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相似文献
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1.
在大肠杆菌中提高人α1b型基因工程干扰素的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
将人α1b型干扰素(IFN-α1b)基因插入带有原核增强子样序列的新型载体Pbv322,使干扰素在大肠杆菌中的表达水平明显高于原表达载体,达到1.6×10u/L培养液。重组质粒的特点是:含增强子序列X,trp启动子控制。利用DEAE-Sepharose、CM-Sepharose离子交换层析及单克隆抗体亲和层析纯化IFN-α1b,获得了电泳纯产品,其比活性为2×10u/mg,分子量为19kDa。此外,用Pat153代替Pbv322,构建了带有和不带有X序列的两种表达载体,平行对比表明增强子X序列可以将IFN-α1b表达提高4倍  相似文献   

2.
建立了一个实验室制备重组hGM-CSF的培养、复性和分离纯化的技术工艺。通过对PEGM工程菌的生长和诱导表达等条件的初步调整,使hGM-CSF的表达量从16.9%提高到32.3%,获得0.749g/L的包含体,纯度为65%;包含体用6mol/L盐酸胍溶解和稀释复性后,经CMSepharoseFF.DEAESepharoseFF和SephacrylS200HR层析分离,制得纯度达97%以上、比活性为3.0×10u/mg的hGM-CSF,纯化总回收率约为5%  相似文献   

3.
根据基因库中的顺序,设计了胶质细胞源神经营养因子(GDNF)基因的PCR引物,以此从人基因组DNA中扩增并克隆了GDNF的编码序列,经DNA测序确认后,该片段克隆到表达质粒pET-3a中,转化大肠杆菌BL21(DE3).培养的重组菌经IPTG诱导,在T7启动子调控下表达出hGDNF蛋白.经电泳分析表明GDNF主要存在于细菌包涵体中.从培养菌中制备包涵体,经充分洗涤,溶解于含8mol/L尿素的变性缓冲液中.经SP-Sepharose柱层析分离,梯度洗脱,以15%SDS-PAGE检查含GDNF的部分.将含单体GDNF部分进行复性,再次用SP-Sepharose离子柱分离同源二体GDNF.最后经SDS-PAGE制备电泳纯化,纯度大于95%.经N端测序表明序列正确.经测定,每升培养菌可得约10mg纯化的GDNF.  相似文献   

4.
五步蛇毒中低分子量蛇毒类凝血酶的分离纯化   总被引:4,自引:0,他引:4  
康佐文  周文丽 《蛇志》2000,12(1):1-2
目的 寻找五步蛇毒新的蛇毒类凝血酶组份。方法 用DEAE-Sepharose-Fast Flow(-FF),cm-Sepharose-FF纯化经常规化学提纯的五步蛇毒;以血凝活性和精氨酸酯酶活性(BAEE)检测酶活力;以SDS-PAGE电泳法测定分子量。结果 得到分子量为14000左右的电泳纯蛇毒类凝血酶组份。结论 五步蛇毒中含有低分子量蛇毒类凝血酶。  相似文献   

5.
以牛血球为材料,经溶血等处理和丙酮沉淀,获得牛血球超氧化物歧化酶粗品。此粗酶可以通过DEAE-Sepharose和CM-Sepharose快速柱层析,获得超氧化物歧化酶纯品。纯化的酶比活可达13500u/mg,经PAGE、SDS-PAGE和快速蛋白液相色谱(FPLC)检测,结果表明,纯化酶是均一的Sephadex G-100凝胶过滤测得该酶分子量为31,800,SDS-PAGE测得亚基分子量为15  相似文献   

6.
重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中的表达与纯化   总被引:8,自引:0,他引:8  
为实现重组人血清白蛋白(rHSA)的开发,对构建的酵母工程菌Pichia pastoris GS115/HSA进行了表达条件的优化,摇瓶中将表达rHSA的量提高到150mg/L。经中空纤维柱浓缩、Phenyl-Sepharose分离和抗HSA-Sepharose亲和层析纯化获得电泳纯的重组人血清白蛋白。  相似文献   

7.
用蛋白质工程方法改变葡萄糖异构酶最适pH和最适温度   总被引:3,自引:2,他引:3  
用寡核苷酸诱导的定点突变方法构建了葡萄糖异构酶基因的突变体(N184D和A198C)。含突变体的重组质粒pTKD-GI1(N184D)和pTKD-GI2(A198c)在E.coliK38菌株中表达,用DEAE-Sepharose FF和Sephacryl S-300HR柱层析分离纯化突变酶。与野生型葡萄糖异构酶比较实验表明:(1)突变酶N184D的最适pH值下降了1个单位;等电点下降了0.6个单位  相似文献   

