Isolation of AccGalectin1 from Apis cerana cerana and its functions in development and adverse stress response

The galectins are a family of lectins that play important roles in development, immunity, and the regulation of cellular responses. Much research has focused on the functions of galectins in mammals, though less in insects. Here, we identified the AccGalectin1 gene in Apis cerana cerana for the first time and explored its functions. The open reading frame of AccGalectin1 is 1449 base pairs and encodes a 482-amino-acid protein. AccGalectin1 expression was high during the transition between developmental stages and was high in the head, thorax, and epidermis compared with its levels in other tissues. In addition, the expression of AccGalectin1 was induced by several adverse stresses, including both abiotic and biotic stresses. A disk diffusion assay of recombinant AccGalectin1 protein revealed possible roles in protecting cells from oxidative stress. Furthermore, the expression levels of multiple oxidative genes (AccCAT, AccTpx1, AccTrx2, etc) were increased after AccGalectin1 was knocked down in Apis cerana cerana using RNA interference. We also observed that the malondialdehyde content in the AccGalectin1-silenced bees was higher than that in the control bees, while the antioxidant enzymatic activities of superoxide dismutase and peroxidase were lower. Considering these results, we suggest that AccGalectin1 may be indispensable for protecting honeybees from biotic and abiotic damage by participating in the oxidative resistance response and the immune response. These results may provide insight into the precise functions of galectins in mammals and other insects.     

Role of c-Jun NH2-terminal kinase-mediated mitogen-activated protein kinase pathway in response to pesticides in Apis cerana cerana

The mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade pathway plays an important role in regulating stress responses. The function of the c-Jun NH₂-terminal kinase (JNK), a component of the MAPK cascade pathway, in Apis cerana cerana (Acc) remains unclear. Here, JNK was isolated and identified from Acc. Bioinformatics analyses revealed there is a typical serine/threonine protein kinase catalytic domain in the AccJNK protein. An expression profile analysis showed that AccJNK was significantly induced by pesticide treatments. To further explore the functional mechanisms of AccJNK, a yeast 2-hybrid screen was performed, activator protein-1 (AP-1) was screened as the interaction partner of AccJNK, and the interaction relationship was further verified by pull-down assay. Quantitative real-time polymerase chain reaction showed the expression pattern of AccAP-1 was similar to that of AccJNK. After a knockdown of AccJNK or AccAP-1 by RNA interference, the survival rate of Acc after pesticide treatments increased. Additionally, the expression levels of antioxidant-related genes and the activities of antioxidant enzymes increased, suggesting that the knockdown of AccJNK or AccAP-1 increased the antioxidant capacity of bees. Our study revealed that the JNK-mediated MAPK pathway responds to pesticide stress by altering the antioxidant capacity of Acc.     

中华蜜蜂气味受体AcerOr2的体外表达特性研究

本研究旨在对中华蜜蜂Apis cerana cerana气味受体基因AcerOr2体外表达特性进行分析验证。本研究利用qRT-PCR和Western blotting检测体外RNA干扰（RNAi）的效果,并通过钙离子成像检测该受体在RNAi前后对气味配体的结合特性。结果显示：体外AcerOr2的最佳干扰浓度为5 μg的dsAcerOr2,其能有效抑制目的基因在Sf9细胞中mRNA和蛋白的表达,且AcerOr2本身缺乏对植物气味物质的敏感性,只对其激动剂VUAA1敏感,RNAi后其对VUAA1敏感也有所降低。AcerOr2体外表达特性的验证,可以为进一步研究AcerOr2在嗅觉过程中的功能机制提供基础。     

中华蜜蜂ZFP37基因的生物信息学分析及高温下表达特性的研究

锌指蛋白(Zinc finger proteins, ZFPs)是一类在真核生物体内广泛分布的蛋白质。锌指蛋白作为一类转录因子,它能够调控基因的表达和细胞的分化,最近的研究显示其在动植物抗逆方面也发挥着重要作用。本研究对中华蜜蜂Apis cerana cerana ZFP37的蛋白结构进行了预测分析,并通过qRT-PCR分析了中华蜜蜂在遭受高温胁迫时ZFP37的表达情况,进一步了解锌指蛋白在中华蜜蜂应对热胁迫过程中的作用。结果显示,中华蜜蜂ZFP37可编码123个氨基酸,蛋白分子量为13.7 kDa,无跨膜结构。氨基酸同源序列比对结果表明,中华蜜蜂ZFP37序列与蜜蜂科昆虫的相似性最高,与其他膜翅目昆虫的相似性存在差异。基因的表达模式显示,ZFP37在高温下表达升高,此外,胁迫时间的增加也可导致ZFP37表达的升高。这些结果表明ZFP37对于中华蜜蜂应对热应激有重要的生物学意义。     

