2004后基因组高峰会议第二轮通知

20 0 4年 5月 2 0～ 2 2日　北京　大观园酒店本次会议特邀美国冷泉港实验室的基因表达调控专家AdrianR .Krainer教授 (EukaryoticmRNAProcessing一书的作者 )和华大基因研究中心主任、人类基因组计划中国总协调人杨焕明教授为本次会议的主席 ,并邀请RNAi和核酶专家、美国贝克曼研究所分子生物学主任JohnJ.Rossi(IntracellularRibozymeApplications:PrinciplesandProtocols一书的作者 )做关于RNAi的基调发言。届时还有美国癌症研究所、Affymetrix公司、系统生物学研究所、哈佛大学、耶鲁大学、德国MaxPlanck医学研究所以及百时美…     

国外动态

siRNA检测芯片 :RNAi基因沉默新技术Genetix公司研制成功一系列适合检测RNA干扰研究中siRNA分子干扰效果的基因芯片产品。在即将于 2 0 0 4年 10月召开的RNAi欧洲会议上 ,Genetix将会介绍他们的QAr rayMini生物芯片和可选择蓝色激光的aQuire基因芯片扫描仪 ,这一组合是进行RNAi优化实验的完美配套产品。RNAi已经发展成一种强大的分子生物学研究工具 ,用于沉默细胞中的目标基因。研究人员能够使用各种不同的技术将双链siRNA分子 (一般长度为 2 0 2 5个核苷酸 )引入到哺乳动物细胞中。一旦进入细胞 ,这些分子就会与互补的目标mR…     

动态

博奥芯片公司和美国昂飞公司进行战略合作北京博奥生物芯片有限责任公司和美国昂飞 (Affymetrix)公司于 2 0 0 5年 4月 2 6日宣布建立战略合作关系。此次博奥公司与美国昂飞公司签订了两个协议 ,一是《生物芯片相关产品的共同研发协议》 ,双方将在平等合作的模式下 ,实现优势资源互补 ,利用各自拥有知识产权的相关技术 ,共同开发新一代生物芯片扫描仪、病毒检测芯片 ,并共同制订技术标准 ,共享研究成果 ;二是《DNA芯片服务平台协议》 ,博奥公司将引进昂飞公司的DNA芯片分析系统 ,用于在国内的相关技术服务中。美国昂飞公司是全球第一家生…     

RNAi转基因作物安全评价研究进展

在秀丽隐杆线虫中首次发现双链RNA(dsRNA)能特异性地导致基因沉默(RNAi)现象后,人们开始大量地研究RNAi技术,并将其应用于功能基因的研究,来提高作物的抗性和改良遗传育种等。本文详细介绍了RNAi的技术原理,并且对RNAi技术与传统转基因技术的区别进行分析,阐述了该技术具有重要的生物学意义,以及在农作物害虫防治领域的占据独特优势。基于RNAi技术存在的潜在脱靶效应,从改良植物、靶标生物和生态环境的3个方面具体分析该技术可能存在的风险,为RNAi技术的风险评估提供参考。由于RNAi技术仍存在风险,为了维护生态多样性和保障人们的人身安全,应尽快建立起符合实际需求的安全性评价方法,本文针对RNAi转基因作物的环境安全和食用安全2个方面的评估方案进行概述。RNAi技术对减少害虫数量、提高水稻产量、降低种植成本以及减少化学农药污染、促进农业可持续发展来说具有重要意义,但该技术仍存在风险,需要进一步监管和研究,建立完善的生态评价系统,让RNAi技术在农业生产上发挥作用。     

RNA干扰技术的基础研究与应用

RNA干扰技术(RNAi)是一项高效率、强特异性的基因沉默技术.自1998年发现RNA干扰现象以来,RNAi吸引很多国内外科学家的研究兴趣.经过10多年的潜心研究,现在对该技术的参与成分、作用机理都有了较深入地了解.同时,随着生物学知识的完善和生物技术与基因工程的发展,研究人员时RNAi在基因功能研究、疾病(如肿瘤)相关的基因治疗、新药的研究与开发等方面的应用进行了广泛的探索,并且已经显示该技术的潜在应用价值,但是RNAi的自身缺陷制约了其在临床治疗等方面的实际应用.综述前人的研究结果,系统阐述了RNAi的发生、作用机理、缺陷以及其应用,为相关科学研究提供参考.     

