锦鲤Δ6脂肪酸去饱和酶基因克隆及表达研究

旨在揭示变温鱼类合成HUFAs过程中的关键酶及其功能,以锦鲤(Cyprinus carpiokoi)为材料,通过RT-PCR扩增获得了一段长度为854 bp的Δ6脂肪酸去饱和酶基因的c DNA序列片段,并对其进行了序列分析和蛋白产物结构预测。结果显示,该片段与南亚野鲮(Labeo rohita)Δ6脂肪酸去饱和酶基因有93.5%的同源性,编码的蛋白产物具有典型的Δ6脂肪酸去饱和酶结构特点,包含2个组氨酸保守区(HDFGH、HFQHH)和2个跨膜结构域。荧光定量PCR表明,Δ6脂肪酸去饱和酶在锦鲤肝脏中的表达量最高,在肠、脑和心脏中表达量依次降低,而在肌肉和鳃的表达量相对较低。幼鱼在不同培养水温下,各组织中该基因的表达量均随温度的下降而升高,以适应低温环境。     

中华绒螯蟹胰脂酶基因克隆及表达分析

采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)胰脂酶基因(pancreatic lipase, PL)的cDNA序列全长。该序列全长1 970 bp,开放阅读框长度为1 374 bp,编码457个氨基酸,5'和3'非编码区(UTR)长度分别为372 bp和224 bp。理化分析表明其预测分子量为51.066 kD,理论等电点为4.65。其序列中检测到脂肪酶典型的催化三联体结构、"盖子"结构以及"亲核弯"结构。蛋白同源性和进化树分析表明,中华绒螯蟹胰脂酶和其他物种同源性较高(50%左右),且和甲壳动物聚为一支而与脊椎动物相聚较远。组织表达模式分析表明,EsPL基因主要在肝胰腺、肠道、胸神经节表达较高;幼体发育阶段表达模式分析表明,EsPL基因在溞状幼体Ⅰ~Ⅲ期表达量逐渐递增,Ⅳ期显著下降,Ⅴ期较Ⅳ又显著增加,大眼幼体阶段表达最低;同一脂肪水平下,相比于含高不饱和脂肪酸的鱼油而言,植物油如豆油和亚麻油的添加均会增加胰脂酶基因的表达,且亚麻油鱼油混合油组促进效果最显著。上述结果表明饵料脂类显著影响中华绒螯蟹胰脂酶,从而为提高中华绒螯蟹对饵料脂类利用率提供了研究依据。     

锦鲤Δ6脂肪酸去饱和酶基因克隆及表达研究北大核心CSCD

旨在揭示变温鱼类合成HUFAs过程中的关键酶及其功能,以锦鲤(Cyprinus carpiokoi)为材料,通过RT-PCR扩增获得了一段长度为854 bp的Δ6脂肪酸去饱和酶基因的c DNA序列片段,并对其进行了序列分析和蛋白产物结构预测。结果显示,该片段与南亚野鲮(Labeo rohita)Δ6脂肪酸去饱和酶基因有93.5%的同源性,编码的蛋白产物具有典型的Δ6脂肪酸去饱和酶结构特点,包含2个组氨酸保守区(HDFGH、HFQHH)和2个跨膜结构域。荧光定量PCR表明,Δ6脂肪酸去饱和酶在锦鲤肝脏中的表达量最高,在肠、脑和心脏中表达量依次降低,而在肌肉和鳃的表达量相对较低。幼鱼在不同培养水温下,各组织中该基因的表达量均随温度的下降而升高,以适应低温环境。     

中华绒螯蟹水通道蛋白11基因克隆及表达分析

为研究水通道蛋白11基因(AQP11)在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)生长蜕壳过程中的功能作用,采用RACE技术克隆获得中华绒螯蟹水通道蛋白11基因cDNA全长序列.该序列总长为1 746bp,5'端和3'端非编码区分别为463 bp和476 bp,开放阅读框为807 bp,推测编码268个氨基酸,预测分子量29.46 kDa,理论等电点为5.38.生物学信息分析表明,AQP11含有4个跨膜区(第62～84,第159～181,第194～216,第231～250)和2个NPV单元,属于稳定蛋白;同源性和进化树分析表明,中华绒螯蟹AQP11氨基酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的同源性最高(82.0％),与凡纳滨对虾的聚为一支,与甲壳动物的亲缘关系最近.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的检测显示,AQP11基因在中华绒螯蟹各组织中均有表达,其中在肠道中表达量最高,其次是脑、肌肉和胸神经节,在肝胰腺、鳃和血中表达量最低.研究发现,AQP11基因在中华绒螯蟹肠道中的表达呈现,在蜕壳间期(C期)和蜕壳前期(D期)过程中表达量均较低,在蜕壳期(E期)表达量开始上升,蜕壳后期(AB期)表达量不变.AQP11基因在肌肉中的表达呈现,蜕壳间期(C期)表达量低,蜕壳前期(D期)表达量开始上升,蜕壳期(E期)达到峰值,随后到蜕壳后期(AB期)下降.研究结果表明,中华绒螯蟹AQP11基因在其蜕壳过程中发挥着重要的作用.     

