H7N2禽流感病毒HA的分离纯化及其糖链谱研究

血凝素(HA)是位于流感病毒囊膜表面的一种Ⅰ型跨膜糖蛋白,是流感病毒结合宿主细胞表面受体,介导病毒入胞的关键分子,也是中和抗体以及疫苗研制的重要靶标.HA表面糖基化与病毒毒力、感染宿主范围等密切相关,且其表面糖链变化会影响其结构与功能.然而目前关于流感病毒HA糖基化的研究主要集中在其糖基化位点上,而对于HA上详细的糖链结构知之甚少.本文应用禽流感病毒特异识别的唾液酸糖链(SAα2-3Gal)受体,制备特异的糖链磁性微粒复合物,进而从H7N2禽流感病毒中分离纯化HA,并采用SDS-PAGE及质谱技术进行鉴定.确定提取物系HA后,进一步利用凝集素芯片联合质谱技术研究禽流感病毒H7N2的HA表面糖型,结果显示H7N2禽流感病毒HA表面主要含有岩藻糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、N-乙酰葡糖胺等糖链结构,共获得16个糖链结构较为准确的寡糖,这些糖链可能与HA生物学功能相关.本研究有助于揭示禽流感病毒感染宿主的糖链作用机制,有助于设计制备针对HA相关的糖链疫苗.     

禽流感病毒血凝素蛋白的结构、功能与表达

血凝素蛋白（HA）既是一种重要吸附蛋白,介导禽流感病毒吸附和穿入宿主细胞而发挥致病作用,也是一种良好的保护性抗原,对宿主抵抗禽流感起到了决定性保护作用。研究HA蛋白对揭示禽流感病毒的致病机理和免疫防治禽流感均具有重要意义。本文重点概述了HA蛋白的结构、功能和蛋白表达方面的研究进展,并对HA蛋白在禽流感疫苗中的应用进行了探讨。     

人感染新型H10N3禽流感病毒分子溯源

【背景】1997年香港发生人感染禽流感事件以来,禽流感病毒成为持续威胁人类健康和公共卫生的重要病原体。【目的】对一例人感染新型H10N3禽流感病毒病例开展分子溯源研究。【方法】流感病毒分型检测采用RT-qPCR法,在下一代测序平台上完成病毒基因组测序,序列和系统进化分析采用BLAST和MEGA 6.1等生物信息学软件。【结果】2021年4月从严重呼吸道疾病患者体内分离到一株病毒,经核酸检测和序列分析,结果表明其为H10N3亚型禽流感病毒。从患者居所附近的农贸市场分离到一株基因高度同源的H10N3亚型禽流感病毒。分离株是一种新的基因重配H10N3禽流感病毒,其血凝素hemagglutinin(HA)和神经氨酸酶neuraminidase(NA)组合最早在2019年华东地区的家禽中检测到,6个内部基因来源于近年来中国南方家禽中流行的H9N2病毒。病毒的HA蛋白的裂解位点含有1个碱性氨基酸R,未插入多个碱性氨基酸,理论上不属于高致病性禽流感病毒。HA蛋白受体结合位点228位氨基酸残基由G突变为S,理论上增强了对人SAα2,6受体的亲和力。另外,未发现PB2蛋白E627K突变,但591位氨基酸...     

新型H7N9禽流感病毒的病原学研究进展

2013年初在中国长三角地区首次发现一种新的H7N9禽流感病毒可导致人的感染和死亡。该病毒是由H7、N9以及H9N2禽流感病毒重配而成,病毒传播到其他地区之后仍与当地的H9N2病毒不断重配,产生不同的基因型。H7N9禽流感病毒特殊的双受体结合特性是其突破种属屏障感染人的重要机制,也是该病毒比H5N1禽流感病毒更容易感染人的原因,这种受体特性的分子基础主要与病毒HA蛋白的Q226L和G186V突变有关。H7N9病毒对禽类不致病,但人感染后的病死率超过30%。人群没有免疫力、病毒感染所导致的免疫病理以及病毒在肺部组织的高效复制是导致人感染H7N9病毒后高病死率的重要原因。雪貂动物模型研究也表明该病毒能够在雪貂中有效复制和接触传播。因此,H7N9禽流感病毒导致流感大流行的风险不容忽视,对动物和人群中H7N9禽流感病毒的监测不容松懈。     

