Role of c-Jun NH2-terminal kinase-mediated mitogen-activated protein kinase pathway in response to pesticides in Apis cerana cerana

The mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade pathway plays an important role in regulating stress responses. The function of the c-Jun NH₂-terminal kinase (JNK), a component of the MAPK cascade pathway, in Apis cerana cerana (Acc) remains unclear. Here, JNK was isolated and identified from Acc. Bioinformatics analyses revealed there is a typical serine/threonine protein kinase catalytic domain in the AccJNK protein. An expression profile analysis showed that AccJNK was significantly induced by pesticide treatments. To further explore the functional mechanisms of AccJNK, a yeast 2-hybrid screen was performed, activator protein-1 (AP-1) was screened as the interaction partner of AccJNK, and the interaction relationship was further verified by pull-down assay. Quantitative real-time polymerase chain reaction showed the expression pattern of AccAP-1 was similar to that of AccJNK. After a knockdown of AccJNK or AccAP-1 by RNA interference, the survival rate of Acc after pesticide treatments increased. Additionally, the expression levels of antioxidant-related genes and the activities of antioxidant enzymes increased, suggesting that the knockdown of AccJNK or AccAP-1 increased the antioxidant capacity of bees. Our study revealed that the JNK-mediated MAPK pathway responds to pesticide stress by altering the antioxidant capacity of Acc.     

中华蜂体内放线菌的分离、多样性及抗菌活性研究

【目的】探索药用昆虫中华蜂(Apis cerana cerana Fabricius)体内可培养放线菌的分离方法,研究其物种多样性及抗菌活性,挖掘更多微生物资源。【方法】选用7种分离培养基对中华蜂样品体内放线菌进行分离;通过采用16S rRNA PCR-RFLP和16S rRNA基因序列分析方法研究其多样性;选用4种致病菌对菌株进行抗菌活性初探。【结果】共分离得到180株放线菌,根据菌落的形态和细胞特征观察结果,从中选取84株作为代表菌株,其分属于3个目、4个科中的4个属,其中6株为潜在新种;最适的表面消毒方法:浓度为0.2%的Cl O2(二氧化氯)作为消毒剂,作用60 s;拮抗实验显示,31.0%、48.8%、27.4%、16.7%的代表菌株分别对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、玉米弯孢病菌、西瓜枯萎病菌有不同程度的抗菌活性,71.4%的代表菌株对至少一种病原菌有拮抗作用。【结论】分离方法的选择对昆虫体内放线菌的分离效果影响较大;中华蜂体内放线菌具有丰富的多样性,展现出很好的抗菌活性,表明其在发现新型生物活性物质中具有很大的潜力。     

中华蜜蜂mrjp1 cDNA的克隆及其序列分析

构建中华蜜蜂(Apis cerana cerana)8日龄工蜂头部cDNA文库,利用中蜂基因组的mrjp3部分基因片段作为杂交探针,采用DIG标记筛选cDNA文库,获得mrjps阳性克隆120个;对阳性克隆进行PCR扩增和测序,通过NCBI的BLAST序列比对,获得12个与印度蜂(Apis cerana india)、西方蜜蜂(Apis mellifera L.)mrjp1基因同源的中蜂mtjp1 cDNA片段,并进一步对中华蜜蜂mrjp1的cDNA全序列进行测定和分析。序列比对分析表明,东方蜜蜂(Apis cerana)与西方蜜蜂mrjp1的cDNA序列相似性为93．78％,中华蜜蜂与印度蜂的相似性高达99．36％,这一结果从分子水平证实中华蜜蜂与印度蜂有较近的共同祖先,而东方蜜蜂与西方蜜蜂的亲缘关系较远。     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂蜂毒前溶血肽原蛋白cDNA的克隆与序列分析

分别从中华蜜蜂Apis cerana cerana和意大利蜜蜂Apis mellifera工蜂毒腺中抽提总RNA,通过RT-PCR方法扩增,各得到了蜂毒前溶血肽原蛋白的cDNA,再将扩增产物克隆到pGEM-Teasy载体上,进行测序和序列分析。结果表明,所扩增到的这两个片段长度均为213 bp,均为编码蜂毒前溶血肽原的cDNA,并分别推导出两者所编码的氨基酸序列。经序列比较,中华蜜蜂前溶血肽原与意大利蜜蜂、印度蜜蜂Apis cerana indica前溶血肽原的同源性都为97%。所报道的中华蜜蜂蜂毒前溶血肽原的核苷酸序列的GenBank登录号为AF487907。     

