用AFLP技术检测慢生型花生根瘤茵竞争结瘤的研究

以5株慢生型花生根瘤菌和天府3号花生为材料,用AFLP技术研究了慢生型花生根瘤菌Spr2—9、Spr3—3、Spr3—5、Spr4—5和Spr7—1的遗传特性和竞争结瘤能力。结果显示,供试条件下,传代次数对菌株的遗传性状无明显影响,28C培养条件下,花生根瘤菌连续传96代,其AFLP指纹未发生明显变化;37C培养,仅Spr3—3和Spr3—5能够存活并正常生长,其AFLP指纹也未发生明显改变,然而其它菌株不能生长。将供试慢生型花生根瘤菌分别接种天府3号花生。光照培养30d后,随机各取4个根瘤,从根瘤中提取类菌体DNA进行AFLP分析,各根瘤类菌体DNA的AFLP指纹图谱与该菌株纯培养物AFLP指纹相同。将5个菌株混合接种天府3号花生,不同菌株的占瘤率存在差异,Spr3—3和Spr3—5的竞争结瘤能力最强,两菌株的占瘤率之和为85．4％;Spr4—5的占瘤率为12．2％;Spr7—1为2．4％;而Spr2—9的竞争结瘤能力最差。本试验结果说明,AFLP技术用于根瘤菌生态和竞争结瘤能力研究,具有下列优点：简易、快速、准确;直接取豆科植物的根瘤提取DNA,进行原位研究;在不改变菌株遗传特性,即不使用突变株的前提下,可以直接测定已知菌株的竞争结瘤能力。     

Caldariomyces fumago S-5产抑菌物质的发酵条件优化

对1株产抑菌物质的海洋真菌Caldariomyces fumago S-5的培养条件的优化进行研究,探讨该菌株的发酵产抑菌物质的性能。通过抗菌谱实验、单因素及正交实验设计研究了该菌株所产抗菌物质的押菌特征和最适发酵条件。结果表明,S-5菌株发酵液对几种G^＋和G^-致病细菌具有快速的生长抑制作用,而对真菌没有明显抗菌性。发酵条件优化结果表明：菌株在葡萄糖4％、（NH4）2SO4 0．2％、KCl 0．2％、K2HPO40．2％、Fe2SO4·7H2O 0．002％、MgSO4-2H2O 0．1％、20％马铃薯浸出液的培养基中,控制发酵温度25℃,pH值5．0,接种量1-2cm。菌苔／100mL培养液,摇瓶转速240r／min条件下培养120h,发酵液中抑菌效价最高。实验结果可为该海洋微生物资源的开发利用提供依据。     

用AFLP技术检测慢生型花生根瘤菌竞争结瘤的研究

以 5株慢生型花生根瘤菌和天府 3号花生为材料 ,用 AFLP技术研究了慢生型花生根瘤菌 Spr2 - 9、Spr3- 3、Spr3- 5、Spr4- 5和 Spr7- 1的遗传特性和竞争结瘤能力。结果显示 ,供试条件下 ,传代次数对菌株的遗传性状无明显影响 ,2 8℃培养条件下 ,花生根瘤菌连续传 96代 ,其 AFLP指纹未发生明显变化 ;37℃培养 ,仅 Spr3- 3和 Spr3- 5能够存活并正常生长 ,其 AFLP指纹也未发生明显改变 ,然而其它菌株不能生长。将供试慢生型花生根瘤菌分别接种天府 3号花生 ,光照培养 30 d后 ,随机各取 4个根瘤 ,从根瘤中提取类菌体 DNA进行 AFLP分析 ,各根瘤类菌体 DNA的 AFLP指纹图谱与该菌株纯培养物 AFLP指纹相同。将 5个菌株混合接种天府 3号花生 ,不同菌株的占瘤率存在差异 ,Spr3- 3和 Spr3- 5的竞争结瘤能力最强 ,两菌株的占瘤率之和为 85.4% ;Spr4- 5的占瘤率为 1 2 .2 % ;Spr7- 1为 2 .4% ;而 Spr2 - 9的竞争结瘤能力最差。本试验结果说明 ,AFLP技术用于根瘤菌生态和竞争结瘤能力研究 ,具有下列优点 :简易、快速、准确 ;直接取豆科植物的根瘤提取 DNA,进行原位研究 ;在不改变菌株遗传特性 ,即不使用突变株的前提下 ,可以直接测定已知菌株的竞争结瘤能力     

