EB病毒及其疫苗的研究进展

EB病毒广泛存在于人群中,它的潜伏感染与多种疾病密切相关,包括鼻咽癌等恶性肿瘤,研制疫苗用于EB病毒相关疾病的预防和治疗十分必要。本综述了EB病毒的结构及基因表达特点、EB病毒潜伏期感染基因表达及潜伏期基因产物的功能,以及研制EB病毒疫苗的靶抗原的选择。     

EB病毒融合蛋白Zta-P54在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

为获得能用于检测试剂盒的高纯度具有活性的EB病毒融合蛋白,以pGEX5T-BZLF1-BMRF1质粒为模板进行PCR扩增得到BZLF1-BMRF1融合基因,将其插入pET32a中,构建表达质粒pET32a/BZLF1-BMRF1。将该质粒转入大肠杆菌培养,经IPTG诱导获得Zta-P54融合蛋白。用DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE和Western blot对Zta-P54融合蛋白进行鉴定。双酶切鉴定和测序结果显示成功构建pET32a/BZLF1-BMRF1质粒,SDS-PAGE显示该蛋白相对分子量约为60kD,与预期结果一致。纯化后获得纯度为96.5%的Zta-P54融合蛋白。Western blot检测该蛋白有良好的生物活性和反应特异性。因此,成功构建pET32a/BZLF1-BMRF1质粒,在大肠杆菌中可溶性表达。最终获得纯度高、生物活性好的融合蛋白。     

EB病毒潜伏膜蛋白1的B细胞表位预测

目的 预测EB病毒潜伏膜蛋白1(Latent Membrane Protein 1,LMPl)的B细胞表位.方法 基于EB病毒基因组序列,采用DNAStar Lasergene软件包中的Protean软件,对LMP1的亲水性,表面可能性,抗原指数及其二级结构中的柔性区域进行分析,并结合吴玉章的抗原指数预测法预测其B细胞表位.结果 B细胞表位最有可能位于潜伏膜蛋白N端第356-358,2-19,249-314区段或其附近,而潜伏膜蛋白N端第185-223区段内或附近也可能存在B细胞表位.结论 用多参数预测EB病毒LMP1的B细胞表位,为鼻咽癌的筛查及抗肿瘤转移靶向治疗的分子免疫学研究奠定基础.     

HIV-1潜伏感染体外实验模型研究进展

潜伏感染的静息记忆CD4+T细胞是清除HIV-1病毒的一个重要障碍。处于潜伏状态的病毒多以原病毒c DNA的形式整合至宿主基因组中,但是病毒基因表达处于沉默状态,因此潜伏感染的细胞难以受到病毒的致细胞病变效应或机体特异性细胞毒性T细胞的杀伤,也不易受到抗反转录病毒治疗药物的作用。如何减少潜伏感染的细胞储存库是艾滋病治疗中亟需解决的一个问题。体内及体外HIV-1潜伏感染模型有助于深入了解HIV-1潜伏感染的建立、维持或打破机制,评价潜伏感染再激活剂的活性。在此侧重于介绍采用永生化细胞系、原代静息CD4~+T细胞或活化的CD4+T细胞建立的HIV-1潜伏感染体外实验模型。     