江苏首例甲型H1N1(2009)流感病毒分离及其血凝素分子遗传特征分析

2009年6月12日,江苏确诊首例甲型H1N1(2009)病例。通过细胞和鸡胚分离系统,我们分离到一株具有较高血凝活性的病毒,命名为A/Jiangsu/1/2009。为了跟踪病毒的变异情况,我们开展了病毒的全基因组测序工作,在此基础上对其血凝素基因(Haemagglutinin,HA)的遗传特性进行了详细研究。分离株HA蛋白不具有多碱基HA裂解位点,具有低致病性流感病毒特点。与参考株A/California/04/2009相比,分离株A/Jiangsu/1/2009HA蛋白的有4个氨基酸发生了突变,但都不在已知的抗原位点上。分离株有5个潜在糖基化位点,这与近年来古典猪H1N1和北美三源重配猪H1病毒完全一致,保留了古典猪H1的特点。与禽流感H1病毒相比,分离株HA蛋白受体结合位点上的E190D和G225D发生突变,这可能成为新甲型H1N1(2009)在人际间传播的一个重要分子基础。此外,其它受体结合位点上相关氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。本研究首次对早期流行的甲型H1N1(2009)流感病毒的HA蛋白的分子遗传特征进行了详细研究,对进一步监测病原变异具有重要指导意义。     

1株H6N6亚型禽流感病毒分子遗传特性分析

本研究采用无特定病原体(specific pathogen free,SPF)鸡胚,从某活禽市场环境中分离出1株H6N6亚型禽流感病毒(A/environment/Zhenjiang/zj18/2013,en/zj18)。通过二代测序技术进行全基因组测序,通过BLASTn 进行同源性检索,并采用MEGA5.0软件构建系统发生树。基因进化树分析表明,分离株en/zj18的所有8个基因节段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS)均与近年来中国华东地区流行的H6N6亚型禽流感病毒的相应基因位于同一进化分支,与参考株的核苷酸同源性达96.7%～99.6%。分离株en/zj18的HA蛋白裂解位点为PQIETR↓GL,是低致病性禽流感病毒的分子特征。HA蛋白上关键受体结合位点190和228位(按H3亚型的HA蛋白序列排序)氨基酸分别是E和G,理论上更易与α2,3-半乳糖苷唾液酸受体结合。结果提示,需加强活禽市场禽流感病毒的持续监测,从而为有效应对禽流感病毒对公共卫生的持续威胁提供科学依据。     

一株人感染高致病性禽流感(H5N1)病毒基因组分子特征分析

【背景】H5N1禽流感病毒可以感染人类导致重症呼吸道感染,致死率高。【目的】研究我中心确认的一例人感染高致病性禽流感H5N1病毒A/Nanjing/1/2015的可能起源及基因组分子特征。【方法】对病人痰液样本中的H5N1病毒进行全基因组测序,使用CLC Genomics Workbench 9.0对序列进行拼接,使用BLAST和MEGA 5.22软件进行同源性比对和各片段分子特征分析。【结果】该株禽流感病毒属于H5亚型的2.3.2.1c家系,其8个片段均与江浙地区禽类中分离的病毒高度同源,未发现有明显的重配。分子特征显示,该病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白裂解位点为PQRERRRR/G,受体结合位点呈现禽类受体特点,但出现D94N、S133A和T188I氨基酸置换增强了病毒对人类受体的亲和性。神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白颈部在49-68位缺失20个氨基酸,非结构蛋白1 (Non-structure protein,NS1)存在P42S置换和80-84位氨基酸的缺失。其他蛋白中也存在多个增强病毒致病力和对人类细胞亲和力的氨基酸突变。对耐药位点分析发现存在对奥司他韦的耐药突变H_274Y,病毒对金刚烷胺仍旧敏感。【结论】人感染高致病性禽流感H5N1病毒A/Nanjing/1/2015属于2.3.2.1c家系,禽类来源,关键位点较保守,但仍出现了多个氨基酸的进化与变异使其更利于感染人类。H5N1禽流感病毒进化活跃,持续动态监测不能放松。     