A novel 1-Cys thioredoxin peroxidase gene in Apis cerana cerana: characterization of AccTpx4 and its role in oxidative stresses

Thioredoxin peroxidase (Tpx), also named peroxiredoxin (Prx), is an important peroxidase that can protect organisms against stressful environments. AccTpx4, a 1-Cys thioredoxin peroxidase gene from the Chinese honey bee Apis cerana cerana, was cloned and characterized. The AccTpx4 gene encodes a protein that is predicted to contain the conserved PVCTTE motif from 1-Cys peroxiredoxin. Quantitative real-time PCR (Q-PCR) and Western blotting revealed that AccTpx4 was induced by various oxidative stresses, such as cold, heat, insecticides, H₂O₂, and HgCl₂. The in vivo peroxidase activity assay showed that recombinant AccTpx4 protein could efficiently degrade H₂O₂ in the presence of DL-dithiothreitol (DTT). In addition, disc fusion assays revealed that AccTpx4 could function to protect cells against oxidative stresses. These results indicate that AccTpx4 plays an important role in oxidative stress responses and may contribute to the conservation of honeybees.     

中华蜜蜂HSC70-4基因表达特性的研究

组成型热休克蛋白70-4(heat shock protein 70 cognate 4,HSC70-4)是HSP70家族的重要成员,对蛋白质的正确折叠与转运有着重要意义。本研究以中华蜜蜂转录组数据中获得的HSC70-4基因序列为基础,通过对中华蜜蜂不同发育阶段、不同组织以及不同低温胁迫下的HSC70-4 m RNA表达量进行测定,以期为揭示该基因在中华蜜蜂生长发育和耐寒抗冻过程中的生理功能提供理论依据。结果显示,中华蜜蜂HSC70-4基因包含1923 bp的开放阅读框,编码641个氨基酸,蛋白分子量为70.4 k Da。中华蜜蜂HSC70-4氨基酸序列中包含3个HSP70家族的标签序列,其N端含有HSC70家族的GGXP四肽结构标志,C端包含EEVD结构。与膜翅目其它昆虫的氨基酸序列一致性在94%以上,具有较高的保守性。中华蜜蜂HSC70-4在成虫期的表达量显著高于幼虫期和蛹期(P0.01),从幼虫期至10日龄成虫期呈逐渐上升趋势,但在15日龄至30日龄间呈现波动起伏。HSC70-4在中华蜜蜂不同组织中的表达存在显著差异(P0.01),且在胸部高度表达,在足中中度表达,在其余组织中低度表达。中华蜜蜂HSC70-4的表达受低温胁迫的诱导,在低温胁迫2 h时其表达量最低,4 h时表达量最高。本研究结果表明中华蜜蜂HSC70-4在中华蜜蜂的生长发育过程中应对低温胁迫时发挥生理功能。     

婚飞行为影响中华蜜蜂性成熟处女蜂王的基因表达

婚飞是性成熟处女蜂王与雄蜂交配过程中的一个重要前奏, 在该过程中蜂王体内伴随着一系列重要的生理变化。为了探究中华蜜蜂Apis cerana cerana处女蜂王婚飞过程中基因表达变化, 本研究利用数字基因表达谱(digital gene expression, DGE) 技术分析了中华蜜蜂性成熟处女蜂王飞行与未飞行之间的基因表达差异。经DGE测序, 分别从两个样品中获得5.98和6.01 百万条Clean标签。通过分析检测到250个基因有差异表达, 其中133个基因在飞行蜂王中上调表达, 117个基因在飞行蜂王中下调表达。这些差异基因可以归类到348个功能性类别和142个生化途径。结果表明中华蜜蜂性成熟处女蜂王在婚飞过程中大量基因的表达发生了变化。这些结果为进一步研究中华蜜蜂蜂王婚飞过程中生理变化的分子机制提供了重要的基因表达信息。     