EB病毒诱发人B细胞淋巴瘤的分子病理特性

EB病毒 (EBV ,Epstein Barrvirus)与人类多种肿瘤有关 ,尤其是与鼻咽癌和淋巴瘤的关系密切。为此研究了EB病毒在huPBL SCID嵌合体小鼠体内诱发人B细胞淋巴瘤的分子特性及肿瘤发生机制。从健康成人外周血分离出淋巴细胞 ,将之移植到SCID小鼠腹腔内 ,实验感染EBV ,观察肿瘤的形成 ;采用单向免疫扩散法连续监测小鼠血清中人IgG的含量。分别用PCR方法检测肿瘤组织中是否存在人Alu序列 ,原位杂交检测肿瘤组织中EB病毒小RNA分子EBER 1;免疫组织化学方法检测人白细胞分化抗原 (CD4 5、CD2 0、CD4 5RO、CD3) ,病毒基因(LMP1、EBNA2、BZLF1)的表达 ,以及细胞瘤基因蛋白 (p5 3、C myc、Bcl 2、Bax)在诱发肿瘤中的表达情况。结果发现 ,实验中 34只感染EBV的huPBL SCID小鼠有 2 4只诱发出肿瘤 ,根据病理形态学特征、Alu PCR和免疫标志均证实诱发瘤是人源性B淋巴细胞肿瘤。原位分子杂交显示肿瘤细胞核内存在EBER 1,少数瘤细胞表达EB病毒BZLF1蛋白阳性 ,部分瘤细胞表达LMP1和EBNA2蛋白阳性。连续监测 12只huPBL SCID小鼠血清中人IgG含量 ,发现IgG水平随诱瘤时间延长和肿瘤生长有逐渐增高趋势。免疫组化显示诱发的 2 4例淋巴瘤组织p5 3、C myc、Bcl 2和Bax蛋白表达阳性率分别为 83.33%、10 0 %、95 .83%、91.6 7%。结果     

EB病毒BNLF-1基因的分子生物学研究进展

位于EB病毒基因组U₅-TR区内的BNLF-1基因,其转译产物为潜伏膜蛋白(latent membrane protein1, LMP-1),由于LMP-1可以导致细胞转化并在EB病毒致癌过程中具有重要作用,因而成为近年来EB病毒分子生物学及相关肿瘤如人鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、何杰金氏病等疾病病因发病学研究的热点,并取得了一批有重要意义的成果,文章从BNLF-1的基因结构及表达调控, LMP蛋白的结构及生化功能, LMP-1的生物学功能和LMP-1研究进行评述.     

EB病毒免疫逃逸的分子机制

EB病毒(Epstein-Barr vius,EBV)是一种最广泛的对人类感染的γ疱疹病毒,与人类多种疾病尤其是恶性肿瘤有关。其致病的一个重要条件是能够在人体B细胞中长期潜伏,并且在人体免疫力低下时被激活并增殖,这表明EB病毒存在逃逸宿主细胞免疫的机制。从潜伏期EB病毒基因表达的下调、干扰抗原加工和提呈、调节细胞毒性T细胞(Cytotoxic lymphocyte,CTL)免疫应答、干扰细胞因子的作用、干扰CTL的活动及抑制宿主细胞凋亡、抑制辅助性T细胞1(Helper T cell 1,Th1)免疫应答等方面,对EB病毒免疫逃逸的分子机制作一简要综述。     

裂解性复制诱导产生可视化重组Epstein Barr病毒

为了在病毒的整个基因组中研究基因的功能,分析基因与基因之间的相互作用,含有整个野生型EB病毒(EBV)基因组的BAC-EBV质粒(p2089),首先被转染EBV阴性的HEK293细胞,经潮霉素筛选建立了HEK293/p2089稳定细胞系.再构建pcDNA3.1( )/BZLF1和pcDNA3.1( )/BALF4真核表达质粒,共转染至HEK293/p2089细胞内,诱导EBV裂解性复制产生可视化的重组EBV颗粒.重组EBV颗粒感染Raji细胞,在倒置荧光显微镜下和流式细胞仪记数GFP阳性细胞,根据这些"绿色Raji单位"确定病毒的滴度.在国内首次建立这种以细菌人工染色体(BAC)为基础的EBV感染性克隆技术,将允许对EB病毒基因组中任何基因的任何遗传修饰,为在整个基因组中对EB病毒基因功能的研究奠定了基础,也为对EBV与其相关的肿瘤如鼻咽癌发生机理的研究建立了新的技术平台.     