禽流感病毒最新研究进展

本文针对2004年爆发的禽流感疫病,回顾了2004年至2005年期间禽流感病毒的研究进展。逆转录聚合酶链式反应技术为禽流感病毒的分型提供了一种快速、可靠、准确的方法。对H5N1禽流感病毒致病机制的研究发现,其强致病性在于它可以躲避人类抗病毒细胞因子的作用,NS1基因编码蛋白的92位谷氨酸在其中发挥了关键作用。由于禽流感疾病多引起结膜炎,并与病毒细胞受体的研究结果相结合,有科学家认为眼部特异性是禽流感病毒的一个总体特征。社会普遍关注禽流感疫苗的研制,人类和禽类流感A型病毒M2蛋白胞外区域的序列比对工作为疫苗研制提供了一条新的思路,依据神经氨酸酶抑制剂抑制病毒的出芽繁殖原理的疫苗正在研制过程中,而利用siRNA预防和治疗禽流感也是很有潜力的一种方法。禽流感病毒研究的另一个热点是病毒基因节段的重配问题。     

人源H5N1禽流感病毒血凝素分子遗传变异特征分析

从GenBank获取已公布的人及相应国家禽感染的H5N1禽流感病毒HA核酸和蛋白序列,用生物软件ClustalX1.83和MEGA4.0对HA基因序列和蛋白分析,构建HA核苷酸遗传进化树.结果表明,HA蛋白上再次出现既能与人又能与禽受体特异性结合的QNG;东南亚和东亚人感染毒株亲缘关系密切,西亚、南亚和非洲人感染毒株遗传距离近;进化树组成和HA蛋白关键位点氨基酸的变异,揭示多数国家的人感染的毒株与当地禽感染毒株高度同源,具有地域性特征,部分国家之间存在着病毒扩散现象.     

一株重组鸭源H5N2亚型禽流感病毒分子进化分析

2016年对武汉地区家禽市场进行常规流感监测,分离鉴定到1株H5N2亚型禽流感病毒。本研究对该株病毒进行了全基因组测序,分子特征和遗传进化分析。结果显示该株病毒的HA基因属于Clade2.3.4.4分支,HA蛋白的裂解位点处具有多个连续碱性氨基酸,具备高致病性禽流感病毒的典型分子特征。序列比对分析显示该株病毒的各基因节段分别与H5不同亚型的禽流感病毒具有较高的相似性,推测该分离株为重组病毒。继续开展对家禽市场H5亚类流感病毒的分子流行病学调查,对研究高致病性流感病毒的变异和进化,以及对禽流感的综合防控有着重要的意义。     

为H5N1疫苗研发提供精准靶标

正日前,清华大学和中科院上海巴斯德研究所科研人员合作,在高致病性禽流感病毒H5N1康复者体内抗体识别和保护机制方面取得进展,相关成果发布于《自然-通讯》。前期研究结果表明,季节性流感病毒HA是保护性抗体识别的关键组成部分。但是,科学家对高致病性禽流感H5N1感染者体内保护性抗体识别的靶点、结构与功能特征知之甚少。本次研究中,科研人员对高致病性禽流感病毒H5N1康复者体内的抗体反应进行了系统评估。在获得     

人高致病性禽流感病毒H5N1安徽株HA、M2蛋白双顺反子表达载体的构建及表达研究

将我国分离的人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和M2基因片段并克隆至DNA疫苗表达载体pVRC中,构建成真核表达质粒。为提高HA的表达量,按照人偏爱密码子将HA基因进行优化改造,经全基因合成后插入真核表达载体pVRC,以β-actin蛋白为内参比证明了优化后的HA蛋白表达效果明显提高。将M2基因和优化后的HA基因共同克隆入双顺反子表达载体pIRES中,获得同时表达HA或M2的双顺反子真核表达质粒;通过Western blot和间接免疫荧光检测方法,确认构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和M2。通过上述结果为进一步开展人高致病性禽流感病毒安徽株HA和M2基因的功能与致病性研究及使用表达HA和M2蛋白进行新型人用禽流感双价疫苗研发奠定基础。     

通用型H5亚型禽流感病毒亚单位疫苗抗原表达和免疫效力研究

H5亚型高致病性禽流感病毒因其变异快、感染性和致病性强等特点严重威胁着家禽业和人类健康。为研制具有广谱保护性的H5亚型禽流感病毒通用型亚单位疫苗,本研究分析和对比各分支H5亚型禽流感病毒的HA蛋白基因,获得HA蛋白基因共有序列,采用杆状病毒表达系统构建和表达重组HA蛋白。经IFA、Western Blot、微量血凝试验等方法鉴定重组HA蛋白,结果显示重组HA蛋白在昆虫细胞中得到正确表达,血凝效价达13log2,且与禽流感Re6、Re7和Re8阳性血清均具有较好的交叉反应活性。免疫效力试验结果显示,重组HA蛋白疫苗组血清抗体能与H5亚型禽流感病毒Re6、Re7和Re8检测抗原反应,且能诱导机体产生较高水平IFN-γ和IL-4。该研究结果可为H5亚型禽流感通用型亚单位疫苗研发提供试验基础和科学依据。     

