我国生物技术的研究进展

20世纪70年代以来,由于DNA重组和转基因技术等一系列现代生物技术的建立,生物技术已成为当今世界发展最快、最活跃的高新技术领域之一。目前,生物技术已在农业、医药、轻工、食品、环保、海洋和能源等方面得到应用,并在医药、农业等领域取得重大突破,其成果的转化和利用对上述行业的技术更新和产品换代发挥着越来越重要的作用,医药生物技术的新型产业正在形成。世界各国尤其是发达国家纷纷把生物技术作为21世纪的关键技术给予高度重视和支持,以增强本国的实力和国际竞争力。现就我国生物技术的发展趋势综述如下。1我国生物技术领域取得的…     

镜像克隆系统:DNA重组技术的新进展

镜像克隆系统是近几年新发展起来的一种DNA重组技术,它突破了传统重组限制酶切及连接的繁琐和费时,利用重组酶使外源基因快速、方便地进行亚克隆和表达。本阐述了镜像克隆系统的结构、作用原理及特点。     

应用Red重组工程技术建立asd基因缺失的大肠杆菌DH108菌株

目的：建立一株新遗传表型的大肠杆菌DH10BAasd菌株。方法：应用pKD46介导的重组系统、kan／kil选择反选择系统、双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,在菌株DH10B体内,对其染色体上的asd基因进行了基因敲除。结果：建立了一株二氨基庚二酸（DAP）营养缺陷型重组大肠杆菌DH10BAasd。结论：为进一步建立以大肠杆菌DH10B为载体的DNA疫苗或基因治疗载体奠定了基础。     

我国农业生物基因工程安全评价的现状、问题与建议

我国农业生物基因工程安全评价的现状、问题与建议吕建秋雷茂良石燕泉程金根（华南农业大学广州５１０６４２）（农业部科技质标司北京１０００２６）农业生物基因工程是指利用载体系统的重组ＤＮＡ技术及利用物理、化学和生物等方法把重组ＤＮＡ导入农业生物体内的技...     

应用Red重组工程技术建立asd基因缺失的大肠杆菌DH10B菌株

目的:建立一株新遗传表型的大肠杆菌DH10BΔasd菌株。方法:应用pKD46介导的重组系统、kan/kil选择反选择系统、双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,在菌株DH10B体内,对其染色体上的asd基因进行了基因敲除。结果:建立了一株二氨基庚二酸(DAP)营养缺陷型重组大肠杆菌DH10BΔasd。结论:为进一步建立以大肠杆菌DH10B为载体的DNA疫苗或基因治疗载体奠定了基础。     

DNA重组技术的研究综述

DNA重组技术,即DNA克隆技术的研究和运用是现代生物学发展的一个重要分支,是分子生物学发展的突出领域。本文介绍了DNA重组的类型及相关的生物学概念;综述了目前已报道的传统的酶切-连接经典克隆方法、位点特异性重组克隆方法、以及同源重组克隆方法,重点阐述了各自的原理、步骤、特点及实际应用等方面;最后归纳总结了各种方法的优缺点和应用范围,并对该技术的科研成果进行了回顾和对未来的研究进行了展望。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3．1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1—egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45％。瞬时转染pcDNA3．1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

重组昆虫杆状病毒构建和筛选技术进展

昆虫杆状病毒作为高效的真核表达载体,现已广泛应用于各种外源目的基因的表达。但由于重组病毒产生的比例很低（通常只有0.1%～1%）,成为制约该系统应用的技术瓶颈。本文概括了近年来发展的重组病毒的构建和筛选方法,主要介绍了杆状病毒的线性化技术和利用大肠杆菌-昆虫细胞穿梭载体构建并筛选重组杆状病毒的技术进展。     

大肠杆菌无痕重组的策略与应用

Red同源重组技术发展迅速,已经广泛应用于大肠杆菌基因的敲除、插入与替换。与传统的DNA有痕重组技术相比,基于Red重组原理的DNA无痕重组技术,能够更为精确、快速、高效地修饰大肠杆菌基因组中的目标基因,且在基因组中不残留任何外源片段,因此不会影响后续的基因操作与基因表达。从Red同源重组的原理出发,简要综述了近年来在大肠杆菌中广泛使用的无痕重组技术的原理及操作策略,并对比分析了各种方法的优势与不足;同时,还介绍了DNA无痕重组技术在大肠杆菌基因修饰中的应用情况。     

工业微生物代谢途径调控的基因敲除策略

基因敲除技术是一项重要的分子生物学技术,在工业微生物代谢工程中具有广泛应用。以下从基因敲除技术的遗传重组原理出发,总结了基因敲除策略的类型、特征和应用,重点介绍了采用线性双链DNA的λRed同源重组系统、使用环状质粒载体介导的单交换或双交换同源重组策略以及采用转座酶介导的转座重组等几种主要的基因敲除方法,进一步展望了基因敲除技术的发展前沿和应用前景。     