Epstein-Barr病毒特异性T细胞对重组痘苗病毒表达LMP和EBNA2的靶细胞的识别

本文用EB病毒转化自体淋巴细胞所建立的类淋巴母细胞系(LCL),以及用EB病毒潜伏感染膜蛋白(LMP)基因和核蛋白-2(EBNA2)基因与痘苗病毒重组的重组病毒(Vac-LMP和Vac-EBNA2)感染的自身纤维母细胞,同时作为刺激细胞和靶细胞,以~(51)Cr释放法检测5例血清中EB病毒VCA—IgA抗体阳性者及1例阴性健康者外周血单个核细胞(PBMC)的特异性T细胞杀伤效应。结果表明,用自身LCL激活的EB病毒特异性T细胞杀伤效应高峰出现在第14～28天;参与杀伤性细胞免疫反应的T细胞亚群主要是T3、T8阳性的细胞毒性T细胞,其对靶细胞的识别及杀伤受HLA-I的限制。用重组牛痘病毒感染的纤维母细胞作靶细胞或刺激细胞,有1例供者可接受LMP,另1例可接受EBNA2的刺激,并对相应的靶细胞产生特异性T细胞杀伤反应,表明EB病毒-LMP和EBNA2可能既是EB病毒特异性T细胞的刺激抗原,又是其识别的靶抗原。     

携带绿色荧光报告基因的EBV-LMP1真核表达载体构建与鼻咽癌细胞中的表达

潜伏膜蛋白1(LMP1)是由EB病毒编码的致瘤蛋白,众多研究表明LMP1蛋白可通过NF-κB、p38 MAPK、c-JNK等多条重要信号通路引起鼻咽癌细胞的生物学行为改变。我们从EB病毒阳性的B95-8狨猴淋巴瘤细胞中克隆EB病毒LMP1 c DNA,构建携带绿色荧光基因的真核表达质粒p IRES2-Zs-Green1-LMP1,通过脂质体转染的方法将质粒导入鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2中,利用质粒所携带的绿色荧光蛋白表达粗略计算转染的效率,通过免疫细胞化学(ICC)、RT-PCR、Western-Blot检测该质粒的表达。本实验室所构建的p IRES2-Zs-Green1-LMP1表达质粒能在鼻咽癌细胞内表达LMP1蛋白,为后续的实验研究奠定基础。     

树突状细胞、CD8~+ T细胞与单纯疱疹病毒1型的潜伏感染

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)属于疱疹病毒α亚科,是一种在人群中广泛传播的病原体.HSV-1病毒感染机体后可在宿主神经系统中建立起长期的潜伏感染,并不时地从潜伏状态"重激活"导致临床症状及体液排毒.病毒抗原特异性CD8+T细胞具有抑制神经细胞中HSV-1"重激活",维持病毒潜伏感染状态的能力.本文从树突状细胞对病毒抗原的递呈,病毒抗原特异性CD8+T细胞的来源、种类、抗原特异性及功能等方面对近年来的研究进展做一综述.     

EB病毒潜伏膜蛋白1介导c-Jun/JunB活性异源二聚体形成

EB病毒编码的潜伏膜蛋白1可以活化AP-1转录因子, 其中c-Jun和JunB的相互关系和复杂作用一直是人们关注的焦点. 以Tet-on-LMP1 HNE2鼻咽癌细胞系为动态研究模型, 主要应用c-Jun/Jun B双染色间接免疫荧光法联合激光共聚焦荧光显微镜技术、Western blot方法、免疫共沉淀-Western blot方法以及Super-EMSA方法, 同时, 结合信号转导通路研究中的阻断策略, 研究证实EB病毒编码的潜伏膜蛋白1介导c-Jun/Jun B异源二聚体形成, 而且该二聚体具有与DNA结合活性. 该研究为LMP1调控下, AP1二聚体家族成员在不同时空信号传导通路中的动态组合和作用模式提供了新的机制.     