整合HA蛋白的HIV假病毒展示禽流感病毒感染宿主细胞机制

通过将高致病性禽流感病毒HA蛋白整合到HIV颗粒,包装成表达HA蛋白的假病毒粒子（命名为HIV/H5-HA）,并对所包装的假病毒的生物学功能进行了研究.通过RT PCR获得了H5N1亚型禽流感病毒完整的血凝素基因(HA)并克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,通过与假病毒构建体系的2种质粒pCMV△8.2和pHR′-CMVLacZ共转染293T细胞,包装成假病毒颗粒.利用LacZ染色和HA假病毒颗粒感染MDCK等6种细胞株并对标记基因LacZ进行检测.结果表明,HIV/H5-HA与天然的禽流感病毒相似,具有广泛的细胞嗜性; Western 印迹和FACS检测结果,和HA假病毒颗粒的电镜照片确认了HA基因在假病毒颗粒表面得到了表达;HIV/H5-HA能够凝集鸡红细胞,并且pH值依赖性测定表明,HA假病毒需要低pH值才能实现正确的入侵宿主细胞.本研究结果显示：禽流感病毒H5N1亚型的HA基因得到了有效的包装,并且所包装的假病毒颗粒能够表达具有高度生物活性的HA蛋白.同时,假病毒模型的建立为进一步研究禽流感病毒与宿主之间的免疫应答提供了一种新的途径.     

中国首次检出的H12N2亚型禽流感病毒的基因组特征和系统进化分析

本实验室自2011年开始在鄱阳湖周边地区开展家禽养殖户和活禽市场环境中的禽流感病毒监测,在2011~2016年的监测过程中,通过病毒分离和深度测序,发现了一株H12N2亚型禽流感病毒,这是在中国首次检出该亚型病毒。该标本来自一份鸭粪便标本,采集自江西省余干县的一个家禽养殖场。病毒的8个片段分别与来自鸭或者野禽中的病毒最为接近。对病毒的全基因组系统进化分析表明,该病毒属于欧亚谱系。HA蛋白裂解位点序列为PQAQDR/GLF,属于低致病性禽流感病毒,受体结合位点分析表明病毒对α-2,3唾液酸受体亲和力较好。病毒NA的茎部没有氨基酸的缺失,但是PB1蛋白的L13P和L473V可以增强病毒聚合酶在哺乳动物中复制的能力和病毒对于哺乳动物的毒性。M1蛋白N30D突变和T215A突变提示会增加流感病毒对于哺乳动物的致病性。本次从家禽养殖场环境中检出野鸟相关的禽流感病毒进一步说明了在该地区进行禽流感病毒监测的重要性,以及在家禽-野鸟界面加强生物安全措施的必要性,需要持续进行监测,为禽流感病毒的暴发提供预警,为人感染禽流感病毒提供风险评估的依据。     

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒分子进化分析

2005年在广东进行流行病学调查时分离到一株鹦鹉源禽流感病毒,经鉴定为H5N2亚型禽流感病毒(A/Parrot/Guangdong/268/2005)。该毒株的HA裂解位点附近的氨基酸序列为RETRGLF,只含有一个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒的HA裂解位点附近氨基酸序列的分子特征;与H5N2亚型禽流感代表毒株相比,该毒株HA和NA基因的糖基化位点、HA基因的受体结合位点编码区、NA基因的耐药性位点均未发生变异。将该毒株全基因组序列与GenBank已公布的19株H5N2亚型禽流感病毒株的相应序列进行比较分析并绘制系统进化树后发现:其与低致病性禽流感毒株A/Pheasant/NJ/1355/1998(H5N2)-like的亲缘关系最近,位于以A/Chicken/Pennsylvania/1/1983(H5N2)为代表的美洲进化分支。     

