牛型纯化蛋白衍生物皮内变态反应试验阳性牛中分枝杆菌的分离与鉴定

为评价牛分枝杆菌纯化蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)单纯颈部皮内变态反应试验(single intradermal cervical tuberculin,SICT)在奶牛结核病检测中的特异性,采集54头SICT阳性牛的118份组织样品进行病原分离和鉴定。结果显示,14头SICT阳性牛样品中分离到抗酸阳性菌,占SICT阳性牛总数的25.9%(14/54)。其中,10头阳性牛样品中分离到分枝杆菌,占18.5%(10/54);1头阳性牛样品中分离到牛分枝杆菌,占1.9%(1/54)。从118份组织样品中分离到16株抗酸阳性菌,其中12株为分枝杆菌,分枝杆菌分离率为10.2%(12/118)。12株分枝杆菌中,1株为牛分枝杆菌,其余11株为禽分枝杆菌、土地分枝杆菌等非结核分枝杆菌。牛分枝杆菌与非结核分枝杆菌分别占分枝杆菌分离株的8.3%(1/12)和91.7%(11/12)。病原分离和鉴定结果表明,SICT阳性牛的牛分枝杆菌分离率较低,为确保检测结果的准确性,有必要采用其他检测方法进行验证。同时,可将分枝杆菌快速分离培养及菌种鉴定检测技术引入对皮内变态反应试验阳性牛的实验室诊断,进一步提高牛结核病检测的特异性。     

犬种布鲁氏菌ZG株单克隆抗体4H3抗原模拟表位的筛选及分析

【背景】目前犬布鲁氏菌病诊断存在一定的困难。【目的】筛选并研究犬种布鲁氏菌单克隆抗体4H3株的特异性抗原表位。【方法】利用噬菌体肽库展示技术,以犬种布鲁氏菌单克隆抗体4H3株作为靶分子,包被酶标板,用12肽随机肽库经过3轮生物淘洗程序进行筛选。经过3轮筛选后,噬菌体产出率从5.00×10^-7增加到9.84×10^-6,假阳性率逐轮降低。从第3轮筛选的阳性克隆中随机挑取14个进行增殖,提取基因组DNA,进行测序分析;并通过iELISA和cELISA检测阳性克隆的亲和性和特异性。【结果】14株阳性单克隆噬菌体共出现3种不同的短肽序列,分别是KMSIRHPIRLPI、ILRRRRKRIIQI和QRIHMRLTTQS;iELISA结果表明3种短肽序列与单克隆抗体的亲和性依次为KMSIRHPIRLPI>ILRRRRKRIIQI>QRIHMRLTTQS;cELISA结果显示短肽KMSIRHPIRLPI和ILRRRRKRIIQI特异性较强。对亲和性较强、特异性较高的2条短肽KMSIRHPIRLPI和ILRRRRKRIIQI展开具体分析,比对分析表...     

16S和23S rDNA基因序列分析分类鉴定中国衣原体流行株

通过分析比较部分16S/23S rDNA序列,对现有保存的9株国内衣原体流行株进行了分子遗传学鉴定。虽然这些分离株分离自不同的动物,但它们的16S/23S扩增部分完全相同,经16S/23S rDNA序列同源性比较可以一致鉴定国内流行株为鹦鹉热嗜衣原体。     

犬种布鲁氏菌的遗传多样性分析

【背景】犬种布鲁氏菌是犬种布病的病原菌,主要导致犬流产和繁殖障碍。虽然犬种布鲁氏菌感染人群的病例极为少见,但是犬种布鲁氏菌对人的安全风险仍存在争议。目前,我国犬种布病的流行病学特征及犬种布鲁氏菌的遗传多样性的研究相对缺乏。开展犬种布病的流行特征及遗传多样性调查对加强犬种布病的监测防控具有重要意义。【目的】对犬种布病的流行病学特征和犬种布鲁氏菌的遗传多态性进行调查,为犬种布病的防控提供参考。【方法】采用常规鉴定方法和BCSS-PCR对63株试验菌株进行鉴定。采用HGDI (Hunter and Gaston diversity index)多态性指数调查犬种布鲁氏菌的遗传多态性,用MLVA方法基于BioNumerics5.0软件对菌株进行聚类分析,揭示犬种布病的流行病学特点。此外,基于MLVA-11采用goeBURST软件构建犬种布鲁氏菌的最小生成树(Minimum spanning tree,MST),阐述我国犬种布鲁氏菌的地理起源特征。【结果】常规鉴定方法和BCSS-PCR扩增结果显示63株试验菌株全部为犬种布鲁氏菌。BCSS-PCR与常规鉴定方法的符合率为100%,BCSS-PCR的分析敏感性为10-3 (即50 pg/μL犬种布鲁氏菌DNA)。我国犬种布鲁氏菌具有较高的遗传多样性,基于HGDI分析表明Panel 2B的5个位点具有较高的变异度,等位基因型由高到底依次为bruce09(11) bruce07(8)bruce16(7)bruce04(6)bruce30(5)。MLVA聚类分析表明北京地区出现了3次较小规模的犬种布病暴发流行,其余地区均为零星散发。我国犬种布鲁氏菌可分为5个地理集群,以MLVA-11基因26型克隆群为主导种群,该种群与来自美国、希腊、加拿大、法国、罗马尼亚和韩国等国家的菌株具有共同的地理起源,其余4个种群为中国特有。【结论】我国犬种布鲁氏菌呈现高度的遗传多样性并有广泛的地理来源,表现为输入性和中国特有血统共存的起源进化特征。     