油菜根际细菌促进油菜生长的研究

在低温(8℃)和适温(28℃)下,采用贫营养型和富营养型培养基,从本所油菜根系土壤中分离得到64个菌株。经纯化,选出15个菌株作盆栽接种试验。结果表明,只有低温下(8℃)分离的R—8—6—1和p—8—4—2两菌株能促进油菜生长,表现在不同程度上增加植株干重和全氮、全磷、全钾的含量。这一结果揭示了促进油菜生长的根际细菌及其利用的可能性。     

具抗真菌活性的海洋霉菌的筛选和初步研究

从中国南海海底沉积物与海水样品中分离出100多株海洋霉菌;以条件性致病真菌白色假丝酵母(Candida albieans),植物病原真菌镰刀菌(Fursarium sp．)等作为敏感测试菌株,初筛分离到30多株对上述测试真菌具有明显抑制作用的海洋霉菌;对其发酵液进行复筛,发现其中编号分别为B4^#-6、B4^#-3、1-B6-6、1-B6-10-5、1-B6-22、C^2#-5、A2—9和1-B6-10的海洋霉菌菌株其代谢产物粗提物有明显抗真菌活性;其抗真菌谱的实验结果表明菌株1-B6-10—5和B4^#-3的代谢产物还能抑制多种其他真菌的生长,这二个菌株具有良好的开发前景。     

一种狗尾草病原真菌的鉴定及菌株致病性研究

经形态学鉴定和rDNA ITS序列分析,16株分离自北京、河北、河南发病狗尾草的菌株、2株分别分离自河南发病虎尾草、牛筋草的菌株和1株分离自青海发病野燕麦的菌株被鉴定为狗尾草平脐蠕孢Bipolaris setariae。接种试验表明,来自狗尾草的菌株比来自其他寄主植物的菌株对狗尾草致病性强,分离自野燕麦的菌株对狗尾草无致病性,分离自不同地区不同样品狗尾草的菌株其致病性有显著差异。菌株NY1对狗尾草有很强致病性,接种后5d植株叶片即全部呈枯死状,接种后7d整个植株枯萎死亡。菌株NY1对马唐和虎尾草也有很强致病性,但对于大多数供试栽培植物致病性很弱或无致病性。因此,B. setariae NY1菌株具有进一步开发成为狗尾草、马唐和虎尾草等杂草的生物除草剂的潜力。     

耐镉促生菌株的分离鉴定及对大豆的促生效应

【背景】华南地区镉（Cd）污染严重,与有益微生物共生能够使作物通过直接或间接的机制解除镉毒,提高抗逆性,进而促进生长。耐镉促生菌剂具有广泛的应用前景。【目的】从华南地区受镉污染植株的根内和根际筛选出耐镉且能促进大豆生长的促生菌,以丰富促进田间大豆生产的优异菌种资源。【方法】采用平板划线法从植株的根内或根际分离菌株,通过生理生化特性和16S rRNA基因序列分析对分离菌株进行初步研究,利用盆栽试验探究镉胁迫下菌株对大豆生长的影响,通过测定丙二醛含量和总抗氧化能力探究菌株的耐镉机制。【结果】分离获得4株菌D1、D2、D3和D4,促生特性试验证明4株菌均具有溶磷、产吲哚乙酸和铁载体的能力。经16S rRNA基因序列分析鉴定,D1、D2、D3和D4菌株分别属于不动杆菌属、微小杆菌属、类芽孢杆菌属和普罗威登斯菌属。用这4株菌进行不同镉处理的大豆（巴西10号）盆栽试验,结果表明,4株菌均具有耐镉和促进大豆生长的作用。不添加镉的条件下,大豆接种D4菌株的地上部干重、根部干重和株高分别增加了28%、35%和31%;在添加20mg/kg-CdCl₂·5/2H₂...     

