NDV诱导HeLa细胞发生核糖体应激及对翻译起始复合体的影响

[目的]研究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV) HBUN/LSRC/F3株(以下简称NDV F3)诱导宫颈癌细胞(HeLa)发生核糖体应激后对eIF2α介导的翻译起始复合体eIF4F的调控作用。[方法]流式细胞术及CCK-8检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测c-Myc基因表达;流式细胞术分析细胞周期;Western blotting技术检测c-Myc、RPS7、Bcl-2、NP、eIF4E及eIF2α蛋白的表达;Western blotting和免疫荧光染色技术检测NP、eIF4E蛋白定位。[结果]与阴性对照组相比,NDV F3抑制HeLa细胞增殖并诱导细胞凋亡。细胞周期中G₀/G₁期出现停滞,c-Myc表达呈时间依赖性抑制,c-Myc与Bcl-2蛋白表达量在0-48 h内逐渐下降,NP蛋白在24 h时生成并逐渐增加,RPS7、eIF4E和eIF2α蛋白含量在0-48 h内呈先增加后降低趋势。Western blotting定位分析及激光共聚焦显微镜结果显示NP蛋白主要存在细胞质中,NP与eIF4E存在共定位现象。[结论]NDV F3诱导HeLa细胞凋亡并引发核糖体应激反应,NP与eIF4E相互作用而抑制eIF2α介导的翻译起始复合体eIF4F形成,阻断其与宿主mRNA之间的联系,同时促进NDV F3 mRNA的翻译,最终造成宿主蛋白翻译抑制。     

eIF4E抑制性蛋白翻译调控机制

真核生物mRNA的翻译调控,通常发生在起始阶段。异源三聚体复合物eIF4F中的eIF4E与mRNA5'端帽子结构的结合是该阶段的核心,而eIF4E抑制性蛋白正是通过与eIF4E的相互作用而调控着翻译起始过程,进而调控着翻译的速率。eIF4E抑制性蛋白对翻译的这种调控作用对细胞的生长、发育、癌症以及神经生物学方面有巨大影响,现主要就eIF4E抑制性蛋白的翻译调控机制进行综述。     

miR-34b调控肠道病毒71型在人横纹肌肉瘤细胞中的复制及机制

【背景】研究发现microRNAs(miRNAs)可以参与调控病毒在宿主细胞内感染和复制的过程。【目的】研究miR-34b对肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)在宿主细胞内的复制及其可能机制。【方法】在人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞中转染miR-34b mimics和Inhibitor,通过Western blot和Real-time PCR实验检验EV71病毒的复制和表达情况。随后利用双荧光素酶报告系统验证miR-34b与潜在靶点eIF4E的相互作用,并检测miR-34b对RD细胞中eIF4E mRNA表达水平的影响。【结果】miR-34b可以促进病毒在RD细胞中的复制和表达,而miR-34b抑制剂有抑制病毒复制的作用,细胞内miR-34b可以通过作用于靶基因eIF4E调控EV71在宿主细胞中的复制过程。【结论】揭示了miR-34b在EV71病毒复制过程中的调控作用及机制,研究EV71病毒与宿主miRNAs的相互作用机制为进一步阐明EV71病毒感染与复制机理奠定了基础。     

siRNA干扰马赛病毒潜在翻译起始因子ORF314显著抑制病毒复制

马赛病毒是继拟菌病毒之后被发现的第2类阿米巴巨型病毒,拥有庞大的双链DNA基因组。基因组分析显示,马赛病毒上海株(Mar-SH2016)编码4种潜在翻译因子。其中,ORF314基因与真核翻译起始因子eIF2/eIF5的氨基酸同源性约为60%,但其在马赛病毒复制中的作用还有待揭示。本研究设计了3对靶向Mar-SH2016 ORF314基因的siRNA,通过转染宿主卡氏棘阿米巴细胞,分析siRNA对ORF314基因表达水平和病毒复制的影响。用荧光标记的siRNA转染卡氏棘阿米巴细胞,结果显示约1/3阿米巴细胞成功转染。实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和蛋白免疫印迹实验证实,在Mar-SH2016感染宿主的过程中siRNA能使ORF314基因表达水平显著下降。siRNA干扰后病毒毒力测定结果显示,Mar-SH2016的毒力降低约30%(P<0.01)。结果表明,降低ORF314基因的表达水平能显著抑制Mar-SH2016复制。     