细菌制造牛生长激素为提高牛肉、牛乳产量开新途径辟

美国Genentech公司和Mosanto公司于三月十三日宣称:利用重组DNA技术成功地制造出促进牛生长的激素。利用重组DNA技术转向农业产品的制造是由Genentech发起的。这两个公司今后还要共同研究各种动物激素,可望利用遗传工程提高农业生产做出贡献。     

幽门螺杆菌STM文库重组质粒的构建

目的:应用信号标签突变技术(Signature tagged mutagenesis,STM)构建幽门螺杆菌突变体文库重组质粒。方法:采用平末端内切酶随机酶切幽门螺杆菌基因组DNA,并回收300～500bp片段(记作Fr),基因重组技术构建重组质粒pID700-Fr,电转化E.coliDH5α筛选阳性克隆,提取重组质粒酶切鉴定。结果:成功构建了1200个幽门螺杆菌STM文库重组质粒。结论:STM技术可用于幽门螺杆菌致病以及耐药相关基因的筛选,为幽门螺杆菌致病及耐药机理的研究奠定了基础。也将为幽门螺杆菌的治疗提供新的药物靶点。     

梅毒分子生物学实验诊断方法的研究进展

梅毒的临床表现十分复杂,诊断主要依靠实验室检测方法。传统的梅毒实验室诊断方法暴露出诸多缺点,本文综述了国外一些分子生物学技术用于梅毒实验室诊断的方法(以基因工程重组抗原的血清学方法和聚合酶链反应)的研究进展。     

用基于“Neo/E”的技术构建重组质粒

根据重组工程原理,建立了一种用于构建重组质粒的 “neo/E”（抗生素/单酶切位点）选择与反选择新方法。首先采用 PCR方法扩增出线性打靶分子：然后进行两步体内同源重组,（1）neo/E基因敲入,重组子呈现neo抗性表型;（2）目的基因替换neo/E基因。用限制酶E消化时,发生第二步重组的DNA分子不能被消化,能够转化大肠杆菌受体菌DH5α。应用该方法构建了重组质粒pGL3-Basic PC1900T。PCR及测序鉴定证明：外源片段重组率为20%,所建立的重组工程选择与反选择新技术为质粒构建提供了新的解决方案。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

重组工程及其应用

随着功能基因组研究的需要 ,新近建立起一项新型高效的基于体内同源重组的遗传工程技术———重组工程技术。重组工程可定义为 :基于噬菌体短同源序列重组功能的遗传工程 ,或者基于同源重组的遗传工程。λ噬菌体Red系统完全不同于传统的依赖RecA的大肠杆菌重组系统 ,特点是使用长度仅为 <5 0个碱基的同源臂高效率地催化体内同源重组反应。体内重组过程不再需要预先构建含有同源序列的质粒或噬菌体的中间产物 ,只需要简单在体外合成寡核苷酸同源序列 ,或者用PCR方法合成线性打靶序列。重组反应不依赖大肠杆菌RecA系统 ,不需要限制性内切核酸酶和连接酶 ,不需要复杂的体外重组操作 ,可在大肠杆菌体内对染色体DNA、对BAC和PAC质粒或普通质粒载体进行精确的修饰 ,包括真核或原核细胞基因组DNA的基因敲除、基因敲入、基因克隆和各种突变体的引入。由于该技术具有高效率、简单性和应用的广泛性等独特优点 ,将来完全有可能取代传统的遗传工程技术。主要介绍了λ噬菌体Red重组酶系统及重组工程在功能基因组研究方面的应用与进展     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

重组酶聚合酶扩增技术：一种新的核酸扩增策略

重组酶聚合酶扩增 (recombinase polymerase amplification, RPA)是近年来兴起的一种等温核酸扩增技术,它比聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)及其它等温扩增技术更快速、便捷、高效。本文将详细介绍RPA这项新颖的技术,并对其在医疗诊断、农业、食品、生物安全等方面的研究及应用进展进行综述。期望这项技术得到更多的关注,使其发展更加完善,将来在更多的领域充分发挥作用,甚至书写核酸检测历史新篇章。     

PCR快速筛选重组克隆方法的建立

目的：建立一种PCR技术快速筛选重组克隆的方法。方法：用Triton裂解菌落作为模板,以pMD-18T载体多克隆位点设计的引物与目的基因猪β-INF引物设计不同组合,PCR扩增待检重组克隆。结果：PCR技术快速筛选出猪β-INF重组克隆并鉴定了插入方向。结论：在采用PCR方法直接使用细菌菌落参与反应可以快速筛选重组克隆。     

DNA重组技术生产人胰岛素

人胰岛素是用DNA重组技术生产的第一个药物。这个产品的研究始于管理大规模DNA重组的联邦条例制订或DNA重组技术产品的商业开发之前。本文叙述了为争取大规模进行生产的许可与保证重组DNA产品的鉴定及安全所采取的措施。DNA重组技术的基础研究将继续在生命科学研究中发生巨大的影响,而在它在商业上的应用将取决于经济状况与投入的资本的效益。