中华蜜蜂Malvolio基因 Acmvl 的克隆及组织表达分析

【目的】本研究克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana Malvolio (Mvl)基因的cDNA序列,分析了其编码蛋白的结构特点,并探讨其mRNA在内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂各部位组织中的表达差异,以期为该基因的生物学功能研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术从中华蜜蜂内勤蜂头部组织中扩增和克隆获得Acmvl的全长序列,并采用多种生物信息学软件分析Acmvl蛋白的结构特征;采用Real-time PCR对中华蜜蜂Acmvl在内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂各组织中的表达特征进行分析。【结果】Acmvl基因cDNA全长为2 130 bp（GenBank登录号：KP662686）,编码587个氨基酸,预测该蛋白分子量为65.86 kD,等电点为6.03,无信号肽,存在11个跨膜结构域、9个糖基化位点和14个潜在磷酸化位点;系统发育树分析结果显示,中华蜜蜂Acmvl与其他膜翅目昆虫Malvolio聚为一支,与小鼠Mus musculus和人Homo sapiens Nramp家族的Nramp2聚为另一大分支,且与小鼠、水稻 Oryza sativa 、黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 和酵母Saccharomyces cerevisiae的Nramp家族同源体在跨膜区、跨膜区带电残基及转运蛋白特征结构域上有很高的保守性,尤其是与Nramp2。Acmvl 基因在中华蜜蜂各部位组织中均有表达,但高表达于内勤蜂的胸部及采蜜蜂和采粉蜂的腹部和足部,提示该基因表达的差异影响采集行为。【结论】Acmvl 属于Nramp基因家族,可能为Nramp2的同源基因,该基因影响采集行为可能与转运Cu²⁺, Mn²⁺和Fe²⁺（尤其是Fe²⁺）有关。     

中华蜜蜂气味受体基因AcerOr167的克隆及表达分析

本研究通过RT-PCR获得中华蜜蜂气味受体基因Or167的cDNA序列,并采用多种生物信息学软件对其结构特征进行预测分析;利用荧光定量PCR检测Acer Or167 m RNA在工蜂羽化后不同发育阶段(1、5、10、15、20、25和30日龄)和不同组织(触角、头、胸、腹、足、翅)中的相对表达量。克隆获得中华蜜蜂Or167的c DNA序列,命名为Acer Or167(Gen Bank登录号为KF239369),其全长1311 bp,编码436个氨基酸,预测有5个跨膜结构域;多序列比对结果显示,中华蜜蜂Acer Or167与西方蜜蜂Amel Or167的一致性最高,达94%,而与毕氏粗角蚁Cbir Or4-like的一致性最低,为49%;荧光定量结果显示,Acer Or167 m RNA在成蜂不同发育期的各个组织中均有表达,且触角中的表达量极显著高于其它各个组织(P0.01),在头、胸、腹、足、翅中有少量表达;从触角不同发育阶段的表达情况来看,1日龄表达量最低,5日龄表达量显著升高,20日龄表达量最高,且极显著高于其它各日龄(P0.01)。推测Acer Or167可能在中华蜜蜂的嗅觉识别系统中起着重要的作用,与中华蜜蜂外出采集,识别花香气味有关。本研究为进一步深入研究中华蜜蜂传统气味受体的功能奠定理论基础。     

中华蜜蜂上颚腺的组织结构及其胚后发育

【目的】上颚腺（mandibular gland）是昆虫重要的外分泌腺,它产生的化学物质在昆虫的种内信息交流中起重要的作用。本研究目的在于了解中华蜜蜂Apis cerana cerana上颚腺的组织结构以及胚后发育特点。【方法】本研究通过组织形态学、BrdU免疫组织化学等技术,对中华蜜蜂上颚腺的结构和发育过程进行了比较研究。【结果】中华蜜蜂的上颚腺在不同级型间差异显著,蜂王的面积最大,工蜂较小,而雄蜂退化。上颚腺出现在末龄幼虫到预蛹阶段,细胞分裂活动的高峰期发生在蛹发育的第1天,随后分裂细胞数减少,并一直持续到蛹发育的第6天结束。在上颚腺发育早期,由分泌细胞分化的内膜就已经出现,并一直保持到成虫。【结论】本研究为昆虫上颚腺的发育和功能研究提供了理论基础。     

Cloning and expression studies on glutathione S-transferase like-gene in honey bee for its role in oxidative stress

