用裂解气相色谱分析法鉴别带有不同前噬菌体的溶原性金黄色葡萄球菌

α和β为两株温和性噬菌体,金黄色葡萄球菌1157为不带前噬菌体的非溶原性菌株,分别或同时经α、β溶原化后,得到溶原性菌株1157(α),1157(β)及1157(α、B),前两者分别带有前噬菌体α或β,后者带α和β,为双溶原性株,4株菌用居里点裂解器-岛津GC-R1A计算机气相色谱仪进行分析,以目视法及计算数据分析法均能较好地鉴别1157,1157(α),1157(β)和1157(α、β)各菌株。     

产生葡激酶的溶原性转换噬菌体的研究——Ⅰ.转换噬菌体的分离及宿主双溶原性的检出

从葡激酶阳性菌株66分离到两株噬菌体即α及β,α有转换葡激酶产生的能力,β则无。用去溶原方法由菌株66得到葡激酶阴性66SAK~-,由该菌株诱导得到噬菌体β。证明菌株66为带有两个前噬菌体的双溶原菌。在该菌株经过诱导后,得到的裂解液中,不能转换的噬菌体β多于转换噬菌体α。     

产生葡激酶的溶原性转换噬菌体的研究——Ⅱ.由双溶原性菌分离的转换和不能转换噬菌体的比较

我们曾报道了金葡菌66为双溶原菌,先后分离到两株噬菌体即α、β.α具有溶原性转换葡激酶能力,β则无。本文对这两株噬菌体特性作进一步比较,如溶血素的溶原性转换,噬菌斑的形态,溶原菌的免疫性,宿主特异性,血清型别,两株噬菌体DNA的酶切电泳图及溶原化菌株的噬菌体型等,表明菌株66是带有两个不同的亲和群前噬菌体的双溶原菌株。     

白喉毒素的双重溶原性转换的研究

从白喉噬菌体β和r杂交,分离得到一株白喉噬菌体的重组子一、具有亲代噬菌体β产生毒紊的溶原性转换能力,即带有β的毒素基因(tox)和噬菌体r的溶原性免疫性的特征。该噬菌体再感染单溶原性产毒菌株C7(β),得到双重溶原性菌株,携带了两个前噬菌体及其所带有的两个毒素基因,菌株产毒能力单溶原性亲代株高。     

检测噬菌体DNA法鉴别细菌的溶原性

根据前噬菌体的可诱导性,将细菌培养物经丝裂霉素C诱导,诱导液滤过除菌,经核酸酶处理和聚乙二醇(PEG 6000)浓缩,再用苯酚进行抽提。通过检测抽提物中有无DNA,以确定菌株的溶原性。实验证明从溶原菌诱导液中可提取DNA,同时表明该DNA确为溶原菌诱导出的噬菌体DNA,而非溶原性菌以同样方法不能取得DNAo用此方法,可以作为鉴别细菌溶原性的一个手段。     

苏云金芽孢杆菌生产菌株溶原性噬菌体pep基因的克隆、表达及功能分析

溶原性噬菌体的随机爆发是微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,B.t)发酵生产的首要危害.[目的]本文的目的就是通过研究B.t生产菌株溶原性噬菌体的遗传背景,以便从分子水平上控制其在生产中的随机爆发.[方法]通过对广东梅州某公司的生产菌株MZ1采用Mitomycin C进行诱导,提取噬菌体颗粒MZTP01的基因组DNA,克隆和表达该噬菌体的pep基因,并进行了功能分析.[结果]诱导获得的溶原性噬菌体MZTP01斑点清晰,直径约1mm,成斑时间12h;从噬菌体基因组DNA双酶切(Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ)片段中回收长度为2362bp的D片段(Genbank登录号:AY639599),又从D片段中克隆了长度为1101bp、编码367aa、分子量为47kDa的Pep基因,表达载体M15(pQE30pep)在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中表达获得了47kDDa的清晰表达带,在1h时开始产生蛋白并有逐步上升的趋势;Western blot也在47kDa处得到一条清晰的条带;可溶性分析表明PEP蛋白在重组菌株中是以不可溶的包含体形式存在的,该蛋白的产生明显地抑制了宿主的生长速度;噬菌体PEP氨基酸序列之间的同源性比较表明,噬菌体MZTP01 PEP蛋白与来自E.coli K12噬菌体的PEP蛋白的同源性程度最大.[结论]我们获得了一种新的噬菌体MZTP01,并首次报道了该噬菌体D片段的核苷酸序列及pep基因的功能,试验证明PEP表达蛋白能够水解酪蛋白,其活力相当于0.3mg/mL的胰蛋白酶.     