RNAi在害虫防治中应用的重要进展及存在问题

RNAi是目前最有可能应用于害虫绿色防控的新技术。2017年6月,美国环境署(EPA)批准了国际上第一例表达昆虫双链RNA(dsRNA)的抗虫转基因玉米MON87411,掀起了利用RNAi技术进行害虫防治研究新的热潮。但是,目前RNAi在害虫防治中的应用还存在一些问题,例如有效靶标基因筛选和应用策略,鳞翅目昆虫对RNAi的敏感性以及双链RNA在环境中的稳定性等等。本文系统总结了RNA干扰现象发现20年来,该技术在害虫防治领域的研究及应用概况,并对RNAi技术应用的可行性、应用方法、存在问题和目前的一些解决办法进行了比较详细的综述。通过对近期研究结果的综合分析发现,dsRNA进入某些鳞翅目昆虫中肠或血淋巴后,被相关核酸酶降解可能是其RNAi效率较低的首要原因。通过对dsRNA进行脂质体修饰,纳米粒子包埋可以在一定程度上解决dsRNA降解的问题,进而提高RNAi效率。     

短双链RNA对鸡胚盘细胞外源绿荧光蛋白基因表达的影响

RNA干扰 (RNAinterference,RNAi)作为一种特异性沉默基因表达的方法 ,正在成为研究基因功能、胚胎发育及病毒性疾病治疗的重要工具。为了了解RNA干扰在禽类中的作用情况 ,实验将体外转录合成的绿荧光蛋白短双链干扰RNA (siGFP)和 3 磷酸甘油醛脱氢酶短双链干扰RNA (siGAPDH )分别同绿荧光蛋白(Greenfluorescentprotein ,GFP)表达载体 (pEGFP C1Vector)用脂质体转染试剂LipofectamineTM2 0 0 0共转染鸡胚盘细胞 ,并于转染后 36h在荧光显微镜下观察转染和干扰效果。对细胞绿荧光蛋白表达率的方差分析结果显示 ,不同处理组间差异达极显著水准 ,其中GFP组和GFP siGAPDH组均同GFP siGFP组差异极显著 ,GFP组同GFP siGAPDH组差异不显著。实验结果说明 ,siGFP能特异、有效地敲低细胞绿荧光蛋白的表达。同线虫、真菌、拟南芥、水螅、锥虫、涡虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等其它生物体一样 ,鸡胚盘细胞中也存在短双链干扰RNA (siRNA)特异性沉默基因表达的RNA干扰机制     

RNAi技术及在植物抗病毒研究中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是一项基因沉默新技术,在抗病毒研究中,人为地将与病毒或宿主基因(宿主基因编码的蛋白质对病毒很重要而对宿主本身作用很小或不起作用)同源的双链RNA(double strand RNA,dsRNA)导入生物体内,引起与其同源的基因发生沉默,从而抑制病毒复制,达到抗病毒的目的。因此RNAi技术在抗病毒研究中倍受关注,并取得了显著成绩。主要对RNAi技术的相关知识以及在植物抗病毒中的应用进展作一综述。     

昆虫RNAi通路及其核心元件的研究综述

RNAi作为分子生物学的一种重要技术,在昆虫基因功能和功能基因组研究中得到广泛应用,同时,有关昆虫RNAi的机制也受到了大家的关注。近年来的研究结果表明,昆虫RNAi的通路与其他动物相同,根据引起基因沉默的RNA分子的类型,可以分为siRNA、miRNA和piRNA 3种不同的通路。昆虫RNAi通路中的核心元件包括了:(1)行使切割作用的RNaseⅢ家族成员Drosha和Dicer;(2)用来降解目的 mRNA的Argonaute蛋白;(3)dsRNA结合蛋白Pasha、R2D2和Loquacious。了解昆虫RNAi的通路及其核心元件,有助于我们更好地理解昆虫RNAi的分子机制和改进实现RNAi的方法,对促进昆虫RNAi技术的研究及其在害虫防控中的应用具有指导意义。     