HCMV增殖机制研究进展

人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染在人群中广泛存在,病毒在感染细胞内增殖会对宿主细胞进行多水平调节和干扰,从而导致各种宏观疾病。本文对HCMV复制周期的基因表达时序、HCMV-DNA复制相关蛋白质及其编码基因、HCMV-DNA复制特点和HCMV必需基因、非必需基因及抑制基因等进行综述。     

苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒复制与宿主细胞核骨架关系初探

用选择性抽提方法和整装细胞电镜技术观察苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(AcMNPV)感染的Tn5B1细胞的核骨架结构体系,发现感染早期病毒的复制过程未对宿主细胞核骨架的形态结构产生明显影响,而感染晚期多角体的装配在核骨架网络中进行.以ie-1基因和多角体蛋白基因为探针,点杂交分析基因转录活性与宿主细胞核骨架的关系,结果表明在病毒感染早期,无论是正具转录活性的ie-1基因还是不具转录活性的多角体蛋白基因都可紧密结合在宿主细胞的核骨架上.     

真核翻译起始因子4G与肿瘤

真核翻译起始因子4G(eukaryotic translation initiation factor 4G,eIF4G)是eIF4F复合物中的一种"支架蛋白",在蛋白质合成的起始阶段中发挥重要的调控作用。近年来研究表明,eIF4G的两个亚型eIF4G1和eIF4G2跟许多恶性肿瘤的调控有密切关系,相对于相应的正常组织,eIF4G1在乳腺癌、宫颈癌、鼻咽癌、肺鳞状细胞癌、前列腺癌等恶性肿瘤中表达明显增高;而eIF4G2在弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、膀胱移行细胞癌也有明显的差异性表达。因此,本文主要总结eIF4G、eIF4G1和eIF4G2的表达情况对肿瘤发生、发展及预后的影响,为肿瘤早期预测、靶向治疗及预后提供更好的理论依据。     

苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒复制与宿主细胞核骨架关系初探

用选择性抽提方法和整装细胞电镜技术观察苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒（ＡｃＭＮＰＶ）感染的Ｔｎ５Ｂ１细胞的核骨架结构体系,发现感染早期病毒的复制过程未对宿主细胞核骨架的形态结构产生明显影响,而感染晚期多角体的装配在核骨架网络中进行。ｉｅ－１基因和多角体蛋白基因为探针,点杂交分析基因转录活性与宿主细胞核骨架的关系,结果表明在病毒感染早期,无论是正具转录活性的ｉｅ－１基因还是不具转录活性的多角体蛋     

禽传染性支气管炎病毒Nsp2蛋白与宿主蛋白eIF2α的互作鉴定

Nsp2蛋白是冠状病毒的非结构蛋白,在病毒早期感染中具有重要作用。【目的】为初步筛选可能与禽传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV) Nsp2蛋白互作的宿主蛋白,鉴定Nsp2蛋白与真核翻译起始因子2α亚基(eIF2α)的相互作用。【方法】以pCAGGs-Flag-Nsp2和pCAGGs-Flag载体转染后的鸡胚肾(CEK)细胞为研究对象,利用免疫共沉淀(Co-IP)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术筛选出可能与IBVNsp2蛋白发生互作的宿主蛋白eIF2α,通过免疫共沉淀和间接免疫荧光试验进一步验证二者相互作用。【结果】经免疫共沉淀与质谱分析后筛选到97个可能与Nsp2蛋白互作的宿主蛋白,其中宿主抗病毒反应的关键蛋白eIF2α与Nsp2蛋白的相互作用通过免疫共沉淀和间接免疫荧光试验,表明二者存在直接互作关系,并共定位于细胞质中;此外,Nsp2蛋白表达和IBV感染都能显著提高宿主内源性eIF2α的转录水平。【结论】利用免疫共沉淀联合质谱技术筛选到CEK细胞中存在的97种可能与IBV Nsp2互作的候选蛋白,利用免疫共沉淀与...     

