分析为进一步研究其遗传特性和生理生化机制提供了理论依据。     

猪圆环病毒Ⅱ型SC株ORF3基因克隆及其编码蛋白的生物信息学分析

本研究根据GenBank登录的猪圆环病毒基因组序列(DQ180392.1)来设计引物,用PCR法扩增出PCV-2四川株(PCV-2SC)ORF3基因,并克隆到PMD19-T载体进行测序,同时利用在线生物信息学软件及数据库对ORF3基因及其编码蛋白进行生物信息学分析。研究结果表明,成功构建了命名为P-S-PCV-2SCORF3的重组质粒;测序结果得知PCV-2SCORF3基因全长315bp,共编码104个氨基酸;BLAST比对发现该基因与GenBank中国内外参考毒株核苷酸同源性在98%~100%之间。利用在线生物信息学软件对PCV-2SCORF3编码蛋白结构特征进行分析,发现该蛋白含有12个潜在的磷酸化位点,ORF3成熟蛋白有4个主要的抗原位点;亚细胞定位分析结果表明,编码蛋白主要存在于线粒体中和细胞核中并各占43.5%和34.8%,这证实了PCV-2SCORF3编码蛋白属于胞质蛋白,抗原区位集中于胞膜,有向胞核移动的趋势,功能强大,可能与细胞凋亡有关。疏水性分析发现,该编码蛋白具有一定的疏水性,与该蛋白的表面抗原决定族和膜蛋白中穿越膜的肽片段及该蛋白的高级结构的形成有关,预示其高疏水性区又与膜蛋白的跨膜区有着明显相关性。本研究成功进行了PCV-2SCORF3基因的克隆和生物信息学分析,为今后研究此基因的生物学功能以及研究该病毒疫苗的方法奠定理论基础。     

LL-37-haFGF融合蛋白的结构预测与生物信息学分析

目的:为开发一种多功能蛋白分子,该文采用生物信息学方法对LL-37-haFGF融合蛋白进行结构预测与分析.方法:重叠PCR技术克隆LL-37-haFGF基因,运用生物信息学软件分析LL-37-haFGF编码蛋白序列和结构.结果:LL-37-haFGF融合基因编码215个氨基酸,分子量为23.8 kDa,理论等电点为8.86,利于基因工程表达,结构分析表明其结构有利于多功能活性的保持.结论:融合基因的生物信息学分析与结构预测为研究其活性和作用机制奠定了基础.     

棉铃虫羧酸酯酶基因的克隆、序列分析及组织表达

为了从分子水平上研究棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner) 对杀虫剂抗性的产生机理,本文通过RT PCR和RACE方法首次从棉铃虫中肠中克隆了一个羧酸酯酶全长cDNA序列。序列分析表明,该基因包含一个1 794 bp的开放读码框,129 bp的5′UTR和139 bp的3′UTR区域。该基因编码597个氨基酸, 推测编码蛋白质的等电点pI为4.92,分子量为67.1 kD,GenBank登录号为EF547544。通过对氨基酸的同源性分析表明,该羧酸酯酶与斜纹夜蛾Spodoptera litura羧酸酯酶的同源性最高,达60%。半定量RT-PCR分析表明,该基因在中肠组织中表达量最高,在脂肪体和生殖腺中表达量较低,在头部则不表达。推测该羧酸酯酶基因可能主要参与棉铃虫对外源物质的解毒代谢。     

青少年牙周炎相关基因SEC14L5的生物信息学分析

用基因芯片技术来检测青少年牙周炎患者白细胞中表达异常的基因,检测中发现了一个未知基因表现为显著下调,其名称是SEC14L5,并推测该基因与白细胞的功能异常有着重要的作用。因此,利用生物信息学的方法对SEC14L5基因及其蛋白产物进行各种分析,在分析中我们发现SEC14L5编码的蛋白与SPF蛋白具有很大的相似性。     