绿僵菌素A对家蚕cecropin B和gloverin 4基因表达的影响

绿僵菌素A(DA)是由金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae产生的一种环缩羧肽类次生化合物,具有抗昆虫免疫作用,但是人们对其影响免疫相关基因调控的机理缺乏了解。本实验以家蚕Bm12细胞为材料,采用RNAi技术沉默相关转录因子,结合荧光定量PCR(q PCR)技术,明确DA处理或沉默TOLL和IMD信号通路相关转录因子后抗菌肽cecropin B和gloverin 4基因表达的变化。实验发现,DA能引起抗菌肽cecropin B基因表达上调和gloverin 4基因表达下调。利用特异性siRNA分别沉默转录因子BmRelish1、BmRelish2、BmRel、Bm FOXg1后,发现只有沉默转录因子BmRelish时,cecropin B和gloverin 4基因表达才下调,说明这两种抗菌肽的合成均通过IMD信号通路调控。当沉默BmRelish1或BmRel基因及DA处理联合作用时,cecropin B基因显著下调,说明在抑制cecropin B合成时,DA与转录因子BmRelish1或者BmRel之间存在密切的协同效应;同样,在促进gloverin 4合成时,DA与转录因子BmRelish2之间也存在着协同效应。     

利用RNAi技术抑制拟南芥NHX1基因家族的表达

采用RNAi抑制NHX1基因家族的表达,并观察其对拟南芥耐盐性和耐旱性的影响.根据从拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)cDNA中扩增出编码Na /H 反向转运蛋白基因AtNHX1长度为210 bp高度保守序列作为RNAi的靶标区,并正反2个方向插入载体pHANNIBAL中,2个片段用intron连接;将RNAi表达框连入具有NPTⅡ筛选标记基因的表达载体pART27中,构建以拟南芥NHX1基因家族为靶标的RNAi载体.采用农杆菌介导的真空渗透法转化拟南芥,得到T0代转基因拟南芥种子.对转基因阳性植株进行RT-PCR检测以及耐盐性和耐旱性分析.结果表明,利用本实验构建的NHX1基因家族RNAi载体,拟南芥NHX1基因家族表达被成功地抑制;耐盐和耐旱分析表明RNAi技术对基因表达沉默是有效的.     

UL29shRNA表达质粒与ACV对HSV-2 抑制效果的比较

目的:通过将筛选的UL29shRNA表达质粒与抗病毒药物阿昔洛韦(ACV)的抗病毒效果及细胞毒性进行比较,探讨RNA干扰在细胞水平上对HSV-2病毒的抑制效果。方法:将筛选的干扰效果最好的表达质粒UL29-shRNA1641作为RNA干扰组与抗病毒药ACV进行对HSV-2的抑制效果的比较研究,分为RNAi组、ACV组和RNAi+ACV组。采用实时荧光定量PCR检测UL29mRNA的相对表达量,Karber法检测细胞上清液中病毒滴度的变化、蛋白印迹法(Western blot)检测ICP8的相对表达量,对RNAi与ACV抑制效果进行比较,通过WST-1(Water-Soluble Tetrazolium-1)法对质粒转染复合物(质粒+转染试剂)和ACV的细胞毒性进行比较。结果:RT-PCR检测三组mRNA的相对表达水平,其中RNAi组UL29基因相对表达量高于ACV组(P0.05);RNAi+ACV组UL29基因相对表达量明显低于RNAi组和ACV组(P0.05)。Karber法检测三组细胞上清液病毒滴度表明,RNAi组病毒滴度高于ACV组(P0.05),RNAi+ACV组的病变病毒滴度明显低于RNAi组和ACV组(P0.05)。Western blot检测ICP8相对表达量,ACV组的ICP8(UL29编码的单链DNA结合蛋白,主要作用是在HSV-2 DNA复制过程中与复制叉产生了单链DNA结合,防止其重新配对形成ds DNA或被核酸酶降解)相对表达量比RNAi组低(P0.05)。RNAi+ACV组ICP8相对表达量降低最为明显,与ACV组和RNAi组相比有显著差异(P0.05)。WST-1法对转染复合物与ACV的细胞毒性进行比较,其中RNAi中质粒和转染试剂对细胞的毒性明显小于ACV。结论:在RNAi与ACV对HSV-2抑制效果的比较中,ACV要好于RNAi,两者联合使用的抑制效果好于单独使用RNAi或ACV。在抑制效果都较好的情况下比较,RNAi中使用的质粒与转染试剂对细胞的影响比ACV小。     