哈尔滨地区发热患者风疹病毒的分离鉴定

目的 为了明确哈尔滨地区风疹病毒（Rubella virus,RV）的流行情况,对2003年上半年采集的部分发热患者血清及血细胞进行筛选、鉴定、比较,进行血清学和病原学研究。同时从风疹病毒IgM抗体阳性患者血中分离病毒,对疑似风疹病毒的分离株进行鉴定。方法 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对159例发热患者血清中的风疹病毒IgM进行测定;采用BHK21细胞培养法对风疹病毒IgM抗体阳性患者血标本进行风疹病毒分离,并用RT—PCR、细胞生长曲线、电镜观察、免疫组化等方法对可疑风疹病毒株进行鉴定。结果 风疹病毒IgM抗体阳性为22例,占13．83％;经RT—PCR、细胞生长曲线、电镜观察、免疫组化等方法初步鉴定从血液标本中获得的病毒分离株是风疹病毒。结论 采用FTISA决对该地区159例发热患者血清风疹病毒IgM进行检测,阳性率为13．83％;获得了1株风疹病毒分离株。     

柯萨奇病毒A16型的B1a和B1b两个分支在内蒙古自治区共同流行

研究2010年引起内蒙古自治区手足口病流行的柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CVA16)的分子流行病学特征。采集内蒙古自治区12个盟市门诊就诊的888名手足口病患者粪便和咽拭子标本共921份,进行病毒分离,然后利用实时荧光PCR对阳性分离物进行CVA16的鉴定。从临床症状分别为普通型、重型和死亡病例的临床标本中分离的CVA16中随机选取50株代表株进行VP1编码区扩增及核苷酸序列测定和分析,与其他各基因型和基因亚型的CVA16构建亲缘进化关系树。921份标本共分离出82株CVA16,分离率为8.90%,其中从重症病例分离出3株CVA16,从死亡病例中分离出1株CVA16。50株内蒙古CVA16代表株在核苷酸水平上与1998年以来中国大陆CVA16分离株的同源性都较高,尤其与2009年北京株和2010年河南株的同源性最高,分别为96.18%～98.88%和94.94%～98.76%;但与2007年内蒙古流行株存在一定的差异,同源性仅为91.68%～96.52%;亲缘进化关系树显示,所有内蒙古CVA16株都属于B1基因型的两大进化分支B1a和B1b,并处于不同的簇中,它们之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为89.99%～100%和98.31%～100%,表现为CVA16分离株属于多个病毒传播链。2010年从内蒙古自治区不同临床症状手足口病病例分离的CVA16流行株属于B1基因型的两大进化分支B1a和B1b,两个进化分支的CVA16在内蒙古自治区共同进化和流行。     

细菌学方法和HOOF-Prints技术在绵羊种布鲁氏菌019株鉴定中的比较研究

应用细菌学常规方法和分子生物学检测方法对绵羊种布鲁氏菌非典型株019进行分类研究。利用高变8聚核苷酸DNA指纹技术(HOOF-Prints)对绵羊种布鲁氏菌019株可变数目重复片段(VNTR)的8个位点进行PCR扩增和序列测定,将测定结果与GenBank数据库比较分析,应用DNAMAN进行同源性分析,并构建系统进化树。结果表明,绵羊种布鲁氏菌019株和绵羊种布鲁氏菌参考株63/290的亲缘关系高于绵羊种布鲁氏菌019株与其他参考株的亲缘关系,该结论与细菌学常规鉴定结果一致。应用HOOF-Prints技术可以对绵羊种布鲁氏菌非典型株019进行鉴定,该技术有望弥补传统分类方法的不足。     