中华蜜蜂气味受体AcerOr2的体外表达特性研究

本研究旨在对中华蜜蜂Apis cerana cerana气味受体基因AcerOr2体外表达特性进行分析验证。本研究利用qRT-PCR和Western blotting检测体外RNA干扰（RNAi）的效果,并通过钙离子成像检测该受体在RNAi前后对气味配体的结合特性。结果显示：体外AcerOr2的最佳干扰浓度为5 μg的dsAcerOr2,其能有效抑制目的基因在Sf9细胞中mRNA和蛋白的表达,且AcerOr2本身缺乏对植物气味物质的敏感性,只对其激动剂VUAA1敏感,RNAi后其对VUAA1敏感也有所降低。AcerOr2体外表达特性的验证,可以为进一步研究AcerOr2在嗅觉过程中的功能机制提供基础。     

中华蜜蜂工蜂嗅叶的胚后发育

通过形态解剖、免疫组织化学、原位细胞凋亡检测技术,对中华蜜蜂工蜂嗅叶的胚后发育过程进行了系统的比较研究.结果表明:(1)中华蜜蜂工蜂的嗅叶由神经纤维网区和外围的中脑神经细胞体层组成,在幼虫早期,神经纤维网的腹外侧和背外侧区内有几个大型的成神经细胞,呈现出典型的不对称分裂模式;在随后的发育过程中,神经纤维网的体积逐渐增加,神经细胞逐渐分散,细胞层变薄;分裂细胞主要集中在背外侧细胞区;在3龄幼虫期 ,触角嗅觉神经元的传入纤维开始进入嗅叶;在蛹发育的第3天,神经纤维网内的神经纤维球开始出现;(2)嗅叶发育过程中的细胞凋亡发生较少,增殖细胞和凋亡细胞数量的相对比率基本恒定;细胞凋亡的高峰期出现在幼虫末期;蛹发育的第4天左右,凋亡细胞完全消失 ;(3)中华蜜蜂的嗅叶存在雌雄异形现象[动物学报 54(3):546-554,2008].     

中华蜜蜂ZFP37基因的生物信息学分析及高温下表达特性的研究

锌指蛋白(Zinc finger proteins, ZFPs)是一类在真核生物体内广泛分布的蛋白质。锌指蛋白作为一类转录因子,它能够调控基因的表达和细胞的分化,最近的研究显示其在动植物抗逆方面也发挥着重要作用。本研究对中华蜜蜂Apis cerana cerana ZFP37的蛋白结构进行了预测分析,并通过qRT-PCR分析了中华蜜蜂在遭受高温胁迫时ZFP37的表达情况,进一步了解锌指蛋白在中华蜜蜂应对热胁迫过程中的作用。结果显示,中华蜜蜂ZFP37可编码123个氨基酸,蛋白分子量为13.7 kDa,无跨膜结构。氨基酸同源序列比对结果表明,中华蜜蜂ZFP37序列与蜜蜂科昆虫的相似性最高,与其他膜翅目昆虫的相似性存在差异。基因的表达模式显示,ZFP37在高温下表达升高,此外,胁迫时间的增加也可导致ZFP37表达的升高。这些结果表明ZFP37对于中华蜜蜂应对热应激有重要的生物学意义。     

中蜂与意蜂无王群培育非自身蜂种蜂子及改造王台特性

以中华蜜蜂和意大利蜜蜂为试验材料,通过组织相应无王群,把一蜂种无王群中的子脾加入到另一蜂种无王群中,进行中蜂和意蜂无王群培育非自身蜂种蜂子和改造王台特性研究,当未培育出蜂王时,分别从原有王群中调入子脾进行第2、第3期试验。结果表明:中蜂无王群中的工蜂会清除引入意蜂子脾中的蜂卵,但随着引入意蜂子脾封盖子羽化出房的意蜂幼蜂数量增加而逐渐接受意蜂幼虫,蜂群未改造意蜂王台,只培育出中蜂蜂王;意蜂无王群中的工蜂会随着引入中蜂子脾中羽化出房的中蜂幼蜂数量增加而逐渐接受中蜂卵及幼虫,并从第2期试验开始会改造中蜂王台,但最终只培育出意蜂蜂王。     

中华蜜蜂蜂毒镇静肽基因的cDNA克隆和表达

从中华蜜蜂 (Apisceranacerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR扩增得到大小约为2 5 0bp的cDNA片段 ,测序得到的片段长度为 2 34bp ,为蜂毒前镇静肽原 (preprosecapin)基因编码区的cDNA .以 3′RACE方法 ,扩增和测定了 3′端非编码区 2 19bp序列 .中蜂前镇静肽原cDNA序列与已报道的欧洲意蜂该基因cDNA序列具有 92 %同源性 ,氨基酸序列具有 87%同源性 .代表成熟肽镇静肽的最后 2 5个氨基酸序列 ,中蜂与意蜂同源性为 88% .3′端非编码区cDNA序列与欧洲意蜂序列有 73 1%同源性 .将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟肽编码区与 3′非编码区部分克隆 ,构建了镇静肽与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX AcSecapin .将载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)进行融合表达 .表达产物与抗GST抗体在 2 9kD处有很强的交叉反应 .大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白 ,通过亲和层析柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白     