RNAi技术在昆虫基因组学研究及其生物防控中的研究进展

RNAi技术是通过将双链RNA（dsRNA）导入宿主细胞,沉默相关基因进而干扰宿主生长发育的一项技术,广泛应用于昆虫的生物防控。近年来,基于RNAi开展昆虫的防控技术研究中发现RNAi的效率受到多方面因素的影响,其中dsRNA的导入途径是关键的影响因素。本文总结了显微注射法、电穿孔介导法、饲喂法、转基因法、纳米载体介导法等5种方法在昆虫的基因组学研究和RNAi生物防控中的应用效果,比较了不同方案的优缺点,以期为昆虫的RNAi应用研究和生物防控技术提供参考。     

RNAi技术在中国昆虫学研究中的发展、应用与展望

RNAi现象从其原理揭示至今已有20余年的历史,我国昆虫学家利用RNAi技术在褐飞虱Nilaparvata lugens、飞蝗Locusta migratoria、豌豆蚜Acyrthosiphon pisum、烟粉虱Bemisia tabaci、甜菜夜蛾Spodopteraexigua、棉铃虫Helicoverpaarmigera等多种昆虫中开展了广泛深入的研究工作,目前已发表的关于昆虫RNAi的论文数量位列世界第二位。我国科学家应用RNAi技术揭示了多个与昆虫重要生物学现象和行为相关的关键基因功能及其分子机制,发展了基于RNAi介导的转基因抗虫作物等多种害虫控制新方法,并探索了不同昆虫中RNAi作用的分子机制。这些研究表明RNAi技术对于中国昆虫学研究的发展起到了重要的推动作用。本文综述了RNAi技术在我国昆虫学研究领域近20年来的发展与应用,并对当前存在的问题及未来发展方向进行了展望,包括靶标基因筛选、RNAi效率评价标准、RNAi技术与传统害虫防治方法的联合应用模式以及昆虫RNAi作用机制等方面,以期更好地推动RNAi技术在我国昆虫学研究和害虫防治领域的发展。     

热休克蛋白70（HSP70）对HBV复制及抗原分泌的影响

目的了解慢性乙型肝炎患者（CHB）血清中热休克蛋白70（HSP70）与HBV—DNA的关系,并探讨HSP70能否影响乙型肝炎病毒（HBV）的复制与抗原分泌。方法选择安徽医科大学第二附属医院住院和门诊CHB患者60例为研究对象,并以30例健康体检人群为对照者,采用酶联免疫技术（ELISA）分析CHB患者和对照者血清HSP70表达水平,运用荧光定量PCR技术分析CHB患者血清HBV—DNA复制水平;以RNA干扰（RNAi）技术抑制HepG2．2．15细胞中HSP70基因的表达,同时分析细胞培养上清中HBVDNA以及相关抗原的表达情况。结果CHB患者血清中HSP70的表达水平明显高于其在健康对照者血清中的表达水平（P〈0．05）,且与HBV—DNA拷贝数呈正相关性（r=0．540,P〈0．05）;其中HBeAg阳性的CHB患者血清中HSPT0的表达水平也显著高于HBeAg阴性CHB患者血清中的表达水平（P〈0．05）。以RNAi技术特异性降低HSP70在HepG2．2．15细胞中的表达,HepG2．2．15细胞培养上清中HBV—DNA和相关抗原的分泌量明显降低（P〈0．05）。结论HSP70蛋白很可能在HBV的生命周期中发挥重要作用,从而影响HBV的复制和乙型肝炎的进展。     

基于工程菌高效合成靶向昆虫基因的dsRNA的方法

外源或内源双链RNA(dsRNA)可以干扰昆虫基因的表达。目前,利用RNA干扰(RNAi)技术防治农业害虫已经取得了一定进展,但高昂的dsRNA合成成本是RNAi技术在田间应用的主要限制因素。本方法利用L4440质粒和大肠杆菌HT115(DE3)菌株,建立了一种经济、高效的昆虫靶标基因dsRNA合成方法。与商业化的dsRNA合成试剂盒相比,工程菌合成dsRNA的方法大幅降低了dsRNA的合成成本。本方法将为大规模昆虫基因功能解析和RNAi制剂的田间应用提供可能,有望促进以RNAi为核心的害虫防治技术的实践和发展。     