嗜肺巴斯德杆菌基因分型及在分子流行病学中的意义

目的　探讨我国部分地区嗜肺巴斯德杆菌分子流行病学特征。方法　随机多态扩增PCR(RAPD -PCR) ,两条单一随机引物S1和S3 ,对分离来自北京和南京不同实验动物饲养单位的大鼠、小鼠、野鼠的 1 5株嗜肺巴斯德杆菌及参考株共 1 6株菌基因组随机扩增 ,比较DNA多态性图谱。结果　 1 5个流行株可分成 4种基因型 :来自相同饲养单位的小鼠株、大鼠株及野鼠株基因型亦不相同 ;野鼠株与部分小鼠分离株基因型相同。结论　同一地区嗜肺巴斯德杆菌流行株呈明显的多态性 ;野鼠有可能成为实验动物嗜肺巴斯德杆菌的传染源     

中国小型猪空肠弯曲菌的首次分离及其鉴定

目的对中国小型猪空肠弯曲菌进行分离鉴定。方法采集发病小型猪标本,采用细菌学分离培养、生化鉴定、药敏试验、血清学试验、PCR检测等方法进行鉴定,并对细菌的分子生物学特征进行分析。结果分离到1株细菌,经鉴定为空肠弯曲菌（CJp0812）。用空肠弯曲菌flaA基因特异引物对CJp0812细菌的PCR扩增为阳性,经核苷酸序列测定分析证实上述序列与空肠弯曲菌NCTC11168基因序列（GenBank登录号：NC002163）同源性高达99%。结论首次从中国小型猪中分离到了空肠弯曲菌,为进一步研究该菌及开展流行病学调查提供了科学依据。     

2013年遵义县一起布鲁氏菌疫情调查分析

布鲁氏菌病(以下简称布病)是一种以布氏菌属细菌为病原体的人兽共患病,牛、羊、猪等均可成为主要感染源,接触感染、空气传播是主要传染途径,属国家规定的乙类传染病[1]。布鲁氏菌病误诊率较高,致使该病易迁延不愈,并转为慢性,严重影响患者的健康与生命质量。遵义市疾控中心于2013年1月接汇川区疾控中心报告:遵义医学院附属医院儿科收治1例布鲁氏菌病,随后我中心赶赴现场开展流行病学调查,所获资料与数据如下,旨在为读者提供借鉴经验。     

mecA基因PCR扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的 应用mecA基因PCR扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus,MRSA）。方法 临床分离的70株金黄色葡萄球菌,应用mecA基因PCR扩增法鉴定MRSA,并与苯唑西林纸片扩散法进行比较。结果 70株金黄色葡萄球菌用PCR扩增法和纸片扩散法有6株鉴定有差异,4株。mecA基因阳性而纸片扩散法鉴定为敏感,1株mecA基因阳性纸片扩散法鉴定为临界耐药,1株mecA基因阴性却表现为苯唑西林耐药,2种方法符合率为91．43％。结论 mecA基因PCR扩增法可以准确、快速判定MRSA,特别是对隐匿型或低水平耐药菌株的检出有重要的价值。     

牛布鲁氏菌A19突变株的构建及在BALB/c鼠中的免疫保护评估北大核心CSCD

【目的】构建牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株并免疫BALB/c鼠,初步评估了其免疫保护效果。【方法】应用PCR方法扩增A19疫苗株VirB12基因的上下游同源臂序列,构建重组质粒pBK-CMV-SacBVirB12,将该质粒电击转化至布鲁氏菌A19感受态细胞中,筛选得到布鲁氏菌疫苗株A19的VirB12基因缺失株。以A19疫苗株为参照,应用A19-ΔVirB12疫苗接种BALB/c小鼠,免疫45d后布鲁氏菌2308强毒株攻毒,攻毒15d后取BALB/c鼠的脾脏进行克脾指数测定和病理组织学检测。Western-blotting鉴定VirB12蛋白的免疫反应性。【结果】构建了牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株,小鼠免疫攻毒后15d,A19-ΔVirB12免疫组和A19免疫组的克脾指数与对照组之间有显著性差异(P<0.05)。A19免疫组与A19-ΔVirB12免疫组之间克脾指数差异不显著(P>0.05)。Western blotting实验表明VirB12蛋白具有免疫反应性。【结论】牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株与亲本株A19免疫保护性无明显差异,通过血清学方法可区分疫苗免疫与野生型牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)感染动物,具备作为标记疫苗的潜力。     