中华绒螯蟹的幼体生态

中华绒螫蟹(Eriocheir sinensis)又名毛蟹,河蟹,清水蟹。在淡水中生活成长,但在秋冬之际,成熟的毛蟹都要到河口附近的浅海进行交配繁殖,待长成幼蟹时再溯江河而上,进入淡水生长。为能大量地人工培育蟹苗,我们于1976—1978年对毛蟹幼体的生态进行了实验和观察。     

中华绒螯蟹人工授精的突破

Schcank等(1967)曾报道用电刺激法采取马蹄蟹(Limulus polyphemus)的精荚和卵子,并声称由此获得的精、卵可以互相授精,但未见更详细的说明和证明授精的根据2。有关中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的人工授精,迄今未见任何报道。       

中华绒螯蟹染色体的研究

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis H.Milne Edwards)属甲壳纲(Crustacea)、软甲亚纲(Malacostraca)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae),俗称河蟹,是我国重要的经济蟹类,其形态解剖、生态习性及生理等方面的研究已有报道(Panning,1939;Koch,1952;堵南山,1954,1957,1958;Bauchau,1960;Leersnyder,1966,1967;Dbainaut et al.,1976;Chevigue,1976;Leeranyder et al.,1977,1978;Pequenx et al.,1982;Chapelle et al.,1982;谈奇坤等,1984.),但至今未见有关细胞遗传学方     

中华绒螯蟹同工酶的研究

中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)(Milne,Edwards)俗称河蟹,是我国重要的经济蟹类,有关河蟹同工酶的研究迄今为止国内外尚无报道,为了弥补这一空白,作者对中华绒鳌蟹的醋酶(EST)、谷氨酸草酞乙酸转氨酶(GOT)、苹果酸脱氢酶(MDH)三种同工酶进行了电泳分析,研究了同工酶的组织特异性并探讨其基因表达特点,以期为中华绒鳌蟹的种群遗传结构分析,品种的定向选育等提供生物化学指标.       

中华绒螯蟹胚胎附着系统的结构和形成机制

利用透射电镜和扫描电镜技术研究了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)胚胎附着系统的结构及形成机制。中华绒螯蟹受精卵附着在雌性腹肢内肢的携卵刚毛上。该附着系统由三个连续部分组成:卵膜、卵柄和被膜,后者覆盖在携卵刚毛的绒毛上。研究结果显示:中华绒螯蟹的成熟胚胎由三层明显的卵膜组成,即E1、E2和E3层,但胚胎附着系统的卵柄及被膜仅为外层(E1)。卵巢中成熟卵的卵膜仅由E1层组成,E1分为两个亚层(E1a′、E1b′)。胚胎附着系统的形成与雌蟹的行为、腹肢粘液腺分泌的粘液、卵膜的超微结构及各层的变化有关。受精卵刚从生殖孔中排出时,卵膜(E1a′、E1b′)并不能直接粘附在携卵绒毛上。产卵后不久,雌蟹腹肢粘液腺分泌粘液的量增多,E1a′、E1b′的结构发生变化,表现为边界模糊,卵膜出现很强的粘性。在产卵后约60min E1层又明显分为两个亚层(E1a、E1b),同时排卵后雌蟹腹部的携卵绒毛不断地运动,这种运动促使携卵绒毛外的被膜形成。随着E1层亚结构的变化,E2层也开始形成,当E1新的两个亚层出现时,部分区域的E1层与E2层发生分离,卵柄开始形成,并牢固地附着在携卵绒毛上。被膜、卵柄与卵膜最外层的结构相同,均由E1层构成[动物学报51(5):852-861,2005]。     

