肝细胞的异质性：葡萄糖和酮体在大鼠肝脏的代谢

用大鼠肝脏门静脉或肝静脉周围的肝细胞来研究葡萄糖和酮体生成的区域分布。肝细胞通过毛地黄皂苷－胶原酶灌流技术分离。门静脉周围肝细胞的ｒ谷氨酰转肽酶的活性比肝静脉周围肝细胞高２．４倍;而谷氨酰胺合成酶的活性则相反,肝静脉周围肝细胞高出５６倍。门静脉周围肝细胞的内源性葡萄糖合成比肝静脉周围肝细胞高１．５７倍。给予刺激葡萄糖异性的底物,门静脉周围肝细胞的葡萄糖合成则增加１．７－２．１倍。肝静脉周围肝细胞的     

大鼠肝部分切除术后mTOR信号通路对肝再生的作用

目的:探讨mTOR信号通路对大鼠肝部分切除术后肝细胞蛋白质合成功能及肝细胞大小的影响。方法:采用Sprague-Dawley雄性大鼠70％肝切除模型和肝细胞分离与培养方法,在术后不同的时相点分离残肝的肝细胞,进行培养。实验分组:分离的残肝肝细胞分两组:对照组(Control组、C组)、雷帕霉素组(Rapamycin组、R组)。采用Western blot方法检测磷酸化mTOR蛋白在不同时相点的变化;采用3H-亮氨酸(3H-Leucine)掺入法测定肝细胞蛋白质合成;扫描电镜(AMRAY 1000B,US)获取肝细胞图像,病理图像分析系统(北航CM2000B)测定细胞面积。结果:1)C组中,磷酸化mTOR蛋白的含量由0h开始升高,6h达到高峰,以后即降低,而R组明显较C组含量降低;2)在术后的各时相点,C组的肝细胞的蛋白质合成率较R组显著升高(P<0．05),而且随时间点的延长,蛋白质合成率呈上升趋势;3)在2h和6h时相点C组肝细胞面积较R组显著增大(P<0．05)。但是,在C组肝细胞24h时相点面积较2h和6h减小(P<0．05)。结论:体外实验证实,肝部分切除术后mTOR信号通路即活化,促进肝细胞的蛋白质合成和细胞生长。因此,我们推测mTOR信号通路在肝再生过程中发挥重要作用。     

原位胶原酶循环灌注法分离猪肝细胞

本文建立了原位胶原酶循环灌注分离猪肝细胞方法并与离体两步胶原酶灌注法进行了比较。猪门静脉和下腔静脉分剐插管,先用D-Hanks液灌注,再采用自制的循环灌流装置进行胶原酶循环原位灌注分离猪肝细胞,分离后的肝细胞以5×105/ml培养,观察分离和培养7d的肝细胞产量、活率、蛋白质合成功能、葡萄糖合成功能和LDH含量。同时测定离体组的上述指标。研究结果表明采用原位胶原酶循环灌注法每克肝组织分离获得的肝细胞总量为5.1×107,肝细胞活率98.6％,培养7d肝细胞活率89.5％。肝细胞的蛋白质合成功能在培养7d中保持稳定;葡萄糖合成功能从1d时1.05±0.15nmol/cell下降到3d时0.74±0.09nmol/cell;LDH含量在3d较高。原位胶原酶循环灌注法分离的猪肝细胞总量、活率高于离体法;蛋白质合成功能和葡萄糖合成功能强于离体法。因此,原位胶原酶循环灌注分离猪肝细胞方法可获得大量高活率和良好功能的猪肝细胞。     

