乳链菌肽高产菌株的选育及其基因定位

以乳酸乳酸球菌7962为原始菌株,用紫外线、LiCl、(60)~Co及8-MOP+NUV等多种理化诱变剂对其进行诱变处理,获得一株乳链菌肽高产突变株AL2。其效价稳定在2300～2500Iu/ml。经DNA杂交证实,编码乳链菌肽的前体基因位于染色体上,其遗传性状是稳定的。毒理试验表明AL2及其产物属于实际无毒类物质。     

乳酸乳酸球菌AL2产生的乳链菌肽的提纯和性质

用NaCl饱和的乳酸乳酸球菌(Lactococcus lactis subsp. Lactis)AL2发酵液经正丙醇提取和CM-Sephadex C-25柱层析,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的乳链菌肽组分,比活力从24427IU/mg提高到39865IU/mg,活力回收为41.7％。Α—胰凝乳蛋白酶可使乳链菌肽丧失活性;在低pH条件下,乳链菌肽对热较稳定;对许多革兰氏阳性菌有强烈抑制作用,而对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌没有作用。     

乳酸乳球菌AL2基因文库的构建及乳链菌肽生物合成基因簇的筛选

用本实验室获得的乳链菌肽高产菌株乳酸乳球菌AL2总DNA为供体,以λ EMBL3为载体,构建了该菌株的基因文库,共获得3900多个噬斑。通过Southern杂交、PCR扩增及DNA序列测定,证实从该文库中筛选到一个含有完整乳链菌肽生物合成基因簇的重组噬菌体λHJ\|3。     

乳链菌肽产生菌的定向筛选及发酵产物的鉴定

利用乳链菌肽产生菌中nip^+nis^rsuc^+紧密连锁的原理,在添加乳链菌肽、蔗糖及溴甲酚紫的选择培养基上,从牛奶样品中定向筛选乳链菌肽产生菌。对筛选到的L. lactis1409菌株发酵产物的分析鉴定结果揭示:该产物对多种革兰氏阳性菌有强烈抑制作用,而对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌无效,在pH值低的条件下对热稳定,对α—胰凝乳蛋白酶敏感,具有生物活性的蛋白质的分子量与乳链菌肽相当,而1409菌株的质粒分布与L. laclisATCC11454和L. lactis 7962不同,说明筛选到的L. laclis 1409菌株确是一株新的乳链菌肽产生菌。     

诱变选育雄烯二酮高产菌株及其发酵条件研究

以一株降解植物甾醇产生雄烯二酮的分枝杆菌为研究对象,先后利用亚硝基胍(NTG)和N+注入技术对其进行诱变处理。通过考察NTG浓度和N+注入剂量对菌株诱变效果的影响,确定了最佳诱变条件为NTG浓度为0.6 mg/mL,N+注入剂量为60×1011ions/cm2。最终选育出一株高产突变株Mycobacterium sp.N-2,其生产雄烯二酮的能力较出发菌株提高了37.8%,且传至第七代仍基本稳定。进一步研究了初始pH值、接种量和摇床转速等对高产突变菌株发酵能力的影响,确定了最佳发酵条件为初始pH值7.5,接种量12%,摇床转速260 r/min。     

乳链球菌肽高产菌株发酵条件的研究

对乳链球菌肽（Ｎｉｓｉｎ）高产菌株９７０６的发酵条件进行了研究,在Ｍ１７培养其中,效价远远低于ＣＭ１,正交实验法得出最适碳源、氨源、生长因子分别为蔗糖、鱼蛋白胨、酵母粉,并用正交实验优化了发酵培养基各组成的浓度。Ｎｉｓｉｎ的产生显示了初级代谢动力学特征,发酵的最适温度是３５℃,培养基最适初始ＰＨ为７．０－７．５,最适接种量５％－６％,振荡培养效价稍高于静止培养。     

乳链菌肽前体基因（nisZ）在乳酸乳球菌中的克隆和表达

用PCR技术从克隆有完整乳链菌肽生物合成基因簇（来自于乳链菌肽高产菌株L.lactis AL2)的重组噬菌体λHJ-3中扩增了编码乳链菌肽的前体基因,与pMG36e连接得到重组质粒pHJ201,用电击转化法将pHJ201转化到L.lactis NZ9800中,经活性测定和Tricine－SDS－PAGE电泳证实乳链菌肽前体基因获得了功能表达。DNA序列分析表明乳链菌肽高产菌株L.lactis AL2产生的是NisinZ。发现pHJ201d L.lactis NZ9800 中有良好的稳定性。     

红酵母类胡萝卜素高产菌株的筛选及其发酵生理学条件研究

从数株红酵母中选出了1株产类胡萝卜素能力较强的红酵母RY－98（生物量,类胡萝卜素含量和产量分别为19．9g/L,334.8ug/g和6．7mg/L);研究了该菌株产类胡萝卜素的最适营养与环境条件,获得了最佳的发酵生理学条件;葡萄糖40g/L,(NH4)2SO4 10g/L,酵母膏3g/L,蕃茄汁2mL/L,花生油0.5mL/L,接种量30mLL初始pH6.0和通气量（培养基装置040ml/250mL:,在此初步优化的培养条件下,红酵母RY－98经72小时摇瓶发酵其生物量,类胡萝卜素含量和产量分别可达26．8g/L,386.9ug/g和10．4mg/L,依次比初筛中提高了34．7％,15．6％,和55．2％。     