动物宿主microRNAs抗病毒作用机制研究进展

microRNAs(miRNAs)是一种长度为22nt的非编码RNA分子,能够结合mRNA,影响翻译效率,调控蛋白的表达。近来多项研究表明,动物宿主miRNAs通过多种机制抑制病毒的复制,如直接靶向病毒基因、干扰病毒复制所需因子、调节先天性免疫、调节细胞凋亡、调节细胞免疫,发挥抗病毒效应。本文归纳总结宿主miRNAs对病毒复制的调控机制,讨论miRNAs类抗病毒药物的应用情况,并展望该类药物的发展趋势。     

与猪流行性腹泻病毒M蛋白互作的宿主蛋白的鉴定

【背景】猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)膜蛋白(M)在病毒粒子的组装、膜融合和病毒复制等方面具有重要的作用,但M蛋白与宿主细胞的互作机制尚不清楚。【目的】利用免疫沉淀技术和液质联用技术筛选细胞内与PEDVM蛋白相互作用的蛋白,为揭示M蛋白在病毒增殖过程中发挥的功能提供研究基础。【方法】将MOI=0.1的PEDV DR13疫苗株接种于长成单层的Vero细胞,感染36 h后,收集细胞并进行裂解。利用抗M的单克隆抗体沉淀与M相互作用蛋白复合物,通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行鉴定并利用细胞功能富集分析(Gene ontology,GO)对感染组鉴定到的细胞蛋白进行分析,确定两个细胞内源性蛋白为候选蛋白,进行免疫共沉淀(Co-IP)验证和共定位分析。【结果】基于鉴定蛋白的肽段数的方法分析显示,感染组与对照组相比,鉴定了218个与M蛋白相互作用的细胞内源性蛋白,分别与蛋白质合成、代谢、细胞信号通路转导等密切相关,选择细胞分裂周期蛋白42 (Cell division cycle 42,CDC42)、真核翻译起始因子3亚基L蛋白(eIF3L)为候选蛋白进行Co-IP(Co-immunoprecipitation)验证和共定位分析,结果证实CDC42、eIF3L蛋白分别与M蛋白在细胞内存在相互作用。【结论】鉴定出PEDV M蛋白能够与宿主细胞CDC42和eIF3L蛋白相互作用,并鉴定出其他可能与M蛋白发生相互作用的宿主蛋白60个,为开展PEDV与宿主细胞蛋白相互作用研究提供了重要理论依据。     

关于脑心肌炎病毒2A蛋白的研究进展

脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是一种无囊膜的单股RNA病毒,属于小RNA病毒科,能够引起多种哺乳动物乃至人的感染。其非结构蛋白2A是重要的毒力因子,能够通过阻断翻译起始复合物的形成、结合翻译起始复合物因子及核糖体40s小亚基等方式竞争性地抑制宿主细胞蛋白的合成,还可通过抑制宿主细胞凋亡促进病毒扩散,并通过激活NF-κB引起宿主发生强烈的炎症反应[1]。此外,根据EMCV 2A蛋白的生物学特性,近年来,细胞生物学、病毒学领域均将其作为真核细胞与病毒互作的生物学工具展开了深入研究。     