溶原性噬菌体在猪链球菌2型分离株中的检出和鉴定

[目的]为了研究噬菌体整合酶基因在猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)中的分布情况.[方法]根据噬菌体整合酶基因设计引物,建立了PCR方法,并对扩增产物进行测序.[结果]结果显示,25株SS2致病菌株均扩增出目的片段,非毒力株T15、5株其它血清型猪链球菌及兰氏C群猪源链球菌未扩增出目的片段.经丝裂霉素C诱导后,SS2致病菌株出现完全的细胞溶解,而非毒力株T15未出现溶解.SS2致病株HA9801和ZY05719诱导均产生溶原性噬菌体,分别命名为SS2-HA和SS2-ZY,电镜观察,二者均头部呈正六边形,无尾部,其核酸类型为dsDNA,可鉴定为复层噬菌体科(Tectiviridae)的成员.噬菌体SS2-HA和SS2-ZY整合酶基因序列与已报道的SS2噬菌体整合酶基因序列高度同源,显示SS2噬菌体整合酶具有较高的特异性.[结论]从SS2致病株中检出溶原性噬菌体和噬菌体整合酶基因,且噬菌体整合酶基因与SS2溶菌酶释放蛋白(mrp)等7种毒力相关基因有相关性,表明SS2的溶原性噬菌体可能与其致病性有关.     

噬菌体及其裂解酶控制金黄色葡萄球菌的研究进展

近70年来,由于抗生素的广泛使用,耐药金黄色葡萄球菌不断出现。美国1999～2005年因感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）而入院的患者增加1倍多,其中诊断为败血症的患者增加81．2％。因此,寻找控制耐药菌的新对策十分迫切。目前有望替代抗生素的控菌手段有抗菌肽、噬菌体等。其中,噬菌体的发现早于抗生素,后因抗生素的普及而被忽视。如今,耐药菌株的流行使噬菌体治疗再次受到关注。本文就应用噬菌体及其裂解酶控制金黄色葡萄球菌的研究进展进行综述。     

葡激酶溶原转换性血清A型噬菌体

从金黄色葡萄球菌菌株120中分离列两株血清 A 型噬菌体,其中一株具有产生葡激酶的溶原性转换能力,过去未曾见过报道。     

金黄色葡萄球菌OatA基因敲除菌株及其回补菌株的构建

目的:构建金黄色葡萄球菌(金葡菌)Oat A基因敲除菌株及其回补菌株。方法:以p BT2为载体,构建金葡菌Oat A基因敲除质粒p BT2-△Oat A,经金葡菌RN4220修饰后电转入金葡菌USA300,利用p BT2载体对温度敏感的特点,在42℃多次传代,筛选出金葡菌Oat A基因敲除菌株。以p LI50为载体,构建p LI50-Oat A全基因回补质粒,电转入金葡菌RN4220,再次抽提后电转入敲除菌株△Oat A,获得基因回补菌株p Oat A。结果:成功构建基因敲除质粒p BT2-△Oat A,经RN4220修饰电转入USA300,经PCR及测序鉴定,获得了金葡菌Oat A敲除菌株△Oat A。经PCR及酶切鉴定,确认p LI50-Oat A回补质粒构建成功,通过金葡菌RN4220修饰后电转入敲除菌株△Oat A,获得基因敲除回补菌株p Oat A。结论:成功构建金黄色葡萄球菌Oat A基因敲除菌株及其回补菌株,为进一步研究金葡菌Oat A的功能及其作用机制奠定基础。     

苏云金芽孢杆菌两株溶原性噬菌体的生物学特性

研究苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的溶原性及其噬菌体的生物学特性,从生产菌株MZ1中分离了两株溶原性噬菌体。MZ1经诱导后产生直径约为3mm和1mm的噬斑,分离获得属长尾噬菌体科的噬菌体MZTP01和MZTP02两株;分别对6株和7株不同亚种的Bt菌株具有侵染力;免疫血清与相应噬菌体的中和反应K值分别为45和326,且两者无相关抗原性。MZTP01抵抗酸、碱、紫外线和热的能力比MZTP02强,但抵抗有机溶剂的程度比MZTP02弱。MZTP01的潜伏期为80min,裂解量为55;MZTP02的潜伏期为40min,裂解量为175。核酸结构分析均表明为线性dsDNA分子。两基因组DNA的凝胶电泳表明分子量均在9.4~23kb之间,并被HindⅢ酶切分别产生8条和9条清晰条带。该菌株被证明为二元溶原菌,可能是造成生产损失的主要原因;为防治溶原性噬菌体提供了生物学信息。     

金黄色葡萄球菌中PVL基因与噬菌体DNA的同源性

为了探讨金黄色葡萄球菌PVL基因与噬菌体的相关性,从4株含有PVL基因的菌株中分离出DNA,用HindⅢ或EcoRI酶切后,分别与PVL和Lukm-lukF-PV探针进行Southern印迹杂交,以及对含有PVL基因及其下游区域的片段克隆、测序和同源性分析。结果表明3株菌的PVL基因及其下游区域的序列与V8菌株噬菌体ΦPVL的PVL基因及其下游噬菌体stt site的序列一致。另一菌株的LukM-lukF-PV基因与ΦPVL,的PVL基因有78％的同源性,并且在LukM-lukF-PV基因的下游区域发现与金黄色葡萄球菌噬菌体Φ11整合位点有98％同源性的序列,根据PVL基因存在于噬菌体的基因组上,推测可通过噬菌体转导在金黄色葡萄球菌中传播。     