肝细胞的异质性：葡萄糖和酮体在大鼠肝脏的代谢

用大鼠肝脏门静脉或肝静脉周围的肝细胞来研究葡萄糖和酮体生成的区域分布。肝细胞通过毛地黄皂苷－胶原酶灌流技术分离。门静脉周围肝细胞的γ谷氨酰转肽酶的活性比肝静脉周围肝细胞高２．４倍;而谷氨酰胺合成酶的活性则相反,肝静脉周围肝细胞高出５６倍。门静脉周围肝细胞的内源性葡萄糖合成比肝静脉周围肝细胞高１．５７倍。给予刺激葡萄糖异生的底物,门静脉周围肝细胞的葡萄糖合成则增加１．７－２．１倍。肝静脉周围肝细胞的内源性酮体生成比门静脉周围肝细胞高１．３倍。给予能明显刺激酮体生成的辛酸盐,肝静脉周围肝细胞的酮体生成仅略为增加。我们的结果证实,在基础和刺激的条件下,葡萄糖的异生在门静脉周围肝细胞中优先,而酮体生成仅在肝静脉周围肝细胞占微弱的优势。     

脂肪细胞在肝细胞胰岛素耐受过程中的作用

目的研究脂肪细胞在不同分化阶段对肝细胞胰岛素抵抗的影响。方法体外诱导3T3-L1脂肪前体细胞分化,细胞内脂滴增加,逐步分化成脂肪细胞。采用不同分化阶段脂肪细胞（未分化0 d、中期分化4d、接近完全分化8d）与原代肝细胞共培养。Western印迹法检测共培养后肝细胞内胰岛素信号通路的反应性;葡萄糖同位素标记方法检测肝细胞糖原合成能力。结果以未共培养的肝细胞为对照组,共培养后肝细胞内胰岛素受体底物-2酪氨酸磷酸化（Tyr^612）（pIRS-2）水平及Akt磷酸化（Ser^473）（pAkt）水平均显著下调;肝糖原合成能力明显降低;与较成熟脂肪细胞共培养后,肝细胞pIRS-2及pAkt水平与其他分化阶段组共培养比较下调明显,肝糖原合成能力随着脂肪细胞的成熟而明显降低。结论脂肪细胞可能诱导肝细胞发生胰岛素抵抗,肝细胞胰岛素信号通路的阻滞程度与脂肪细胞的分化程度呈正相关。     

肝细胞生长因子刺激大鼠离体肝细胞DNA合成的剂量—与时间—效应

本工作采用３ＨＴｄＲ掺入ＤＮＡ法观察重组人肝细胞生长因子（ｒｈＨＧＦ）刺激大鼠离体肝细胞ＤＮＡ合成的剂量与时间效应。实验结果表明：ｒｈＨＧＦ是最强的促肝细胞分裂剂,在一定剂量范围内,ｒｈＨＧＦ与肝细胞ＤＮＡ合成有明显的量效关系。１ｎｇ／ｍｌｒｈＨＧＦ即可引起３ＨＴｄＲ掺入显著增加（Ｐ＜０．０１）,随剂量增加,刺激ＤＮＡ合成的效应也随之增强;１０ｎｇ／ｍｌ时３ＨＴｄＲ掺入量最大,较对照组高７倍（Ｐ＜０．００１）,剂量再增加即出现抑制效应;ｒｈＨＧＦ刺激肝细胞ＤＮＡ合成存在时间效应关系,表现为ｒｈＨＧＦ作用２４ｈ,ＤＮＡ合成量明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）,４８ｈ作用达最高（Ｐ＜０．００１）,随后开始下降,至９６ｈ下降到相当于２４ｈ的水平。     

胰岛素对小鼠原代肝细胞甘油三酯合成分解代谢的影响

目的：建立小鼠肝细胞体外培养的方法,研究不同浓度胰岛素对肝细胞甘油三酯合成代谢、分解代谢及甘油三酯含量的影响。方法：通过肝脏灌注和胶原酶消化分离小鼠肝细胞,密度梯度离心纯化后,进行体外培养。在0 nmol/L,50 nmol/L,100 nmol/L,200 nmol/L胰岛素存在的情况下培养,通过3H标记的甘油测定细胞内甘油三酯合成速率,使用3H标记的油酸预孵育,加入triacsin C抑制脂肪酸重酯化,追踪掺入3H的甘油三酯分解的速率。采用甘油三酯检测试剂盒,测定不同浓度胰岛素对细胞内甘油三酯含量的影响。结果：成功分离了小鼠原代肝细胞,存活率达90%。50 nmol/L胰岛素对细胞甘油三酯含量及甘油三酯合成分解速率影响较小。100 nmol/L胰岛素可显著增加甘油三酯合成速率,减低分解速率,使细胞内甘油三酯含量增加。200 nmo/L胰岛素反而降低甘油三酯合成速率,细胞内甘油三酯含量少于对照组（0 nmol/L）。结论：本研究成功建立了小鼠原代肝细胞分离培养的方法,使用3H标记物敏感的检测肝细胞内甘油三酯合成分解速率。研究发现,过高浓度的胰岛素反而抑制肝细胞甘油三酯的储积。     