鼠伤寒沙门氏菌群体感应复苏oxyR基因缺失引起的VBNC状态

探讨鼠伤寒沙门氏菌oxyR基因缺失株引起的VBNC状态及其与群体感应的关系。运用同源重组的方法构建oxyR基因无痕缺失的鼠伤寒沙门氏菌并检测该菌株对H_2O_2的敏感性;将oxyR基因缺失株和亲本株(WT)涂布或滴于LB固体培养基,观察其是否生长及其浓度依赖性生长情况;用swimming和swarming平板检测oxyR基因缺失株和WT的运动能力;检测固体培养基和液体培养基中沙门氏菌分解H_2O_2的能力。成功构建了oxyR无痕缺失菌株;oxyR基因缺失株在0.1 mmol/L H_2O_2的LB平板上形成的菌苔发生了变形,在1 mmol/L H_2O_2的LB平板上不能生长,而WT均能生长;6×10~6和6×10~5 cfu/mL的WT涂布于LB平板上能长满菌苔,而等量的oxyR缺失株不能生长菌落;不同浓度的WT滴于LB平板均能形成菌苔,而oxyR缺失株仅在OD_(600)≥10~(-1)浓度时才能形成菌苔;oxyR缺失株泳动距离无显著性变化,而群集运动距离显著性大于WT;固体培养的沙门氏菌比液体培养的沙门氏菌有更强的分解H_2O_2的能力。鼠伤寒沙门氏菌的群体感应系统通过调控其群集运动和H_2O_2分解能力来复苏由oxyR基因缺失引起的VBNC状态。     

根瘤菌吸氢酶基因转移的研究

通过三亲本杂交将含有花生根瘤菌吸氢基因的质粒pZ 55(Tcr)转入不吸氢的花生根瘤菌Ra 34等菌株 (Hup- ,Nif+,Apr)中 ,筛选到既具有吸氢又具有固氮能力的花生根瘤菌结合株Rz34 2。在自生和共生条件下 ,结合株均可表达高吸氢和高固氮活性。以结合株Rz34 2接种的花生植株叶片的干重比不接种的、接种受体株Ra34(Hup- )和接种对照菌株L8 3(Hup+,Nif+)的分别高 6.2 %、7.6%和 6.3% ;种子的含氮量分别高 8 9%、1.00 %和 6.0 % ;产量分别高 188%、1 0 5%和 1 0 7%。研究结果表明 ,以含吸氢基因的结合株接种花生能提高根瘤菌与花生的共生固氮效率 ,增加作物的产量。     

酶法一步生产葡萄糖酸-δ-内酯的研究

从全国各地采集到的400多份土壤和谷物样品中分离到501株黑曲霉菌株,经筛选后得一株葡萄糖氧化酶活力较高的黑曲霉Y19菌株,以该菌株为出发菌株,经UV、γ-射线及硫酸二乙酯(DES)等诱变筛选后,获得一株酶活较出发菌株高15倍多的黑曲霉UCD 69菌株。通过正交试验确定了几个影响菌体生长和产葡萄糖氧化酶的主要因素水平,并选出了该菌的最适培养条件。用上述条件培养出的菌丝来直接发酵葡萄糖生产葡萄糖酸-δ-内酯。产品收率可达所用葡萄糖重量的50%。     