金黄色葡萄球菌抗体在诊断金黄色葡萄球菌L型败血症中的意义

目的：探讨测定金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）抗体在金葡菌Ｌ型败血症中的意义。方法：金葡菌Ｌ型败血症的细菌诊断组３８例,临床诊断组４６例及对照组４１例的血清做试管定量凝集反应测定其效价。并以金葡菌细菌型和Ｌ型分别感染动物,停止感染两个月后测定抗体滴度。结果：以１：８０以上作为阳性,阳性率细菌诊断组９４７％、临床诊断组８６９％、而对照组仅１４６％。细菌诊断组及临床诊断组均明显高于对照组（Ｐ〈０００５）,而细菌诊断组与临床诊断组比较无显著差异（Ｐ〉００５）。结论：金葡菌抗体在金葡菌Ｌ型败血症中具有快速的病原学辅助诊断作用。     

应用噬菌体GH15和K治疗金黄色葡萄球菌感染

[目的]研究金黄色葡萄球菌噬菌体GH15和K的生物学特性及联合用于治疗金黄色葡萄球菌感染的潜力.[方法]通过透射电镜观察噬菌体GH15和K的形态;测定二者的裂解谱和一步生长曲线;通过体外裂解实验和体内治疗实验分别测定单独使用GH15、K及二者混合使用时的裂解能力和对菌血症小鼠的保护效果.[结果]通过电镜观察发现两个噬菌体的外形相似,但GH15的尾部比K的长.GH15裂解谱较宽,可以裂解28株金葡菌,而K仅能裂解7株金葡菌.通过对两株噬菌体感染7株共同宿主菌形成的一步生长曲线进行拟合曲线分析,表明二者对不同宿主菌的增殖趋势是不同的.在体外,混合噬菌体与单个噬菌体的抑菌活性无明显差别;在体内实验中,混合噬菌体表现出优于单个噬菌体的治疗效果,用较低的剂量即可以达到高剂量单个噬菌体的治疗效果.[结论]GH15和K所形成的混合噬菌体在治疗金黄色葡萄球菌感染具有更大的应用潜力.     

两株新的金黄色葡萄球菌烈性噬菌体的生物学特性和基因组学研究

以金黄色葡萄球菌为宿主菌,从奶牛场废水样品中分离到两株烈性噬菌体,分别命名为phiSA_BS1和phiSA_BS2。电子显微镜观察显示其头部呈多面体对称,有伸缩性尾部。对这两株噬菌体的一步生长曲线、温度耐受性和pH耐受性进行研究,发现两者均裂解3株金黄色葡萄球菌,但不能裂解1株表皮葡萄球菌。进一步分析它们的全基因组序列,发现phiSA_BS1基因组大小为 142 978 bp,GC含量为 29.80%,预测到201个开放读码框(open reading frame,ORF),未预测到tRNA基因;phiSA_BS2基因组大小为 149 230 bp,GC含量为 29.61%,预测到210个ORF和1个tRNA基因。系统发育分析表明,这两株噬菌体同属肌尾噬菌体科,属于新的金黄色葡萄球菌噬菌体,可能为治疗金黄色葡萄球菌相关的奶牛乳腺炎提供新的方法。     

金黄色葡萄球菌噬菌体vB_Sau_P68的基因组分析和裂解酶

【背景】金黄色葡萄球菌是常见的人畜共患条件致病菌,随着多耐药菌株分离率的增长,研发与抗生素作用模式不同的抗菌剂迫在眉睫。【目的】分离高效且特异性强的金黄色葡萄球菌噬菌体,对其进行功能注释,并对其编码的裂解酶进行功能验证。【方法】通过对噬菌体全基因组序列进行分析找到裂解酶基因,利用原核表达系统对其编码的2个裂解酶蛋白进行克隆,用SDS-PAGE与蛋白免疫印迹法(Western blotting)鉴定目的蛋白是否表达,并采用单斑法验证其裂解活性。【结果】本研究的噬菌体为一株新的金黄色葡萄球菌噬菌体,命名为vB＿Sau＿P68,该基因组全长为139 409 bp,GC含量为31.0%,编码220个开放阅读框(open reading frame,ORF),透射电镜观察具有正二十面体头部和收缩性尾部,形态学分类属于肌尾噬菌体。该噬菌体编码2个裂解酶基因,分别具有CHAP催化结构域与SH3＿5结合结构域,SDS-PAGE与Western blotting表明Lys161能够表达且有裂解活性,Lys163则无法外源表达。对Lys161序列进行分析,该裂解酶无信号肽,无跨膜区域,以无规则卷曲为主。【...