神经胶质瘤细胞ATF5表达水平对HCMV复制的影响

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在神经胶质瘤细胞中的复制水平不一,其机制尚不清楚。本研究通过下调转录激活因子5(ATF5)在神经胶质瘤细胞中的表达,检测HCMV感染神经胶质瘤细胞后病毒复制水平的变化。首先用HCMV AD169(MOI=5)分别感染U87、SY5Y及A172细胞,观察细胞形态变化,分别在24、48、72、96、120 h取各时间点上清液检测病毒滴度;Real-time PCR检测HCMV即刻早期基因(IE2)、早期基因(UL44)、晚期基因(UL99)及ATF5的表达情况;Western-blot检测病毒基因编码蛋白及ATF5表达的情况。结果显示HCMV在U87、SY5Y细胞中复制水平与病毒在A172细胞中复制水平相比,U87、SY5Y细胞组明显高于A172细胞组(P0.05),ATF5表达在U87、SY5Y细胞组与A172细胞组相比,U87、SY5Y细胞组ATF5表达明显高于A172组(P0.05);利用慢病毒介导的RNA干扰技术下调ATF5在U87、SY5Y细胞的表达,用HCMV感染细胞检测病毒基因及蛋白的表达,结果ATF5表达下调可抑制HCMV的复制(P0.05)。以上结果表明,在胶质瘤细胞中下调ATF5表达水平可以抑制HCMV的复制水平。     

人巨细胞病毒博弈宿主免疫进展

人巨细胞病毒(HCMV)感染在人群中极其普遍,病毒一旦侵入机体,将长期存在于体内,且具有潜伏-活化的生物学特性。在病毒与宿主共同进化的漫长过程中,病毒靶向性的产生了多种免疫逃避机制,通过编码病毒自身免疫调节分子,参与调控机体主要组织相容性复合体、细胞免疫、体液免疫、细胞因子及趋化因子等方面的功能,以躲避宿主的免疫杀伤作用。HCMV的免疫调节基因被认为在病毒的致病机制中扮演重要角色。本文将对近年来有关HCMV的免疫调控机制研究作一综述,从病毒编码的免疫调节分子功能的角度并结合本实验室的相关研究成果,探讨病毒与宿主免疫的相互作用过程,从病毒干预宿主免疫关键分子作用的角度映射机体对抗病毒的免疫机理。     

eIF4A在帽依赖和IRES介导的翻译起始中的作用

生物体内翻译起始机制分为两类：帽依赖性翻译起始和内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites, IRES)介导的翻译起始。真核生物的翻译起始为经典的帽依赖性翻译起始模型,而大多数正链RNA病毒选择依赖于IRES的翻译机制。真核翻译起始因子4A (eukaryotic initiation factor 4A, eIF4A)是DEAD-box RNA解旋酶家族的成员,具有依赖于RNA的ATP酶活性和RNA解旋酶活性,而e IF4A具体的解旋机制至今仍不清晰。同时,eIF4A与其他翻译因子有着复杂而紧密的联系,在帽依赖性与IRES介导的翻译起始过程中扮演着至关重要的角色。本文主要对eIF4A的功能、结构以及eIF4A在帽依赖性与IRES介导的翻译起始过程中的机制作一综述。     

HCMV基因在人和小鼠胚胎成纤维细胞中表达的差异性研究

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）种属特异性机制尚不清楚。研究通过检测HCMVADl69体外感染人胚胎成纤维细胞（Human embryo fibroblast, HEF）和小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblast, MEF）后病毒基因的表达情况,探讨HCMV种属特异性的可能分子机制。首先用HCMV AD169（MOI=5）分别感染HEF和MEF,相差显微镜逐日观察细胞的形态学变化;RT—PCR检测HCMV即刻早期（IE1、IE2）、早期（uL84）和晚期基因（UL83）的表达情况;Western—blot和免疫荧光检测病毒基因编码蛋白表达的情况。形态学观察发现HEF感染HCMV后逐渐变大变圆并相互融合,第4天可见典型的HCMV特征性病变效应,而MEF则未出现上述的变化;RT-PCR和Western—blot表明HEF组表达即刻早期基因IE1和IE2、早期基因uL84和晚期基因UL83 mRNA以及各基因所编码的蛋白,且相对表达量显著高于模拟感染组（P〈0．01）;而MEF组仅IEl和IE2mRNA和蛋白相对表达量显著低于HEF组（P〈0．05）,而高于模拟感染组（P〈0．01）。免疫荧光检测发现HEF感染72h表达IE和UL83蛋白,而MEF则无明显表达。以上结果表明,HC—MV不能在MEF中复制并产生完整子代病毒颗粒,且病毒基因表达阻止在IE2基因表达之后和UL84基因表达之前,其种属特异性可能与即刻早期蛋白低水平的表达量有关。     

应用套叠PCR技术构建番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的hpRNA植物表达载体

植物真核翻译起始因子4E(eIF4E)在蛋白质合成的起始中发挥重要作用,参与植物-病毒互作,影响病毒的侵染过程.为了研究eIF4E在植物病毒侵染中的功能,建立了一种快速的套叠PCR新方法,成功构建了番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的hpRNA结构,并将其连接到改造的植物表达载体pBI121上,为利用RNA干扰技术研究番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因在病毒侵染中的作用奠定了基础.     