红霉素链霉菌2-62溶源性菌株的确证与特性研究

我们从红霉紊产生菌Streptomyces erythreus的27株系谱菌株中分离到一株带确噬菌体的2—62菌株,并对2—62菌株作了多方面的考察。根据单菌落传代、孢子加热,柠檬酸钠洗涤消除噬菌体后仍继续释放噬菌体;2—62菌株释放的噬菌体经纯化后制备抗血清,用此抗血清处理2—62菌株的斜面孢子,以中和游离的噬菌体,这种孢子在培养过程中仍继续释放噬菌体;2—62菌株对其自身释放的噬菌体具有免疫力等特性,确证2—62菌株为溶源性菌株。用紫外线或丝裂霉素C进行诱导试验,噬菌体释放量增加不多。将2—62菌株释放的温和性噬菌体感染P32一102敏感菌,得到的溶源化菌林亦释放噬菌体,并且溶源化菌林的性状保持稳定。     

猪出血性败血病杆菌E0630弱毒菌株的培育

将猪出血性败血病杆菌(Pasteurella suiseptica)强毒菌株C44-1在含有“海鸥”洗涤剂的马丁琼脂培养基上不断移植继代,至630代时得到弱毒菌株E。630。此菌几乎丧失对家兔及猪的致病力,用活菌50亿或300—780亿分别注射家兔或猪只均不能致死,但仍具有良好的免疫原性。经分别注射0．75亿一1亿或2--3亿弱毒菌株免疫的家兔或猪只,均可抵抗强毒活菌的攻毒。E。63 0较稳定,连续通过不含“海鸥”洗涤剂的马丁琼脂培养基50代,血液琼脂培养基23代,或经连续接种易感猪5代后,对家兔及猪,毒力均无变化。此弱毒菌株可制成冻干活菌苗,用于预防猪出血性败血病。     

花生种子相关促生菌分离鉴定及功能评价

【背景】利用微生物促进植物健康生长是农业可持续发展的重要方向之一,而种子相关的促生菌可在植物生命周期早期与植物相互作用,对植物健康生长具有重要意义。【目的】发掘与利用种子相关促生菌的前提是筛选获得促生菌菌种资源,验证其益生能力,为其进一步应用与机理研究提供依据与支持。【方法】以花生种子为研究对象,从种子表面及种子内部分离纯化多株菌,测定菌株的固氮、解磷、解钾、吲哚乙酸合成和铁载体合成等促生能力,并验证菌株对常见植物病原菌的生长抑制特性;通过16S rRNA基因序列进行系统发育分析,确定分类地位;通过生物膜形成能力及根际定殖能力测定菌株在植物根际的生存能力;最后通过催芽及盆栽试验测定菌株对花生种子发芽及幼苗生长的影响。【结果】从花生种子表面、种子内和胚根内分离筛选到41株菌,均有吲哚乙酸合成能力,其中35株有固氮能力,2株有铁载体分泌能力,14株有植物病原菌生长抑制能力。各选一株为代表的菌株,即PS3、PE5和PR5,经16S rRNA基因序列比对分析鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)。PS3、PE5和PR5均可在MSgg液体培养基表面形成褶皱较强的生物膜,也可在花生根际形成有效定殖。催芽试验结果表明经过促生菌浸种后花生种子萌发率明显提高,在第2天时,PS5将发芽率由14.17%提高至38.33%,PE5发芽率提高至30.83%,PR5发芽率提高至39.17%。三株菌能够明显促进花生幼苗生长,PS5对花生幼苗苗高、根长、鲜重和干重分别提高21.82%、22.20%、37.11%和35.64%,PE5分别提高17.45%、18.93%、26.10%和21.18%,PR5分别提高23.11%、23.92%、38.66%和37.47%。【结论】筛选获得的花生种子相关促生菌,具有促进植物生长的潜力,明显促进种子萌发及幼苗生长,是良好的促生菌生物资源,具有较好的应用潜力。     