8.
蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分序列的测定   总被引:10,自引:0,他引:10  
以新鲜蚯蚓为原料,经过保温抽提、乙醇沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析、Lysine-Sepharose4B亲和层析以及SDS-PAGE制备电泳等纯化步骤,得到一种纯度达95%以上的蝗蚓纤溶酶,该酶具有强烈的溶解纤维蛋白折作用及蛋白酶活性,平板法测得其比活性为900UK单位/毫克蛋白,TAME法测得其比活性为25000单位/毫克蛋白,酶学性质研究表明其最适反应温度为65  相似文献   

9.
慈菇(Sagittaria safittifolia)α—半乳糖苷酶的纯化与性质   总被引:1,自引:0,他引:1  
以对硝基苯糖苷基为底物,测定了慈菇的12种糖苷酶,其中α-甘露糖苷酶,α-和β-半乳糖苷酶活力较高,经硫酸铵分级沉淀,SephadexG-150分子筛层析,ConA-Sepharose4B亲和层析,DEAE-SepharoseCL-6B离子交换层析,从慈菇抽提液纯化了α-半乳糖苷酶,纯化酶的比活提高1072倍,活力回收15.6%,在圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-PAGE上均显示了1条蛋白质带,在  相似文献   

10.
从Meth ylomonas sp.GYJ3菌株中经DNEAE-SepharoseCl-6B阴离子交换层析和SephacrylS300凝胶层析分离出纯化出甲烷加氧酶羟基酶组分,经HPLC分析,纯度大于90%,分子量为240kD,纯化们数为3.9,比活为225nmol环氧丙烷每分钟毫克蛋白,SDS-PAGE表明,羟基化酶由三个亚基组成,亚基分子量为56、43、27kD.ICPAES测定羟基化酶的Fe  相似文献   

11.
大熊猫乳酸脱氢酶同工酶H4的分离纯化和某些性质的研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
采用8-(6-氨己基)-氨基-5-AMPSepharose亲和层分析法和DEAE-Sepharose离子交换层析法从大熊猫心肌中分离纯化出乳酸脱氢酶同工酶H4,纯化的大熊猫LDH-H4,比活为445U/mg蛋白,经SDS-PAGE,APGE,等电聚焦电泳鉴定均为一条带,其亚基分了量为36000,等电点为5.45。经测定大熊猫LDH-H亚基N端被封闭,C端氨基酸残基经测定为Leu。氨基酸组成分析表明  相似文献   

12.
采用8-(6-氨己基)-氨基-5'-AMPSepharose亲和层析法和DEAE-Sepharose离子交换层析法从大熊猫心肌中分离纯化出了乳酸脱氢酶同工酶H4.纯化的大熊猫LDH-H4,比活为445U/mg蛋白,经SDS-PAGE,PAGE,等电聚焦电泳鉴定均为一条带,其亚基分子量为36000,等电点为5.45.经测定大熊猫LDH-H亚基N端被封闭,C端氨基酸残基经测定为Leu.氨基酸组成分析表明每个亚基含有5个Cys,9个Met.  相似文献   

13.
用PCR法扩增出编码人FAS分子胞外区的cDNA片段,直接克隆到pGEM-T载体上,经DNA序列测定后,再插入到谷胱甘肽转硫酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX-KG的EcoRⅠ和SalⅠ位点之间,构成重组质粒pKG-hFAS,将此质粒导入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得GST-hFAS重组融合蛋白的表达,用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B经亲合层析获得纯化的GST-hFAS蛋白,经凝血酶酶切和二次亲合层析去除GST部分,得到纯化的FAS蛋白.用纯化的FAS抗原免疫家兔制备了抗FAS抗体,经检测发现抗FAS抗体能诱导U937细胞发生细胞凋亡  相似文献   

14.
Metylomonassp.GYJ3菌的甲烷单加氧酶(MMO)粗酶提取液经DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换层析、SephadexG-100凝胶过滤层析和DEAE-TSKgelHPLC分离纯化出MMO还原酶组分.经HPLC分析,纯度大于95%,纯化倍数为4.4,加入至MMO羟基化酶和调节蛋白B的体系中表现比活为228nmol环氧丙烷每分钟毫克蛋白.SDS-PAGE电泳表明还原酶由一种亚基组成,分子量42kD.ICP-AES测定还原酶的Fe含量为1.83molFe每mol蛋白.UV-Vis光谱表明还原酶除280nm蛋白质特征峰外在460nm有最大吸收峰,且A280nm/A460nm为2.50,与其它黄素一铁硫蛋白相似,推测还原酶可能含一个FAD辅基和Fe2S2中心.在厌氧条件下,还原酶能够和NADH作用,UV-Vis光谱分析表明还原酶460nm处特征吸收峰消失,说明在MMO催化过程中还原酶接受NADH的电子.DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换层析分离出调节蛋白B,部分纯化的调节蛋白B的分子量大约在20kD,它能够提高MMO比活性40倍,MMO还原酶和调节蛋白B单独存在时不具有MMO  相似文献   