异常凝血酶原检测和临床意义

异常凝血酶原检测和临床意义余永卫综述卢玉英审校广西医科大学第一附院内科５３００２１凝血酶原是在肝脏内合成的维生素Ｋ依赖性凝血因子，患各种严重肝脏疾病时，可因肝细胞损害和ＶｉｔＫ摄取、吸收及利用障碍［１］，肝细胞微粒体内仅能合成缺乏４－羧基的异常维生素...     

胰岛素对鹅原代肝细胞增殖及蛋白合成的影响

通过用不同浓度胰岛素培养天府肉鹅（Ansercygnoides）原代肝细胞探讨胰岛素对鹅原代肝细胞增殖及蛋白合成的影响。结果表明：与对照组相比,0—200nmol／L胰岛素对肝细胞上清液中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）浓度没有显著影响,表明细胞功能正常;100、150和200nmol／L胰岛素显著增加细胞培养上清液中总蛋白（什）和白蛋白（ALB）浓度;Brdu．ELISA法检测DNA合成实验结果表明经胰岛素处理后显著增加鹅原代肝细胞增殖率。因此,胰岛素能促进鹅原代肝细胞的细胞增殖及蛋白合成。     

猪肝刺激物质pHSS对离体肝细胞DNA合成的影响

应用[~3H]TdR掺入离体培养大鼠肝细胞DNA的方法,测定由本室提取的pHSS的生物活性。结果表明,pHSS可显著促进原代培养大鼠肝细胞的DNA合成,其促进率约为对照组的10倍左右。培养液中血清浓度对pHSS的生物活性表达有显著影响,不同浓度血清可以使pHSS表现出不同的量效关系,这些结果在Buffello大鼠肝细胞系的实验中得到进一步证实。在低剂量pHSS的刺激下,不同年龄大鼠肝细胞的[~3H]TdR掺入率无显著差异。但高剂量时,pHSS对幼鼠作用不明显。     

维生素E、微量元素锌和硒对大鼠体外原代肝细胞及储脂细胞胶原代谢的影响

对维生素E、微量元素锌和硒对大鼠肝脏细胞胶原代谢的调控进行了体外研究。结果表明:肝细胞和储脂细胞均参与肝脏的胶原代谢;环境中维生素E浓度的提高可抑制肝细胞和储脂细胞的核酸合成,对细胞蛋白合成的促进作用不明显,但对细胞胶原蛋白的合成却有选择性抑制作用;环境中微量元素锌和硒浓度的适当提高对肝细胞和储脂细胞的核酸增殖和蛋白质合成均有明显促进作用,但对细胞胶原蛋白合成具有相对抑制作用,若锌和硒的浓度过高则对细胞有损害。总之,营养环境的不同将大大影响肝脏胶原的代谢,因此对肝病病人给予合理的营养膳食可能有助于防止肝硬化的恶化。     

大鼠再生肝细胞的分离和培养

建立大鼠2/3肝切除模型,分别于术后恢复0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h等时间点,采用原位胶原酶消化和密度梯度离心法分离、纯化再生肝细胞,获得的再生肝细胞活性95%以上,纯度96%以上。用DMEM培养液添加其他物质后培养再生肝细胞,在培养的96 h内,肝细胞生长状态良好,具有分泌白蛋白和合成尿素的功能。细胞的DNA合成主要在培养24 h以后,72 h时达到高峰。     

肝细胞生长因子

肝细胞生长因子吴青（中山大学生命科学学院,广州５１０２７５）关键词肝细胞生长因子１９８４年,ＭｉｃｈａＬｏｐｏｕｌｏｓ发现部分肝切除后的大鼠血浆中含有一种能刺激肝细胞ＤＮＡ合成的物质,１９８８年Ｇｏｈａｌａ从暴发性肝衰竭病人血浆中分离出类似物质。该类...     