山杏苹果酸酶基因的克隆与生物信息学分析

三羧酸转运体系(柠檬酸,苹果酸和丙酮酸)可为脂肪酸生物合成提供原料乙酰辅酶A与还原力NADPH;而苹果酸酶可催化苹果酸发生氧化脱羧而产生NADPH,是调控脂肪酸代谢的重要酶。山杏种子脂肪酸含量丰富、产油率高,是研究植物油脂代谢的良好材料。本研究以山杏为试材,采用RACE克隆和电子拼接相结合的方法,首次从山杏种子中克隆得到苹果酸酶基因(命名为SaME,GenBank上登记号为JX262381),该基因的cDNA编码区全长1923bp、编码640个氨基酸,预测其编码蛋白分子量为70.15kD、等电点为6.38;同时,运用生物信息学方法对SaME基因编码蛋白的理化特性、结构域和亚细胞定位等方面进行预测分析,结果显示,该蛋白定位在细胞的质体膜上,具有苹果酸酶活性,属于NADP-ME超家族。本文对山杏SaME基因的克隆与分析,为进一步探究苹果酸酶对油脂代谢的调控机制奠定了基础。     

恒河猴PPARgamma基因的生物信息学分析

恒河猴 Macaca mulatta是继黑猩猩Pan troglodytes 后第2个完成基因组测序的非人类灵长类动物,在生命科学领域中具有重要意义.本文利用生物信息学方法寻找与人类肥胖密切相关的 PPARg 基因在恒河候中的同源基因,对该基因的序列、外显子信息、编码蛋白及其理化性质进行分析,并预测其编码蛋白的结构与功能,构建其同源基因的系统进化树,旨在为今后人类肥胖的相关研究提供一定的依据.     

中华按蚊α-羧酸酯酶AsAe7的异源表达、纯化与结晶

【目的】羧酸酯酶(carboxylesterase,COE)是昆虫体内一类重要的解毒酶,与昆虫的抗药性相关。本研究旨在对中华按蚊Anopheles sinensis羧酸酯酶Ae7(Asae7)进行初步晶体学研究,为解析As Ae7的空间结构及探讨其分子功能奠定基础。【方法】首先对Asae7进行生物信息学分析,然后进行分子克隆,并利用原核表达系统在体外对Asae7进行重组表达;结合Ni-NTA金属螯合层析和葡聚糖凝胶层析方法纯化融合表达蛋白;通过葡聚糖凝胶层析和化学交联结果分析As Ae7的聚合状态;采用坐滴气相扩散法对As Ae7进行结晶筛选。【结果】生物信息学分析表明,As Ae7是亲水性蛋白,分子量为61.053 k D,无跨膜区和信号肽;3D结构预测结果分析显示,As Ae7采取的是α/β-水解酶超家族折叠模式。多序列比对结果表明,在不同昆虫中Ae7蛋白具有高度保守性。分子克隆得到中华按蚊As Ae7的编码基因Asae7序列,大小为1 626 bp。成功构建重组质粒p ET28aAsae7;在大肠杆菌Escherichia coli中表达的融合蛋白As Ae7主要分布在上清中。通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化出了高纯度且稳定的目的蛋白;通过凝胶过滤层析和化学交联获得纯化的As Ae7主要呈单体状态;同时通过晶体筛选获得了As Ae7的晶体。【结论】运用结晶学的方法初步获得了As Ae7的晶体,为后续解析As Ae7的晶体结构以及在原子分辨率水平上直观阐释As Ae7参与代谢抗性的分子机制奠定了基础。     

枯草芽胞杆菌BSD-2中ybfB基因敲除及生物信息学分析

在前期突变体库研究中发现,ybf B缺失的枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis BSD-2丧失了其抑真菌活性。本研究通过敲除并恢复BSD-2中ybf B基因,进一步确认其缺失对菌株生物活性的影响,并利用生物信息学手段对其基因序列和编码蛋白质序列进行了预测分析。本研究成功敲除BSD-2菌株的ybf B基因,构建突变株B-Y-k,并成功构建其回复突变株B-Y,平板对峙实验结果显示突变其ybf B基因该菌株失去其抗真菌活性,回复突变株抗真菌活性恢复,表明该基因与其抗真菌相关。生物信息学分析显示该基因全长1 251 bp,编码416个氨基酸,具有12个跨膜螺旋区,为疏水性蛋白,推测该蛋白为疏水性跨膜转运蛋白,可能参与活性物质的转运。     