15.
东亚钳蝎神经毒素在大肠杆菌中的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
以山西风陵渡东亚钳蝎(ButhusmartensiKarsch)的尾腺总RNA为模板,根据已知的蝎神经毒素保守氨基酸序列设计引物,利用PCR技术,扩增并克隆了两个蝎神经毒素基因.序列分析表明,由两个基因导出的氨基酸序列(BmKMm1和BmKMm2)与已知的蝎神经毒素BmKⅠ、BmKⅡ、BmKⅢ、BmKM1、BmKM9有很高的同源性.将BmKMm2基因重组到大肠杆菌分泌型表达载体pExSec1中进行表达.SDS-PAGE证明表达产物被分泌到细胞周间质及培养液中.经IgG-Sepharose纯化后的蛋白质注射小白鼠表明表达产物有生物学活性  相似文献   

16.
对酵母NMT基因在大肠杆菌中表达进行较详细的研究,进而构建了复制子为p15A并含卡那霉素抗性基因的相容性表达质粒pKZMT,将其与表达质粒pCZmCα1共转化进大肠杆菌BL21(DE3)F′,进行双质粒表达偶联加工修饰研究,其中pCZmCα1表达底物蛋白小鼠cAMP依赖的蛋白激酶催化亚基α(PKA-mCα)。SDSPAGE及Westernblot分析表明,双质粒表达系统中,PKA-mCα都得到了稳定的高表达,尤其在23℃低温诱导表达时,表达产物的可溶性部分明显增多;而酵母NMT被控制在有利于活性功能的可溶性低水平表达。[H]myristicacid标记测定及放射自显影的结果显示,在大肠杆菌中表达的重组PKA-mCα被豆蔻酰化修饰。  相似文献   

17.
尖吻蝮蛇酸性磷脂酶A2的纯化和初步晶体学   总被引:5,自引:0,他引:5  
为进一步揭示影响血小板聚集活性的结构基础,纯化了江西尖吻蝮蛇(Agkistradun acutus)酸性磷脂酶A2。江西省吻蝮蛇蛇毒经CM-Sepharose离子交换柱层析,两步DEAE-Sepharose离子交换柱层析以及Mono)GFPL离子交换柱层析,得到了SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和等和集电泳均一的磷脂酶A2(PLA2),其分子量为16.5KD,等电点为4.3,经测定,该酶具有抑制ADP诱地  相似文献   

18.
牛肾上腺皮质LDL受体经Triton X-100增溶,DEAE32离子交换柱和LpB Sepharose亲和柱层析,在SDS-PAGE中有三条区带,分别在原点;Mr 160kD;Mr125kD处。进一步用8%SDS-PAGE纯化三个区带的蛋白质分别免疫新西兰大白兔所得的抗体,应用免疫印迹和ECL非同位素标记法可对牛肾上腺皮质和人皮肤纤维细胞膜上的LDL受体进行测定。  相似文献   

19.
林生山黧豆谷氨酸脱羧酶的分离纯化及部分性质的研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
以林生山黧豆为材料,利用硫酸铵分段盐析,丙酮沉淀,DEAE-SepharoseFF离子交换柱层析,SephacrylS300凝胶过滤柱层析及FPL-MonoQ柱层析技术,以聚酰胺薄膜层析荧光定量法为酶活力检测手段,分离纯化了谷氨酰羧酶,达到电泳银染纯,纯化后的林生山黧豆谷氨酸脱羧酶活力达375.09U.mg^-1,纯化保数38.2倍,经SDS-PAGE测定,其亚基分子量为70kD,经工PAGE确定  相似文献   

20.
葡萄糖异构酶(glucoseisomerase,GI)是使用量最大的工业酶之一,可用于高果糖浆的生产,也可以用含木聚糖物质及废料为底物发酵生产乙醇,具有重要的经济价值.本文选择了表达载体pBV220[1],利用PCR方法删除了原表达质粒pTKDGI1中GI结构基因5′端多余的核苷酸,并添加了合适的酶切位点,重新构建了能在大肠杆菌DH5α中高效表达GIG138P的表达质粒pBZGI1.传代实验表明,新表达体系的稳定性明显优于原表达体系.粗酶液经热处理、DEAESepharoseFF和分子筛Se…  相似文献   

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