病毒与宿主细胞的糖基化修饰及相关功能

病毒的复制和对宿主的入侵与自身结构蛋白的糖基化修饰密切相关.对于宿主而言,在病毒感染宿主和宿主抗病毒的过程中,宿主的糖基化过程一方面可抑制病毒的复制和入侵,另一方面可促进病毒对宿主的感染,抑制宿主糖苷酶可抑制病毒的复制.从病毒方面来看,由于病毒自身缺乏糖基化修饰系统,病毒的糖基化过程是借宿主细胞内的合成系统对自身进行糖基化修饰.病毒的糖基化过程对病毒蛋白的折叠与稳定、病毒的感染和入侵、参与识别宿主细胞受体和参与病毒的免疫逃逸等过程起着重要的作用.随着糖基化研究技术的发展,以糖基化为基础的功能应用也越来越深入:如新型病毒疫苗和新型抗病毒药物的研制,以糖蛋白质组学研究为基础的质谱技术和生物信息学方法的发展,以及利用糖基化对病毒性疾病的诊断和治疗等,这些均为糖基化深入研究发展奠定了基础.本文就病毒与宿主细胞糖基化过程、相关功能以及研究应用等进展作一综述.     

丙型肝炎病毒感染过程中其NS3/4A蛋白酶切割线粒体抗病毒信号蛋白的动态过程

已知丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)可通过其蛋白酶NS3/4A切割线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)来逃逸天然免疫识别,但尚不清楚其切割动力学及切割在抑制干扰素中的作用。本研究旨在细胞模型中探讨HCV感染过程中病毒复制建立及病毒NS3/4A切割MAVS的动态过程,探究NS3/4A切割MAVS对病毒逃逸宿主天然免疫建立感染的贡献。首先构建基于绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的MAVS切割报告系统(GFP-NLS-MAVS-TM462),用 HCV Jc1-Gluc 感染Huh7.5/GFP-NLS-MAVS-TM462细胞。结果显示,病毒复制早期MAVS切割效率较低;NS3/4A高效切割MAVS发生于HCV复制晚期,且其切割效率与NS3蛋白水平相关。利用带有GFP ypet的HCV报告病毒Jc1-378-1感染Huh7.5/RFP-NLS-MAVS-TM462细胞,在单细胞水平观察HCV感染阳性细胞中MAVS被切割情况,发现HCV复制细胞中仅部分细胞MAVS被切割。进一步研究发现,不同基因型NS3/4A切割MAVS的效率仅与NS3表达水平相关。以上结果提示,HCV蛋白酶NS3/4A切割MAVS依赖NS3/4A蛋白在病毒复制过程中的累积,对在病毒复制早期逃逸宿主天然免疫建立感染可能无显著贡献。     

HaNPV在宿主内的复制及其对宿主蛋白质代谢的影响

对棉铃虫Helicoverpaarmigera的中肠、血淋巴及脂肪体进行SDS-PAGE蛋白质分析表明：感染早期,HaNPV对棉铃虫的蛋白质合成有刺激作用,晚期则表现出抑制作用。感染96 h和120 h脂肪体有较高水平的多角体蛋白合成。电镜观察表明：①HaNPV感染棉铃虫除病毒在中肠复制后经出芽进入血腔感染脂肪体等组织外,还可能存在病毒粒子直接经中肠进入血腔而感染脂肪体这样的途径;②中肠与血腔之间存在屏障结构;③中肠不仅是一次感染时病毒粒子复制的场所,它完全可能被病毒粒子二次感染。在中肠细胞中没有发现多角体的形成。