Glutathione S-transferases (GSTs) constitute an important multifunctional enzyme family that plays vital roles in cellular detoxification and protecting organisms against oxidative stress caused by reactive oxygen species (ROS). In this study, we isolated a GST-like gene from Apis cerana cerana (AccGSTL) and investigated its antioxidant functions under stress conditions. We found that AccGSTL belongs to the Sigma class of GSTs. Real-time quantitative PCR and western blotting analyses showed that the mRNA and protein levels of AccGSTL were altered in response to oxidative stress caused by various external stimuli. In addition, a heterologous expression analysis showed that AccGSTL overexpression in Escherichia coli (E. coli) cells enhanced resistance to oxidative stress. After AccGSTL silencing with RNA interference (RNAi) technology, the expression of some antioxidant genes was inhibited, and the enzymatic activities of POD, CAT, and SOD were decreased. In conclusion, these data suggest that AccGSTL may be involved in antioxidant defense under adverse conditions in A. cerana cerana.Supplementary InformationThe online version contains supplementary material available at 10.1007/s12192-022-01255-3.     

中华蜜蜂咽下神经节的结构和胚后发育

咽下神经节是昆虫腹神经索的第一个复合神经节, 主要调节口器附肢的活动。本研究通过形态解剖、 BrdU免疫组织化学等技术, 对中华蜜蜂Apis cerana cerana咽下神经节的组织结构和胚后发育过程进行了比较研究。结果表明： 中华蜜蜂的咽下神经节由上颚、 下颚和下唇3个神经节组成。在胚后发育过程中, 细胞增殖的活跃期主要集中在预蛹和蛹发育的第1天, 增殖活动一直持续到蛹发育的第4天结束。根据神经胶质细胞的位置和形态, 咽下神经节中的神经胶质可分为3种类型--表面神经胶质、 皮层神经胶质和神经纤维网神经胶质。本研究为蜜蜂神经系统的发育和功能研究提供了理论基础。     

中华蜜蜂Orco嗅觉受体基因的克隆、表达及亚细胞定位

【目的】克隆鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana的Orco嗅觉受体基因, 并对其在工蜂触角上进行免疫荧光定位。【方法】利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂Orco基因, 并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 使用Real-time PCR技术鉴定其在中华蜜蜂不同发育时期及不同组织的表达谱; 利用免疫荧光定位技术在中华蜜蜂工蜂触角中对Orco进行亚细胞定位。【结果】获得中华蜜蜂Orco基因的全长cDNA序列, 命名为AcerOrco (GenBank登录号： JF968610.1), 其全长为1 434 bp, 编码477个氨基酸, 预测其含7个跨膜结构以及4个位于细胞膜外的亲水区。表达谱分析显示, AcerOrco在卵、 幼虫和蛹期呈低丰度表达, 1日龄及内勤蜂时期主要在触角和足中表达, 且在1日龄的触角中表达量最高; 采集蜂时期的触角、 头(去除触角)、 胸、 腹和翅中均有较高丰度的表达。亚细胞定位结果显示, AcerOrco不仅在采集蜂触角鞭节上大量表达（尤其在触角鞭节第1亚节中表达量较高）, 而且常成对出现, 并且发现AcerOrco可能主要在触角毛形感器的外部神经元(outer dendrite, OD)以及板形感器的树突神经元中表达。【结论】成功克隆了AcerOrco基因全长, 获得了其表达谱, 且将其定位于工蜂采集蜂的触角感器神经元上, 最终推测AcerOrco与中蜂嗅觉发育和触角感器功能密切相关。     

华东地区中华蜜蜂六地理种群的遗传多样性及遗传分化

目的】利用23对微卫星标记对来自于南昌、黄山、桐庐、费县、宜兴、武夷山6个华东地区的中华蜜蜂Apis cerana cerana种群进行遗传多样性及遗传分化分析。【方法】通过计算多态信息含量、平均杂合度、等位基因数、遗传距离、基因流、F 统计量等参数, 评估各中蜂种群遗传多样性和各种群间遗传分化。【结果】各座位的等位基因数为5（A014）至30（AP043）。所有种群均显示较高水平的期望杂合度, 其中, 武夷山中蜂最低, 为0.4280; 南昌中蜂最高, 为0.6329。各中蜂种群间存在极显著的遗传分化, 平均分化系数(Fst)为0.344。基于Nei氏遗传距离运用NJ聚类法将6个中蜂种群划分为3类。【结论】华东6个中蜂种群的遗传多样性较高, 遗传分化显著; 分析遗传分化与地理距离的关系发现, 华东6个中蜂种群间的遗传分化与地理距离不存在显著相关。