中华蜜蜂OBP19的克隆与时空表达分析

本研究克隆获得了中华蜜蜂Apis cerana cerana（简称中蜂）的气味结合蛋白（odor-binding proteins,OBPs）基因AcerOBP19的cDNA序列,预测其蛋白结构,明确该基因在不同发育时期各组织的表达水平。PCR扩增AcerOBP19基因的开放阅读框序列,应用生物信息学软件对其编码蛋白的理化特性、结构特征和系统进化进行分析;用qRT-PCR技术对AcerOBP19在中蜂不同发育时期（1、5、10、15、20、25日龄）各组织（触角、足、口器、毒腺和中肠）中mRNA的表达情况进行分析。获得了AcerOBP19的完整ORF序列,序列长为420 bp,共编码139个氨基酸;含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Mins-C OBP亚家族;N-末端有一段含16个氨基酸的信号肽,无跨膜结构。该蛋白包含6个α螺旋和2个二硫键。系统进化树分析表明,AcerOBP19与大蜜蜂Apis dorsata OBPs、小蜜蜂Apis florea OBPs和西方蜜蜂Apis melifera OBPs的氨基酸序列一致性较高,表明它们之间在进化关系上更加同源,且AcerOBP19具有PBP-GOBP superfamily家族的保守结构域,是一种分泌蛋白。qRT-PCR结果表明AcerOBP19在中蜂不同发育时期的各组织中均有表达,其中,15日龄触角中的表达量极显著高于其它组织（P<0.01）,在其它日龄中足的表达量极显著高于其它组织（P<0.01）;在各个时期中口器和毒腺中有较高表达,中肠中呈微量表达。通过AcerOBP19组织表达谱结果,推测AcerOBP19不仅参与嗅觉识别机制,在味觉识别过程中也可能发挥作用。     

中华蜜蜂溶血肽基因在杆状病毒系统中的表达

构建含中华蜜蜂溶血肽基因的重组转移载体pBacHT-GFPTAccM,转化受体菌DH10Bac,得重组穿梭载体Bacmid-GFPTAccM, Lipofectin介导其基因组DNA转染粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4。SDS-PAGE分析表明,感染重组杆状病毒Bacmid-GFPTAccM的细胞表达产物在约为34 kD处出现特异性条带,其表达量约占细胞总蛋白的3%。Western blotting和细胞表达时相动态分析证明中华蜜蜂溶血肽基因已在粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4中进行了成功的表达。     

中华蜜蜂咽下神经节的结构和胚后发育

咽下神经节是昆虫腹神经索的第一个复合神经节, 主要调节口器附肢的活动。本研究通过形态解剖、 BrdU免疫组织化学等技术, 对中华蜜蜂Apis cerana cerana咽下神经节的组织结构和胚后发育过程进行了比较研究。结果表明： 中华蜜蜂的咽下神经节由上颚、 下颚和下唇3个神经节组成。在胚后发育过程中, 细胞增殖的活跃期主要集中在预蛹和蛹发育的第1天, 增殖活动一直持续到蛹发育的第4天结束。根据神经胶质细胞的位置和形态, 咽下神经节中的神经胶质可分为3种类型--表面神经胶质、 皮层神经胶质和神经纤维网神经胶质。本研究为蜜蜂神经系统的发育和功能研究提供了理论基础。     

中华蜜蜂HSC70-4基因表达特性的研究

组成型热休克蛋白70-4(heat shock protein 70 cognate 4,HSC70-4)是HSP70家族的重要成员,对蛋白质的正确折叠与转运有着重要意义。本研究以中华蜜蜂转录组数据中获得的HSC70-4基因序列为基础,通过对中华蜜蜂不同发育阶段、不同组织以及不同低温胁迫下的HSC70-4 m RNA表达量进行测定,以期为揭示该基因在中华蜜蜂生长发育和耐寒抗冻过程中的生理功能提供理论依据。结果显示,中华蜜蜂HSC70-4基因包含1923 bp的开放阅读框,编码641个氨基酸,蛋白分子量为70.4 k Da。中华蜜蜂HSC70-4氨基酸序列中包含3个HSP70家族的标签序列,其N端含有HSC70家族的GGXP四肽结构标志,C端包含EEVD结构。与膜翅目其它昆虫的氨基酸序列一致性在94%以上,具有较高的保守性。中华蜜蜂HSC70-4在成虫期的表达量显著高于幼虫期和蛹期(P0.01),从幼虫期至10日龄成虫期呈逐渐上升趋势,但在15日龄至30日龄间呈现波动起伏。HSC70-4在中华蜜蜂不同组织中的表达存在显著差异(P0.01),且在胸部高度表达,在足中中度表达,在其余组织中低度表达。中华蜜蜂HSC70-4的表达受低温胁迫的诱导,在低温胁迫2 h时其表达量最低,4 h时表达量最高。本研究结果表明中华蜜蜂HSC70-4在中华蜜蜂的生长发育过程中应对低温胁迫时发挥生理功能。     