广州市两株人感染H5N6禽流感病毒全基因组序列特征分析

H5N6禽流感是重要的人兽共患病,给公共卫生带来严重威胁。为研究人感染H5N6禽流感病毒的基因特征,本文对广州市两株人感染H5N6禽流感病毒进行全基因组序列扩增,应用生物信息学软件分析分子变异和遗传进化特征。结果显示:两毒株各基因片段同源性存在差异,血凝素(Hemagglutinin,HA)基因同源性最高为98.3%,PB2基因同源性最低为85.2%。A/Guangzhou/41641/2014(H5N6)病毒的HA、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)、聚合酶碱性蛋白2(Polymerase basic protein 2,PB2)基因与猫源毒株A/feline/Guangdong/1/2015(H5N6)亲缘关系较近,推测可能起源于共同祖先。两株病毒均为禽源高致病性病毒,HA和NA表面蛋白受体结合位点、裂解位点和耐药位点未发生变异。内部基因重要位点均有不同程度的变异,其中以41641病毒变异较大,并发生PB2蛋白E627K突变。两株病毒均发生与不同亚型病毒之间的重组现象,41641病毒的内部基因分别与H5和H9N2/H7N9发生重组,其中PB2和PB1基因分别与2013年暴发的华南分支和华东分支H7N9禽流感病毒亲缘关系相近,A/Guangzhou/37845/2015(H5N6)病毒的内部基因与H5N1/H5N6病毒发生重组。因此,广州市两株人感染H5N6禽流感病毒进化起源不同,属于两种不同的基因型,本研究推测2013年暴发的H7N9禽流感病毒在新型H5N6重组病毒的进化过程中起到重要作用。     

H5N1型禽流感病毒广谱中和单克隆抗体的筛选及其中和机制初步研究

利用杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒的血凝素蛋白(HA),纯化后的重组蛋白HA免疫小鼠并制备杂交瘤单克隆抗体,用H5N1型禽流感病毒的全病毒进行筛选,成功地获得了抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA的单抗.MDCK细胞微量中和试验表明,单抗8G10D7可对clade2和clade9的H5N1型禽流感病毒起中和作用.Western-blot及血凝抑制实验进一步证明了该单抗的结合位点位于HA蛋白的HA1亚基上.鸡胚感染病毒预防试验结果表明,8G10D7对禽来源的和人来源的H5N1型禽流感病毒均可达到100%的保护率;在治疗试验组中,8G10D7对禽来源的病毒感染具有较高的保护率,可达100%,对人来源的H5N1型禽流感病毒最高也可达87.5%的保护率.该抗体的获得不仅为H5N1型高致病性禽流感病毒的预防和治疗带来了希望,同时其中和位点的发现也为以后亚单位疫苗的研制提供新的思路.     

高致病性禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和表位模拟肽的筛选与鉴定

以H5N1型禽流感病毒HA蛋白广谱中和单抗8H5为基础,利用噬菌体展示肽库技术及类病毒颗粒融合表达技术研究HA模拟表位。ELISA检测结果显示:筛选获得模拟HA表位的模拟肽123,进行类病毒颗粒融合蛋白表达后,仍具有与8H5单抗特异结合的能力。免疫荧光检测结果说明,类病毒颗粒免疫小鼠后产生了能与HA交叉反应的抗体。禽流感病毒HA模拟表位的研究与性质的分析及类病毒颗粒融合蛋白的表达与活性分析、免疫原性分析,都为研制禽流感通用表位疫苗奠定了基础。     

整合禽流感病毒血凝素糖蛋白的假型鼠白血病病毒

本研究通过一个瞬时转染系统将H5N1亚型鹅源禽流感病毒囊膜表面的血凝素(HA)糖蛋白整合到鼠白血病病毒(MuLV)颗粒表面并进行了感染性测定。将包含HA基因的真核表达质粒pcDNA-HA与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHIT111(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)瞬时共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T,48小时后收集假病毒上清进行了一系列鉴定。将假病毒上清超速离心后用抗H5亚型禽流感病毒的多抗通过Western-blot证实HA 蛋白能够在此假病毒颗粒表面表达,表明HA能够整合到此病毒粒子表面。通过感染293T、COS 7和NIH3T3 三种不同的靶细胞,均能检测到LacZ基因的表达,证实所构建的假病毒粒子具有感染性。本研究成功构建了具有感染性的MuLV-HA假病毒,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法。