HCV NS5A通过抑制p-AMPK并上调固醇调节元件结合蛋白2及HMG-CoA还原酶促进小鼠肝细胞胆固醇合成北大核心CSCD

已有研究证明,丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)可诱导肝细胞脂肪变性。本文报告,HCV NS5A刺激肝细胞胆固醇合成,引起脂代谢失调,促进肝脂肪变性。首先,我们构建了由小鼠甲胎蛋白增强子和小鼠白蛋白启动子驱动的NS5A及NS5A domainⅠ、Ⅱ和Ⅲ的慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒后通过尾静脉注射感染小鼠。小鼠血清总胆固醇测定及肝组织切片苏木精-伊红染色揭示,与模拟注射对照及增强绿色荧光蛋白(EGFP)慢病毒颗粒处理小鼠比较,NS5A慢病毒颗粒处理小鼠血清总胆固醇水平明显升高;肝细胞内脂滴明显增多。免疫组化和RTq PCR分析显示,胆固醇合成的关键调节酶HMG-CoA还原酶(HMGCR)在NS5A慢病毒处理的小鼠肝内表达显著升高。蛋白质印迹结果证明,与模拟注射及EGFP慢病毒颗粒处理的小鼠比较,NS5A慢病毒颗粒处理的小鼠肝细胞磷酸化的腺苷一磷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)水平明显降低,而固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)及其靶基因HMGCR的水平显著升高。进一步研究发现,NS5A domainⅡ慢病毒颗粒处理的小鼠肝细胞p-AMPK、SREBP-2和HMGCR表达水平与全长NS5A慢病毒处理的小鼠相似。上述结果提示,HCV NS5A蛋白可通过抑制AMPK磷酸化激活,上调SREBP-2而促进胆固醇合成的限速酶HMGCR的表达,从而促进小鼠肝细胞胆固醇合成。上述结果还提示,NS5A domainⅡ可能是全长NS5A蛋白调节HMGCR基因表达的有效片段。总之,本研究证明,HCV NS5A可引起胆固醇代谢紊乱,这可能是慢性HCV感染引起肝脂肪变性的机制之一。很遗憾,在本研究中,尚未测定SREBP-1的靶基因乙酰CoA羧化酶(脂肪酸合成的限速酶)的表达,相关实验正在进行中。     

HCV NS5A通过抑制p-AMPK并上调固醇调节元件结合蛋白2及HMG-CoA还原酶促进小鼠肝细胞胆固醇合成

已有研究证明,丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)可诱导肝细胞脂肪变性。本文报告,HCV NS5A刺激肝细胞胆固醇合成,引起脂代谢失调,促进肝脂肪变性。首先,我们构建了由小鼠甲胎蛋白增强子和小鼠白蛋白启动子驱动的NS5A及NS5A domainⅠ、Ⅱ和Ⅲ的慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒后通过尾静脉注射感染小鼠。小鼠血清总胆固醇测定及肝组织切片苏木精-伊红染色揭示,与模拟注射对照及增强绿色荧光蛋白(EGFP)慢病毒颗粒处理小鼠比较,NS5A慢病毒颗粒处理小鼠血清总胆固醇水平明显升高;肝细胞内脂滴明显增多。免疫组化和RTq PCR分析显示,胆固醇合成的关键调节酶HMG-CoA还原酶(HMGCR)在NS5A慢病毒处理的小鼠肝内表达显著升高。蛋白质印迹结果证明,与模拟注射及EGFP慢病毒颗粒处理的小鼠比较,NS5A慢病毒颗粒处理的小鼠肝细胞磷酸化的腺苷一磷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)水平明显降低,而固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)及其靶基因HMGCR的水平显著升高。进一步研究发现,NS5A domainⅡ慢病毒颗粒处理的小鼠肝细胞p-AMPK、SREBP-2和HMGCR表达水平与全长NS5A慢病毒处理的小鼠相似。上述结果提示,HCV NS5A蛋白可通过抑制AMPK磷酸化激活,上调SREBP-2而促进胆固醇合成的限速酶HMGCR的表达,从而促进小鼠肝细胞胆固醇合成。上述结果还提示,NS5A domainⅡ可能是全长NS5A蛋白调节HMGCR基因表达的有效片段。总之,本研究证明,HCV NS5A可引起胆固醇代谢紊乱,这可能是慢性HCV感染引起肝脂肪变性的机制之一。很遗憾,在本研究中,尚未测定SREBP-1的靶基因乙酰CoA羧化酶(脂肪酸合成的限速酶)的表达,相关实验正在进行中。     