A novel 1-Cys thioredoxin peroxidase gene in Apis cerana cerana: characterization of AccTpx4 and its role in oxidative stresses

Thioredoxin peroxidase (Tpx), also named peroxiredoxin (Prx), is an important peroxidase that can protect organisms against stressful environments. AccTpx4, a 1-Cys thioredoxin peroxidase gene from the Chinese honey bee Apis cerana cerana, was cloned and characterized. The AccTpx4 gene encodes a protein that is predicted to contain the conserved PVCTTE motif from 1-Cys peroxiredoxin. Quantitative real-time PCR (Q-PCR) and Western blotting revealed that AccTpx4 was induced by various oxidative stresses, such as cold, heat, insecticides, H₂O₂, and HgCl₂. The in vivo peroxidase activity assay showed that recombinant AccTpx4 protein could efficiently degrade H₂O₂ in the presence of DL-dithiothreitol (DTT). In addition, disc fusion assays revealed that AccTpx4 could function to protect cells against oxidative stresses. These results indicate that AccTpx4 plays an important role in oxidative stress responses and may contribute to the conservation of honeybees.     

中华蜜蜂重要生物学特性相关功能基因研究进展

中华蜜蜂Apis cerana cerana Fabricisus是一种重要的经济动物,具有嗅觉敏锐,抗寒耐热,抗螨及采集能力强等特点.目前人们采用分子生物学的方法,对中华蜜蜂的基因组成、基因表达调控及基因功能分析等方面开展研究,揭示其特征行为的分子机理已成为该领域的研究热点之一.近年来,中华蜜蜂重要生物学特征功能相关基因(即蜂王浆蛋白相关基因、化学通讯相关蛋白基因和抗逆相关基因)在基因克隆、表达特性及功能研究等方面取得了重大进展.本文重点对此进行综述.     

中华蜜蜂工蜂蕈形体胚后发育中神经胶质的形成模式

本研究通过形态解剖、免疫组织化学等技术,对中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂蕈形体胚后发育中神经胶质的形成过程进行了比较研究。结果表明：蕈形体中神经胶质增殖的高峰期集中在幼虫发育末期到蛹发育早期;在工蜂蕈形体的蕈体冠、蕈体柄以及小叶的发育过程中,神经胶质细胞往往先于神经纤维网出现在特定的区域,引导神经纤维网的形成。它们一方面规定了神经纤维网的边界和区域,为神经纤维网提供内部的分隔;另一方面也为神经纤维的移动提供特定的“路标"和靶向。与神经纤维网相关联的神经胶质的数量的持续增加,除了神经胶质的分裂增殖外,还有一部分来自于外部细胞体层的神经胶质的迁入。     

意大利蜜蜂和中华蜜蜂为蓝莓授粉的行为比较研究

应用意大利蜜蜂和中华蜜蜂为蓝莓授粉,对其授粉行为和活动方式进行了比较研究。结果表明:(1)采集过程中意蜂和中蜂的行为存在差异,意蜂头部探进铃铛花,将喙伸入花管中吸食花蜜,头部粘附花粉,花粉一部分被收集到花粉框,另一部分被带到其他花上;中蜂采集行为不同,一部分采集蜂探入铃铛花采食,采集时间短暂,另一部分采集蜂停靠在花托部位,采食花瓣掉落的花朵,不易粘附花粉和携带花粉。(2)授粉活动方式不同,意大利蜜蜂每分钟平均访花数为5.05±0.14次,中华蜜蜂为4.77±0.13次,两者差异不显著;而意蜂单次访花时间为9.16±0.43 s极显著长于中蜂的4.89±0.22 s,意蜂较中蜂在花朵的采集时间长,采集间隔时间短,而中蜂较意蜂寻找花朵的时间长,采集间隔时间长。单位面积意蜂采集蜂数量为平均12.00±0.90头,中蜂采集蜂数量平均为1.73±0.42头,两者差异极显著。同时意蜂蓝莓花粉携粉率27.51%,中蜂采集蓝莓花粉携粉率为11.38%,意蜂的授粉蜂数量及授粉专一性优于中蜂。本研究阐明了蓝莓花期不同蜂种的授粉行为及活动方式,据此得出意蜂为蓝莓授粉的行为和活动特性优越于中蜂,两者相比意蜂具有更高的授粉效率。