中国猪种布鲁氏菌分子流行病学特征分析

【目的】调查猪种布鲁氏菌的基因多态性和分子流行病学特征。【方法】用经典分型方法对菌株的生物型进行鉴定,分析菌株的地理分布特点;用MLVA-16分型方法对60株猪种布鲁氏菌进行基因分型,采用在线软件评估分型方法的分辨率和位点的多态性,用BioNumerics 5.0软件进行聚类分析。【结果】我国流行的猪种布鲁氏菌主要是猪种生物1型(33株)、2型(3株)和3型菌(24株);分布范围较广,包括广东、广西、内蒙古、北京、吉林、宁夏和西藏等地。MLVA-16分型方法对猪种布鲁氏菌具有极高的分辨力,多态性指数为0.992;Panel1、MLVA-11和Panel 2B均具有较高的分辨率,多态性指数分别为0.884、0.916和0.979。60株猪种布鲁氏菌聚为6大类52个基因型,5个共享基因型(GT24,GT25,GT26,GT28,GT29)包括13株布鲁氏菌,各基因型菌株间有潜在的流行病学关联,可能是分别来自相同传染源的暴发流行;另47株布鲁氏菌呈现独特的基因型,表明菌株来自无流行病学关联的零星散发病例。猪种布鲁氏菌的最小生成树表明我国菌株分别与美国、法国和波兰的菌株有完全相同的MLVA-15基因型。【结论】中国猪种布鲁氏菌有较高的遗传多态性,并与美国、法国和阿根廷的菌株有较高的遗传相似性。我国猪种布病以零星散发为主。     

2013–2017年我国流产奶牛群布鲁氏菌病流行病学趋势与特点

【背景】布鲁氏菌病(布病)是一种由布鲁氏菌引起的严重危害世界很多国家养殖业的人畜共患病。近年来,布病在我国出现反弹趋势,给养殖业发展和公共卫生安全带来严重挑战。由于我国牛羊养殖数量庞大且相对分散等多方面原因,对于动物布病的相关发病数据缺乏完整性和系统性。【目的】了解我国奶牛布病的流行状况,为制定布病防控措施及策略提供数据支持。【方法】根据过去5年(2013?2017)国家动物布病参考实验室的监测数据,深入分析我国奶牛布病发病趋势和流行特点。【结果】2013?2017年,从有流产症状的布病非免疫牛场采集了血清样本23 381份,其中布鲁氏菌血清抗体阳性占44.2%,2015年奶牛布病疫情最为严重,个体阳性率和群体阳性率分别为55.3%和93.5%。一类布病疫区5个省市的流产畜群间布病阳性率介于13.8%?57.8%,二类布病疫区4个省的流产畜群间布病阳性率在54.4%?86.9%之间。在这5年间,人间、流产畜群间布病发病趋势呈高度相关(r=0.806>0)。【结论】流产奶牛群体中,布病发生率处于高流行水平,且与人间布病流行趋势高度吻合;另外,二类布病疫区布病疫情严重。这些重要的信息,有助于全面掌握布病流行情况,提示进行人病兽防的重要性,为制定适合国情的布病防控战略提供技术依据。针对上述研究结果,建议对全国动物布病展开全面监测,做好动物布病预防、准确诊断以及牧场净化等工作。     

登革病毒流行株的分离鉴定及其毒力位点变异研究

目的:从登革热患者血清中分离登革病毒,鉴定流行株的血清型及其毒力。对其中两分离株E基因进行序列测定,分析其可能的毒力位点变异。方法:采集临床诊断为登革热患者急性期血清91份,接种于C6/36细胞分离病毒,应用间接免疫荧光法鉴定及分型。并通过乳鼠脑内接种和空斑试验,测定分离株的毒力。扩增2株分离株E基因,克隆到pGEM-T载体进行序列测定,分析变异位点。结果:在91份血清中经2~3次传代分离出8株病毒,鉴定为登革1型病毒。在E蛋白影响毒力的3个区段中,两分离株有3处存在变异。结论:推测此次广州地区流行登革热可能由DEN 1型病毒感染引起,流行株的毒力较弱。毒力减弱可能和其基因位点变异有关。     