北京地区近5年来儿童EB病毒感染疾病中BZLF1及其启动区Zp基因特征分析

为了解儿童原发性Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染流行株BZLF1基因及其启动区Zp的基因特征。本文对北京儿童医院2006年至2011年收治的EBV感染传染性单核细胞增多症(EBV-associated infectious mononucleosis,EBV-IM)134例和EBV相关噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(EBV-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis,EBV-HLH)32例患儿的外周血来源的DNA进行了EBNA3C、BZLF1和Zp基因片段的扩增分析。根据EBNA3C基因片段扩增产物的大小进行EBV-Ⅰ/Ⅱ分型,对BZLF1和Zp基因扩增产物进行直接序列测定,并用BioEdit 7.0.9进行序列分析。实验显示①儿童EBV感染流行株以EBV-I型为主,占97.2%(140/144),EBV-Ⅱ型为2.8%(4/144);②共检测出3种BZLF1基因型,12种亚型(包括6种新发现的亚型)。BZLF1-A型和BZLF1-B型两基因型在两种疾病中的分布无统计学差异(P=0.083)。BZLF1-A1是儿童EBV感染性疾病中的常见基因型。BZLF1-A型第一内含子以3个29bp重复序列为主,而B型以30bp重复序列为主(P=0.000),且重复序列的个数波动于1-13个不等;③共检测出Zp-P、Zp-V3、Zp-V4、Zp-V1四种Zp基因型,并且这四种基因型在EBV-IM和EBV-HLH两种疾病中的检出率无统计学差异(p值分别为0.272、0.252、1.0、1.0);④BZLF1和Zp基因连锁分析显示,BZLF1-A1基因型毒株的Zp基因分型以Zp-V3为主(P=0.000),而BZLF1-B4基因型以Zp-P型为主(P=0.000)。EBV-Ⅰ+BZLF1-A1与Zp分型中Zp-V3高度连锁(P=0.000);EBV-Ⅰ+BZLF1-B4与Zp-P高度连锁(P=0.000)。结果证实:①BZLF1-A1是儿童EBV感染的常见基因型。BZLF1-A型其第一内含子重复序列以29bp为主,而BZLF1-B型则以30bp的重复序列为主。②Zp-P和Zp-V3是儿童EBV感染的常见Zp基因型,二者检出率相似。③BZLF1-A1型的Zp分型以Zp-V3为主,而BZFL1-B4型则以Zp-P分型为主。EBV-Ⅰ+BZLF1-A1与Zp分型中Zp-V3高度连锁,而EBV-Ⅰ+BZLF1-B4与Zp-P高度连锁。     

病毒潜伏感染的免疫应答特点

在儿童的早期,单纯疱疹病毒1型能在感觉性神经元中形成潜伏性感染,然后成为复发性疾病的储存场所。在感觉神经元中消灭潜伏的单纯疱疹病毒1型目前尚不可能,但现代研究发现,宿主免疫在维持该病毒潜伏状态上起一定的作用。本文提出证据,证实CD8T细胞调节潜伏状态时单纯疱疹病毒1型基因的表达。     

EB病毒BNLF—1基因研究的新进展

EB病毒广泛存在于人群中,它的潜伏感染与鼻咽癌的发生密切相关。EBV在潜伏感染的过程中表达一种潜伏膜蛋白1（LMP1）,具有致瘤性,因此编码LMP1的基因BNLF－1被认为是EBV的瘤基因。BNLF－1基因具有广泛的生物学功能,在鼻咽癌的发生发展过程中起重要作用。近年的研究表明,鼻咽癌来源的EBV与标准株EBV比较存在相当的变异,而鼻咽癌来源的LMP1在致瘤性上也明显强于标准株LMP1。本文将综述BNLF－1基因生物学功能研究方面的新进展,并简要介绍变异型LMP1研究的新成果。     