东亚飞蝗羧酸酯酶基因的克隆和原核表达

羧酸酯酶是昆虫体内重要的代谢解毒酶系,其主要功能是水解和结合内源性和外源性含有酯键的有毒物质,减缓其到达靶标部位的时间。东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)是我国重要的农业害虫,对其羧酸酯酶基因克隆和表达有助于深入探索杀虫剂代谢毒理机制。本研究首先对羧酸酯酶基因(CarE4)进行了克隆,并将其插入到pCold TF DNA Vector中,在大肠杆菌中进行了原核表达,最后用疏水层析和离子交换层析方法对目的蛋白进行了纯化。本文成功建立了羧酸酯酶蛋白原核表达和纯化技术体系,为进一步研究东亚飞蝗羧酸酯酶的生理功能、结构特点和作用原理提供了基础资料。     

棉铃虫触角羧酸酯酶HaCXE6基因的克隆、序列分析与mRNA表达

为研究羧酸酯酶(carboxylesterase,COE)在棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)触角中的生理功能,采用RT-PCR、RACE方法从棉铃虫雄蛾触角中克隆得到一条COE基因全长序列(GenBank No.JX306730),命名为HaCXE6。HaCXE6基因读码框1 623 bp,编码540个氨基酸,预测蛋白质分子量61.02 ku,等电点8.06。氨基酸序列比对分析表明,HaCXE6与海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis触角羧酸酯酶CXE6一致性最高,为68%;棉铃虫不同功能羧酸酯酶聚类分析显示HaCXE6与气味降解酶CCE006a最相近。与其它昆虫触角羧酸酯酶多序列比对分析发现,HaCXE6具有酯酶活性必须的催化残基Ser199,Glu323,His434,也保持着α/β-酯酶家族的特征基序Gly-xSer-x-Gly。不同组织和发育时期该基因荧光定量PCR分析结果表明,HaCXE6在雌、雄蛾各个部位均有表达,雌蛾腹部与雄蛾足中表达量最高;卵至成虫各个时期均有表达,蛹中表达量最高。     

鱼腥藻PCC7120中琥珀酸半醛脱氢酶的初步表征及结构分析

蓝藻琥珀酸半醛脱氢酶催化琥珀酸半醛到琥珀酸的转化,使得蓝藻的三羧酸循环变得完整。BLAST序列分析预测鱼腥藻PCC7120中all3556基因编码琥珀酸半醛脱氢酶。为了证实all3556基因编码蛋白的催化功能,构建了p ET28a-all3556表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)菌体中进行重组蛋白诱导表达;利用镍亲和层析方法对all3556蛋白进行了分离纯化。酶动力学测试表明all3556蛋白是一个NADP+-依赖型的琥珀酸半醛脱氢酶。生物信息学分析发现all3556蛋白和其他来源的琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列具有一定的同源性,在催化中心的氨基酸残基高度保守。     

Cloning and prokaryotical expression of CarE gene in Locusta migratoria manilensis

羧酸酯酶是昆虫体内重要的代谢解毒酶系,其主要功能是水解和结合内源性和外源性含有酯键的有毒物质,减缓其到达靶标部位的时间.东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis (Meyen)是我国重要的农业害虫,对其羧酸酯酶基因克隆和表达有助于深入探索杀虫剂代谢毒理机制.本研究首先对羧酸酯酶基因(CarE4)进行了克隆,并将其插入到pCold TF DNA Vector中,在大肠杆菌中进行了原核表达,最后用疏水层析和离子交换层析方法对目的蛋白进行了纯化.本文成功建立了羧酸酯酶蛋白原核表达和纯化技术体系,为进一步研究东亚飞蝗羧酸酯酶的生理功能、结构特点和作用原理提供了基础资料.