红海榄根际土壤来源的泡盛曲霉（Aspergillus awamori）F12及其代谢产物的抗菌活性分析

摘要：【目的】鉴定一株来自于红海榄根际土壤并具有分泌抑菌活性代谢产物的真菌菌株F12,并从其发酵液乙酸乙酯浸膏中分离抑菌活性成分。【方法】通过形态学观察以及ITS序列分析方法对菌株F12进行鉴定;利用色谱技术分离发酵液乙酸乙酯浸膏中的次生代谢产物,根据化合物的质谱、氢谱、碳谱以及理化性质确定其结构,并检测它们对细菌生长的抑制作用。【结果】菌株F12被鉴定为Aspergillus awamori strain F12;从其发酵液乙酸乙酯浸膏中分离到3种化合物：1,4-二甲氧基苯（1）、大黄素（2）和3,6-二苯甲基哌嗪-2,5-二酮（3）,其中化合物1属于在本属真菌中首次报道。化合物2对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长具有明显的抑制作用,最低抑菌浓度（MIC）分别为16ng/L和32ng/L,化合物1和3对上述菌株的生长无明显的抑制活性。【结论】首次发现从红海榄根际土壤中分离到的泡盛曲霉（Aspergillus awamori）菌株F12具有合成1,4-二甲氧基苯和大黄素的能力,其中后者对微生物的生长具有明显的抑制作用。     

亚嗜盐链霉菌新种的鉴定

在分离极端嗜盐细菌的过程中,在含25％NaGI的Gibbons[1]培养基上发现一个放线菌菌落A75,经两代转种之后便不再生长。此菌仅能在含5—8％NaCI的Gibbons培养基上较好地生长,当NaGl浓度高于18％时则完全不生长。经鉴定,此菌株属于链霉菌属中的白孢(Albosporus)类群[2],但它与本类群中的已知种差异明显。在不另外添加NaCl的其它供试培养基上,一般不产生气生菌丝体,对供试碳源均不利用。在5—8％NaGl的Gibbons培养基上孢子丝呈白色,常成圈,幼龄菌落形成同心圆,液体培养菌体呈团状。在普戈二氏基础培养基[3]中添加8％ NaCl,除D-木糖和L-阿拉伯糖外,对多种碳源均可利用,但生长弱。经鉴定认为A75菌株是链霉菌属中的一个新种,命名为亚嗜盐链霉菌(Streptomyces subhalophilus n.sp．)。     

痢疾杆菌杂交株的生物学及免疫学特性

以大肠杆菌HfrC为给体,福氏志贺氏痢疾杆菌Fa．1、Fs．2、F3,4、F。2404为受休,分别杂交 得到六株痢痰杆菌杂交株,与其原始株及两株铰链株进行了生化、血清、药敏、繁殖力、侵袭力、免疫力等生物学及免疫学特性的比较。发现HF,。2-3,Hfu 4—17二杂交株与痢疾毒株在乳鼠肠道内具有不同程度的繁殖力,此点与两株依链株不同,后者在乳鼠肠道内不能繁殖。经毒力试验表明,HE38 2-3与HF38 4-17株的小白鼠LD,。剂量分别为2．5×10,,2,0×10,,而其相应原 始菌株Fs-2,F384分别为4×104．2．7 x10’,杂交株高于原始菌株;将上述二杂交株以5×10。 菌体接种豚鼠角膜,未引起炎症反应;二者均不侵入HeLa细胞,结果同依链株类似。经豚鼠角膜免疫力试验证明,HF38 4—17与HF38 2—3株均可使免疫豚鼠角膜产生对同型毒菌F38 75株攻南白免疫力,尤以HF38 4—17株曲杯．     

H5亚型禽流感病毒单抗-生物素捕获ELISA的建立

目的建立一种单克隆抗体介导的、经生物素—亲和素系统放大的H5亚型禽流感病毒捕获ELISA检测方法,为进一步研究检测试剂盒提供基础。方法用亲和层析法纯化抗禽流感病毒H5亚型血凝素单克隆抗体,包被微量反应板,用于捕获病毒抗原,再用生物素标记的单抗和酶标亲和素来检测病毒血凝素抗原,经方阵试验优化ELISA反应体系。用该方法检测H1—H15亚型AIV标准毒株和H5、H7、H9亚型AIV分离株,并与血凝和血凝抑制试验比较,评价其敏感性和特异性。结果纯化后的单抗具有良好的反应活性,生物素标记单抗工作浓度为1∶5000;ELISA对H5亚型AIV的检出限为025个血凝单位。该ELISA反应体系能检出H5N3标准株和所有20株国内H5亚型AIV分离株,而与其他14个血凝素亚型的AIV标准株、15个H9亚型AIV分离株和2个H7亚型AIV分离株均无交叉反应。结论初步建立了检测H5亚型禽流感病毒的单抗—生物素捕获ELISA方法,为研制试剂盒和进一步应用试验提供了基础。     