EB病毒疫苗的研究进展

EB病毒是一种感染最广泛的人类γ疱疹病毒,与传染性单核细胞增多症、鼻咽癌、Hodgkin’s淋巴瘤以及Burkitt淋巴瘤等发生密切相关。预防和治疗EB病毒相关疾病一直是研究的热点,预防性疫苗主要以病毒包膜糖蛋白gp350为靶点,刺激机体产生抗体以阻止病毒感染;已有多种疫苗进入临床试验,用于预防传染性单核细胞增多症和器官移植后淋巴增殖性紊乱等疾病,并取得良好的试验结果。治疗性疫苗则以病毒复制感染过程中表达的病毒核抗原(EBNAs)和潜伏膜蛋白(LMP1和LMP2)为免疫治疗靶点,刺激机体产生特异性细胞免疫应答,增强细胞毒性T细胞杀伤肿瘤作用。国内外均已有疫苗进入针对鼻咽癌等肿瘤免疫治疗的临床试验,试验结果表明疫苗兼具良好的安全性和免疫原性。本文还综述EB病毒疫苗研究的最新方法、策略和成果,并探讨其中可借鉴的技术和思路,为EB病毒疫苗的研究提供潜在可行的新途径。     

EB病毒编码的潜伏膜蛋白与泛素蛋白酶系统

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是人类疱疹病毒,与淋巴系统、上皮细胞肿瘤相关。其编码潜伏性膜蛋白(LMPl、LMP2A和LMP2B)特别是LMP1,由于它是众多EBV编码蛋白质中唯一被明确证明能恶性转化原代B细胞、鼠成纤维细胞和人上皮细胞的蛋白质,所以被列为癌基因。最近对潜伏膜蛋白的研究显示．潜伏膜蛋白与病毒利用泛素蛋白酶系统来达到逃避宿主免疫应答等机制有关,研究这个过程也许可以开发新的策略来防治EBV相关肿瘤。     

EB病毒潜伏膜蛋白1调节EGF受体核移位

EB病毒编码的病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)是重要的致瘤蛋白, 一直以来是EB病毒致瘤机制的研究核心. 传统的受体学说认为, 细胞膜受体作为第一信使, 在细胞膜上与其配体结合发挥生物学效应. 但近年来, 对EGFR家族成员受体核移位在基因表达调控中意义的研究, 拓宽了人们对细胞膜受体生物学功能的认识. 利用我们建立的Tet-on系统调控LMP1表达的细胞系, 采用Western blot和激光共聚焦显微镜等技术证实, LMP1可调控EGFR的核移位, 并呈一定的剂量效应. 通过GFP与EGFR及不同突变体的融合蛋白在细胞内的表达发现, EGFR的核定位信号在其核移位过程中起着一定的作用, 并初步发现LMP1调控EGFR核移位为配体非依赖性.     

EB病毒致病机制研究进展

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一种常见的人类4型疱疹病毒,原发感染后可终身携带病毒。EBV感染无法从宿主中清除,呈现潜伏状态,一旦激活即可成为很多疾病的相关病因,与人类多种疾病特别是恶性肿瘤相关,包括Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等。EBV致病机制复杂多样,目前致病机制的具体分子遗传机制尚未明确。本文主要从EBV与宿主细胞相互作用、免疫逃逸、EBV感染周期表达的相关产物与宿主的相互作用等几个方面,综述目前EBV致病机制的研究进展。     

用PO4细胞为靶细胞检测人血清中Epstein-Barr病毒IgA/MA抗体以诊断鼻咽癌

近年来,常用未经丙酮固定的、由丁酸和巴豆油激活的B95-8细胞或P3HR-1细胞为靶细胞,检测人血清中EB病毒IgA/MA抗体以早期诊断鼻咽癌,效果良好。但由于B95-8细胞含有多种EB病毒抗原,不能用丙酮固定,需多次离心沉淀,在浮悬状态下检测,技术比较复杂。