中华绒螯蟹幼蟹对亮氨酸和异亮氨酸的需要量

以初始体重为(0.900.02) g的中华绒螯蟹幼蟹为试验对象, 采用酪蛋白、明胶、进口鱼粉和晶体氨基酸为蛋白源, 配制成12组试验饲料, 研究中华绒螯蟹幼蟹对亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)的需要量。饲料中Leu水平为0.87%、1.26%、1.64%、2.03%、2.39%和2.81% (分别记为Leu-1Leu-6组), Ile水平为0.69%、1.21%、1.70%、2.19%、2.70%和3.21% (分别记为Ile-1Ile-6组)。试验周期为60d。结果表明: (1)饲料中Leu含量为2.39%时, 幼蟹特定生长率和全蟹粗蛋白含量达到最大值, 而各组之间的成活率和全蟹水分、粗脂肪以及灰分无显著差异(P 0.05)。当饲料Leu含量大于2.39%时, 河蟹肌肉Leu含量、肌肉必需氨基酸总量和肌肉氨基酸总量均显著高于其他各试验组(P 0.05)。(2)饲料中Ile含量为2.19%时, 幼蟹特定生长率和全蟹粗蛋白含量达到最大值, 而各试验组之间的成活率和全蟹水分、粗脂肪以及灰分差异不显著(P 0.05)。河蟹肌肉Ile含量、必需氨基酸总量和氨基酸总量随饲料中Ile含量增加呈先升高后降低的趋势, 最大值均出现在Ile-5组(2.70% Ile), 但Ile-4组(2.19% Ile)与Ile-5组差异不显著(P 0.05)。根据特定生长率与饲料Leu或Ile水平的折线模型, 确定中华绒螯蟹幼蟹饲料亮氨酸和异亮氨酸的适宜需要量分别为饲料干物质的2.36%和2.25%, 即饲料蛋白的5.88%和5.72%。       

中华绒螯蟹卵黄形成的研究

中华绒螯蟹的卵黄形成也受各种相关内分泌激素的调控,卵黄的来源虽然是双重的,一方面在蟹卵内由内质网和高尔基体生产卵黄原,然后卵黄原再融合成为卵黄体。另一方面,蟹卵以胞吞方式直接从血淋巴中接纳卵黄原,同时又通过指状小道由卵泡细胞间接接纳卵黄原。肝胰腺可能会产生卵黄原,这些卵黄原随即进入血淋巴内,再直接或间接被蟹卵接纳。     

中华绒螯蟹亲蟹的饥饿代谢研究

1998年 10～ 12月 ,对体重为 5 4 .5 9(± 2 .37) g的亲蟹在 2 0 (± 0 .5 )℃温度条件下进行饥饿实验 ,研究了饥饿对中华绒螯蟹亲蟹代谢的影响 .结果表明 ,经过 30d的饥饿处理 ,亲蟹的耗氧率降低为摄食状态的 5 0 .0 % ;CO2 排出率减小为摄食状态的 6 3.4 % ;NH3 N排泄率减小为 5 9.1% .耗氧率和CO2 排出率、NH3 N排泄率的变化差别较大 ,耗氧率的减小可分为 4个阶段 ,而CO2 排出率和NH3 N排泄率的减小仅可分 3个阶段 .与此同时 ,亲蟹的标准代谢水平同样受到饥饿的影响 ,饥饿 30d后 ,由 4 .4 5J·g-1·h-1减小为 2 .36J·g-1·h-1;在饥饿亲蟹的代谢中 ,脂肪消耗最多 ,其次是碳水化合物 .     

中华绒螯蟹幼蟹标准代谢的研究

对中华绒螯蟹幼蟹的耗氧率、CO2 排出率及NH3-N排泄率进行了测定 ,并研究了幼蟹的能耗率及能源物质的供能比。结果表明 ,体重 ( 2 70± 1 4 0 )g的幼蟹 ,在水温 ( 2 0± 0 5 )℃时 ,耗氧率、CO2 排出率和NH3-N排泄率分别为 ( 0 4 14± 0 0 91)mg·g-1·h-1、( 0 4 76± 0 12 5 )mg·g-1·h-1和 ( 4 179± 1 171) μg·g-1·h-1;标准代谢的蛋白质、碳水化合物和脂肪提供的能量比为 7 3∶3 8 8∶5 3 9。其耗氧率 (R0 )受水中溶氧水平的影响 ,并与体重(W )呈负相关 (R0 =0 84 0 3W-0 72 6 5)。     