重金属铜抗性菌株的筛选及其生物学特性的研究

通过在培养基中加入一定浓度的Cu(CuSO4·5H2 O ,Cu 2 0 0mg·L-1) ,从 4 2份土壤样品中筛选得到 2株具有很强Cu抗性的细菌B和G ,经初步鉴定它们分别属于无色细菌属和芽胞杆菌属。将菌株B和G接种到添加Cu(15 0mg·L-1)的培养液中进行沉淀态铜的活化试验 ,结果表明 ,与不接菌对照相比 ,B和G菌株分别使培养液中有效铜含量增加 4 75 5 %和 2 4 9 5 % ,培养液pH由 6 5分别降低到 4 2和 5 0 ,菌株B和G的活化效能与其代谢产酸有关。B菌株和G菌株最适生长温度为 2 8℃ ,最适 pH分别为 6～ 7和 8,G菌株在 5 %NaCl下生长良好。除抗Cu外 ,两株菌对重金属Pb(40 0mg·L-1)、Cd(10 0mg·L-1)也具抗性。     

一株耐铝隐球酵母菌株5-2的分离鉴定及耐铝特性分析

目的分离高耐铝的微生物菌株,为耐铝基因克隆和耐铝机制研究奠定基础。方法用含5 mmol/L铝的平板逐级筛选和纯化,PCR扩增ITS序列和26S r DNA D1/D2序列,用菌株在不同铝浓度的固体培养基和液体培养基中的生长状况鉴定耐铝能力,用ICP-AES测量菌液上清中剩余活性铝的含量。结果通过ITS序列和26S r DNA D1/D2序列比对及形态观察,初步鉴定该菌株为Cryptococcus podzolicus,该菌株的最大耐铝能力达到100 mmol/L,而且该菌株能够吸附溶液中的活性铝,这可能是其耐铝的原因之一。结论该菌种是首次发现具有耐铝能力,从而为土壤微生物耐铝机制的研究及克隆耐铝基因提供了很好的实验材料。     

两株PGPR菌株的花生定殖及对根际细菌群落结构的影响北大核心CSCD

为探讨2株根际促生菌耐酪氨酸束村氏菌P9和吡咯伯克霍尔德氏菌P10对花生的促生机制。利用GFP及利福平对2个菌株进行标记、结合扫描电镜观察,追踪了2株PGPR菌株在花生组织中的定殖动态;并通过16S rRNA全长测序对菌株接种花生根际土壤的细菌多样性进行分析。结果表明,利福平标记的P9和P10菌株具有良好的遗传稳定性,其生长和促生特性与原始菌株基本一致。GFP标记菌株可在花生的根尖及其分生区定殖;利福平标记菌株可稳定定殖在土壤及花生的根、茎部,且接菌30 d后定殖数仍保持在10CFU/g数量级。与未接菌植株根际土壤相比,P9、P10及混合菌株接种组的细菌群落相似性更高;接菌组的Flavihumibacter、unidentified_Rhizobiaceae的相对丰度显著增加,芽孢杆菌属、链霉菌属等的丰度较CK有不同程度增加,溶杆菌属、无色杆菌属及假黄单胞菌属等的丰度降低。2株PGPR菌株均可通过直接定殖在植株组织中、间接影响土壤细菌群落结构而发挥对花生的促生作用,混合菌株接种效果更优。研究结果明析了2株促生菌的促生机制,并为菌株的应用提供了科学依据。