香菇HMG-box转录因子lelcrp1基因的功能

【目的】研究香菇(Lentinula edodes) HMG-box转录因子LELCRP1 (Lentinula edodes lignocellulase genes regulation protein 1)在木质纤维素降解相关酶基因表达中的功能与作用。【方法】通过double-joint及同源重组方法构建lelcrp1基因RNAi载体,采用根癌农杆菌介导转化的方法转入香菇异核菌株W1菌丝中,筛选得到RNAi转化子,通过Southern杂交检测插入片段在菌株W1基因组中的拷贝数量。采用荧光定量PCR检测RNAi转化子木质纤维素降解酶基因表达水平变化,并在含有3.5μg/mL潮霉素的MYG平板上测定RNAi转化子的菌丝生长速度。【结果】获得了4个lelcrp1基因表达水平与出发菌株W1相比显著下调6–7倍的RNAi转化子。Southern杂交结果显示,lelcrp1基因RNAi片段已成功整合至香菇菌株W1基因组内,并以单拷贝形式存在。对其中2个RNAi转化子的26个木质纤维素降解酶基因表达水平进行分析,发现其中9个纤维素酶基因、1个半纤维素酶基因、2个辅助酶AA9基因和1个锰过氧化物酶基因的表达水平均表现出明显的下调。平板生长试验表明,RNAi转化子菌丝生长速度均显著慢于出发菌株W1。【结论】通过RNAi技术成功抑制了香菇异核菌株中lelcrp1基因表达水平,并导致部分纤维素及木质素酶基因表达水平相应下调,首次发现HMG-box结构域的转录因子能调控木质纤维素降解相关酶基因表达。     

RNA干扰在昆虫中的作用机理及应用进展

RNA干扰（RNAi）是生物体内源基因发生转录后特异性降解的一种生理现象,作为抵抗病毒的免疫机制,广泛存在于生物体内。RNAi在秀丽隐杆线虫中的发生机制已明确,但昆虫的系统性RNAi不同于线虫,在昆虫中尚未发现线虫跨膜蛋白SID．2的同源蛋白,且果蝇中不存在依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRP）,但存在具有相似活性的物质。昆虫发生RNAi的效率不仅与靶标基因自身及双链RNA的选择有关,而且与虫体的发育状态及摄入双链RNA的剂量相关。随着RNAi在昆虫中作用特点的阐明,RNAi的应用价值也逐渐体现。近年来,通过RNAi沉默靶标基因,不但促进了昆虫基因功能研究的发展,而且被广泛用于重要农业害虫抗药性基因的研究。最新研究表明,RNAi结合第2代测序技术,针对非模式昆虫,能迅速找到具有致死效应的靶标序列,加快了利用RNAi技术生产生物农药的步伐。     

基于RNAi技术的转基因植物研究进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指由双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）诱发同源mRNA高效特异性降解的现象,在真核生物中普遍存在且进化保守。RNAi技术作为21世纪初的重大科学成就,目前被广泛应用于疾病防治、基因功能研究、植物改良育种等领域。RNAi技术常与转基因技术结合用于植物改良育种,通过不同的载体设计或作用途径来研发满足生产需要的农业生物技术产品。为了明确现阶段基于RNAi技术的转基因植物育种技术进展,综述了RNAi现象的发现和作用机制、转基因载体设计、小RNA（small RNA,sRNA）的递送方式等方面的研究进展,并阐述了基于RNAi技术的转基因植物的研究实例和商业化情况,以期为相关研究提供参考,从而发挥RNAi技术的最大应用价值,使之服务于新时代的农业发展。     

日本专利厅调查RNAi的专利动向RNAi医药方面中国在紧追

日本专利厅制作完成了2005年度的专利申请技术动向调查报告书，2006年4月公布。关于2005年度的主题之一的RNAi指出，专利（PCT）申请件数以美国为中心正在急剧增加。而且，从相关论文的分析结果显示出，在RNAi医药领域中中国的影响正在增强。