不同脂肪酸对中华绒螯蟹肝胰腺组织三种FABP表达的影响

本试验旨在研究不同脂肪酸水平对中华绒螯蟹肝胰腺中脂肪酸结合蛋白FABP3、FABP9和FABP10表达量的影响。取中华绒螯蟹肝胰腺组织进行体外培养,在液体培养基中分别加入50μmol/L、100μmol/L和250μmol/L 3种浓度的棕榈酸(PA),油酸(OA),亚油酸(LA),花生四烯酸(ARA),DHA和EPA 6种脂肪酸。分别在离体培养24 h后,运用Real-time PCR技术,研究组织内FABP3、FABP9和FABP10在不同种脂肪酸作用下的表达变化。研究表明,在培养基中加入100μmol/L、250μmol/L ARA后,FABP3的表达量显著性下调;而加入100μmol/L、250μmol/L亚油酸体外培养24 h后,FABP3的表达量显著性上调;在培养基中加入50μmol/L、100μmol/L、250μmol/LDHA、EPA、ARA和亚油酸体外培养24h后,都促进了FABP9基因的表达;在100μmol/L、250μmol/L亚油酸和ARA条件下,FABP10表达量发生显著性变化。FABP3、FABP9和FABP10的表达水平对脂肪酸的种类和浓度的不同反应,可能与实验动物所处的生理时期及对脂肪酸的需求有关。     

中华绒螯蟹遗传变异的RAPD分析

用31个可重复性好的随机引物对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的辽河、瓯江和长江种群进行了RAPD分析。121个扩增片段中有27个多态片段。遗传距离指数（D）表明中华绒螯蟹种内遗传变异较低(D=0.004～0.063)。3个种群中,辽河种群(D=0.018)和瓯江种群(D=0.025)遗传变异较高,而长江种群遗传变异较低(D=0.013);辽河种群和瓯江种群间遗传距离(D=0.023)小于它们与长江种群间的遗传距离(D值分别为0.028和0.032)。提示人类经济活动可能已使这2个种群发生了基因交流。     

中华绒螯蟹卵巢RACB cDNA文库的构建

应用抑制性差减杂交技术,已经获得了中华绒螯蟹卵巢发育过程中差异表达基因的部分cDNA序列。为了进一步获得基因的全长cDNA序列,运用SMART技术,成功构建了中华绒螯蟹卵巢(Ⅲ期)RACE cDNA文库。琼脂糖凝胶电泳结果表明,文库所含全长cDNA的长度主要集中在500—2000bP之间,RACE PCR结果表明,所用基因特异性引物与接头引物皆能扩增出产物,说明所构文库的质量较好,适于用RACE方法从中分离中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的全长cDNA。     

中华绒螯蟹窦腺的显微和超微结构

借助光学和电子显微镜观察了养殖河蟹 1龄蟹种、早熟蟹种和 2龄成蟹窦腺的形态结构和神经分泌物质释放方式。河蟹窦腺位于眼柄视神经节内髓与终髓交界处背侧 ,活体为乳白色 ,扁球状 ,大小约为 0 5 5mm×0 45mm× 0 2 3mm。窦腺呈囊状 ,腺体壁由膨大的神经分泌细胞末梢和胶质细胞组成 ,神经末梢内充满电子致密的分泌颗粒。根据颗粒的大小、形态和电子致密度等特征 ,区分出 6种不同类型的神经分泌末梢。河蟹窦腺中的神经分泌物质以胞吐作用方式释放 ,一些现象表明 ,神经胶质细胞参与神经分泌颗粒的释放。 1龄蟹种、早熟蟹种和 2龄成蟹窦腺的形态、结构无明显差异 ,但神经激素颗粒释放情况明显不同 ,从形态结构上证实了窦腺对养殖河蟹性腺发育的调控作用。     

中华绒螯蟹卵巢RACE Cdna文库的构建

应用抑制性差减杂交技术 ,已经获得了中华绒螯蟹卵巢发育过程中差异表达基因的部分cDNA序列。为了进一步获得基因的全长cDNA序列 ,运用SMART技术 ,成功构建了中华绒螯蟹卵巢 (Ⅲ期 )RACEcDNA文库。琼脂糖凝胶电泳结果表明 ,文库所含全长cDNA的长度主要集中在 5 0 0～ 2 0 0 0bp之间 ,RACEPCR结果表明 ,所用基因特异性引物与接头引物皆能扩增出产物 ,说明所构文库的质量较好 ,适于用RACE方法从中分离中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的全长cDNA。