固定化乳酸乳球菌连续生产Nisin的研究

以海藻酸钙为材料 ,固定乳酸乳球菌 (Lactococcuslactissubsp .lactis)SM5 2 6 ,研究不同条件对Nisin合成的影响。结果表明 ,利用 2 %海藻酸钠在 1 0mmol LCaCl2 条件下 ,得到的固定化细胞颗粒稳定性较好 ,可维持 90h无破裂 ;在发酵过程中SYS3培养基中的无机盐成分尤其磷酸盐对固定化颗粒有破坏作用 ;用mSYS3培养基代替SYS3 ,通过 72h三批次循环的半连续培养 ,Nisin活性为 85 0IU mL ,无明显的细胞渗漏现象。连续化生产 70h ,Nisin活性达 1 1 5 0IU mL ,相当于游离细胞的发酵水平。     

一个含有乳链菌肽抗性基因的乳酸乳球菌质粒pTS50的鉴定

在添加乳链菌肽、乳糖及溴甲酚紫的M1 7选择培养基上 ,从 1 97个新鲜牛奶样品中筛选到 3株乳链菌肽抗性菌株 ,PCR扩增证实它们都含有乳链菌肽抗性基因。菌种生理生化特性鉴定及特异性 1 6SrDNAPCR扩增产物的序列测定结果表明这 3株菌都属于乳酸乳球菌乳酸亚种。质粒转化实验发现乳酸乳球菌乳酸亚种TS 1 640中的乳链菌肽抗性基因位于一个约47kb的大质粒pTS50上。BamHI、EcoRI、HindⅢ、NcoI、PstⅠ酶切分析和Southern杂交 ,进一步将乳链菌肽抗性基因定位于pTS50的一个约 1 9kbEcoRI酶切片段中     

人谷胱甘肽硫转移酶A1在乳酸乳球菌中的表达及活性研究

用RTPCR技术从人肝总RNA中分离扩增了人谷胱甘肽硫转移酶A1基因的cDNA序列,克隆至大肠杆菌表达质粒pET23b,采用蛋白表达筛查法及DNA测序证明该cDNA序列完全正确。重组质粒pET23bhgst转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导获得高效表达的可溶性hGSTA1产物,其表达量约为大肠杆菌可溶性总蛋白的40%。将hGSTA1cDNA亚克隆至乳酸乳球菌表达载体pMG36e,电穿孔法转化乳酸乳球菌MG1363获得hGSTA1乳酸乳球菌表达株。SDSPAGE及Western杂交分析表明该菌株表达预期大小的hGSTA1融合蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化获得的hGSTA1蛋白具有较高的谷胱甘肽硫转移酶活性。具hGSTA1酶活性的乳酸乳球菌工程菌可望应用于研制防癌保健乳制品。     

乳酸链球菌nisk基因与细菌性双成分调节子的研究

本研究通过对乳酸链球菌亚种Ｎ８的Ｎｉｓｉｎｚ结构基因下游基因区的分子克隆、序列分析和ＯＲＦ的检测,揭示出一个属于细菌性双成份调节子系统的基因,ｎｉｓＫ,其起始区略与ｎｉｓＲ末端重叠,并发现ＮｉｓＲ和ｎｉｓＫ同被转录一个多顺反子ｍＲＮＡ。在ｎｉｓＫ编码区后,有一个ρ非依赖性终止子。     

细菌产木聚糖酶发酵条件的研究*

研究了碳源、氮源以及其他因子对木聚糖酶高产菌ＷＬＵＮ０２４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）产酶的影响,结果表明在麸皮６ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．８ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．４ｇ／Ｌ、接种量５％－１０％的条件下,３７℃培养３６ｈ,其木聚糖酶活力可达６００ＩＵ／ｍＬ。同时研究了在较优条件下该菌的摇瓶产酶曲线。     

乳酸链球菌肽发酵动力学的研究

提出了在恒定不同pH的发酵条件下,乳酸链球菌SM526的菌体生长、底物消耗、乳酸及Nisin产生的动力学模型。菌体生长、乳酸及Nisin产生用逻辑方程描述,而底物消耗是菌体生长和乳酸产生速率的函数。模型表明,乳酸链球菌SM526菌体生长和乳酸产生的最佳pH为7．0,而Nisin产生的最佳pH却为6．5。     

深黄被孢霉高产脂变株的选育及其发酵的研究

以深黄被孢霉（Mortierellaisabellina）AS3．3410为出发菌株,经紫外线,硫酸二乙酯和亚硝基胍复合诱变处理,选育成功高产脂深黄被抱霉M018变株,其摇瓶培养菌体油脂含量达65．6％,比出发菌株提高133％。60m³罐三级发酵培养菌体油脂含量高达79．2％,生物量达37．8g／L．气相色谱分析表明变株M018r-亚麻酸的含量比出发菌株提高了53％。连续传代试验表明M018是一稳定的变株。该变株油脂合成的最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为酵母膏,最佳C／N为