2018年北京市西城区呼吸道腺病毒感染疫情流行病学和病原学特征分析

2018年5～9月,北京市西城区五所小学先后共报告了5起呼吸道感染集中发热疫情。为了解报告的5起疫情的流行病学和病原学特征,开展了现场调查,并采集病例咽拭子标本,使用荧光定量PCR方法检测17种常见呼吸道病毒进行病原学筛查,对鉴定为人腺病毒(Human adenovirus,HAdV)阳性的标本进行病毒分离,并分别扩增六邻体蛋白基因Loop2区域以及三个衣壳蛋白(五邻体基座蛋白、六邻体蛋白和纤维蛋白)基因全长,进行HAdV型别的初筛和确认,同时与GenBank数据库中国内外HAdV-3流行株序列进行比对分析。结果显示,5起集中发热疫情的致病原均为HAdV-3。进一步研究发现,全球流行HAdV-3可划分为Clade1和Clade2两个进化分支,2004年至今我国流行的HAdV-3病毒株均属于Clade2进化分支,也是近年全球优势流行株。两个进化分支HAdV-3病毒株在三个基因序列上均高度保守。本研究为我国呼吸道HAdV防控,以及HAdV-3型疫苗研发提供了基础科学数据。     

四川省鸭坦布苏病毒的分离鉴定及遗传进化分析

本研究从四川省什邡市某发病养鸭场采集到疑似鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）感染的病料,将病料组织研磨,无菌处理后接种鸭胚连续传代培养,分离获得一株病毒,并通过PCR鉴定以及电镜形态观察,确定该分离株为黄病毒属坦布苏病毒,命名为SCS01。将SCS01株全基因组进行PCR分段扩增测序发现,SCS01株全基因组全长为10 992bp。在线BLAST比对检索,结果显示,SCS01株全基因组与国内鸭源坦布苏分离株同源性最高可达97.94%,进化树分析显示,SCS01株属于中国流行I群毒株,与多数分离自北方地区的中国II群毒株相比,具有较为明显的地方特性。分离株与所有参考毒株的E基因核苷酸和氨基酸相似性均在90%以上,其中与重庆分离株CQW1的相似性最高。这一鸭源坦布苏病毒的分离及其全基因组的测定为进一步探究坦布苏病毒的地区流行提供了材料。     

牛乳头瘤病毒基因2型贵州GZ01流行株全基因组序列测定及其特征分析

为从分子水平了解牛乳头瘤病毒(bovine papillomavirus,BPV)贵州镇宁GZ01流行株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况,本研究选取贵州镇宁患病牛皮肤肿瘤样物,以乳头瘤病毒L1基因的简并引物MY11/MY09进行PCR扩增,测序后并确定其基因型。根据Gen Bank中BPV参考株设计6对特异性引物,经扩增、测序和拼接后获得BPV流行株全基因组序列。结果序列分析表明,GZ01流行株全基因组长为7 944 bp,具有BPV2基因型的结构特征,与Gen Bank收录的牛乳头状瘤病毒2型基因型参考株BPV2、BPV2-SW01和BPV2-AKS01的核苷酸同源性高达98.8%、99.7%和99.4%,同时与BPV13、BPV1和BPV14的基因型参考株进化关系也比较最近,同属Dalte属。因此,贵州镇宁GZ01株为BPV2基因型,GZ01株为贵州地区首次检测确认并测定了全基因组序列的牛乳头瘤病毒。本研究为贵州地区的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律、遗传变异以及科学的防控提供了理论依据。     

全耐药鲍曼不动杆菌分子分型和分子流行病学调查

重复片段引物PCR和随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对临床分离全耐药不动杆菌分子分型,并进行流行病学调查.从ICU病房感染多重耐药不动杆菌患者的标本分离不动杆菌,碱裂解法提取全基因组,重复片段引物PCR(Rep-PCR)和随机引物扩增(RAPD),对8株临床分离的全耐药菌基因分型,并与生物学分型和质粒分型比较,调查医院流行全耐药菌的基因型.结果显示,8株分离菌经两对重复片段引物分型可分为6种和4种基因型,经随机引物分型为4种和3种基因型,经质粒分型可分为2种基因型,生物学分型归属为1种表型.PCR方法用于全耐药不动杆菌分子分型简便易行,重复性好,适合医院感染流行病学调查,本医院同一部门出现多种基因型,各科室间不存在交叉传染.     

腹泻犬中细小病毒携带情况以及VP2基因进化分析

为了解四川省部分地区腹泻犬中细小病毒的感染情况以及VP2基因的遗传变异情况。从四川省部分地区收集了50例疑似CPV感染的腹泻犬粪便,对标本采用PCR扩增VP2,并对VP2基因全序列进行测序分析。PCR检测阳性标本19份。序列分析显示,15份扩增出VP2基因全序列标本均为CPV-2a型,聚类分析显示全部序列聚类在同一分支,本次研究的四川省部分地区流行的CPV均为CPV-2a型。可推测目前四川省部分地区所常见的CPV流行株依然以CPV-2a型为主。本次试验所扩增的15份CPV阳性标本与国内外传统毒株有着极高的同源性,提示目前四川省部分地区CPV还未出现重大的变异情况。