大鼠胚肝的正常发育与甲胎蛋白的变化

本文报导大鼠胚肝及新生鼠肝正常发育的组织学观察和利用免疫酶标技术观察胚鼠及新生鼠肝内AFP的分布情况。发现3'-MeDAB诱癌过程中所见一至四级分化的肝细胞癌,其细胞形态基本上反映了正常肝细胞分化发育的逆转,反映了肝细胞的去分化。但是AFP在这些癌细胞里的重现却与AFP在相应分化程度的胚肝细胞中的合成情况不完全一致。本文并就肝外其他胚胎组织合成AFP的问题进行了一些观察和讨论。     

肝细胞FGF21——新发现的机体水平衡调控因子

成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor21, FGF21)由肝细胞合成并分泌入血,可穿越血脑屏障;该分子属FGF家族,由fgf21基因编码;单次跨膜蛋白β-Klotho是FGF21的辅助受体,FGF21通过β-Klotho与FGF受体(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)结合,使β-Klotho与FGF受体发生二聚化及自磷酸化,进而激活其信号传导。     

乳猪肝细胞短期培养后的低温保存

本文对乳猪肝细胞短期培养后冻存法和直接冻存法进行比较。采用改良原位两步胶原酶灌注法分离乳猪肝细胞,将肝细胞接种到含10％DMSO、激素、生长因子和10％NBS的RPM1 1640培养基中,用阶段性冻存法保存肝细胞,分别对直接冻存和培养后冻存10天、20天复苏的肝细胞进行培养,动态观察其活率和功能。研究结果表明各组复苏后的肝细胞均保持较高的活率;短期培养后冻存组肝细胞活率、G-6-Pase活性、白蛋白和葡萄糖合成功能及安定转化能力均较直接冻存组为高;LDH活性低于直接冻存组;冻存时间的长短对其白蛋白、尿素和葡萄糖合成功能有一定影响。因此,短期培养后冻存法较直接冻存法为好。     

新生牛肝脏再生刺激物质的部分纯化及生物学特性

新生牛肝胞浆液中存在刺激肝细胞DNA合成的物质,经过一定的分离提纯,可使其杂蛋白含量降低770倍,特异活性提高26.7倍。在无血清培养条件下,可使成年原代大鼠肝细胞和肝源性肿瘤细胞DNA合成分别增加5倍及7.2倍左右。HSS为耐热的蛋白质,一定的酸碱及变性剂可使活性丧失,主要活性成分的分子量在43—67KD之间,但小于10KD的物质亦具有一定的活性。该实验结果提示:HSS很可能是正常肝细胞分裂与再生时共同的调节因子。     

草鱼不同组织胆汁酸组成分析

正胆汁酸是由胆固醇通过一系列酶促反应在肝细胞中合成的,根据侧链羟基数目的多少胆汁酸分为初级胆汁酸和次级胆汁酸。初级胆汁酸随食物到达肠道,在肠道微生物的作用下脱羟基形成次级胆汁酸~([1])。初级胆汁酸和次级胆汁酸都可与牛磺酸或者甘氨酸结合形成结合型胆汁酸。肝脏中合成的以及经由肠肝循环回到肝脏的胆汁酸都被储存在胆囊中。胆汁酸的主要生理功能是帮助脂溶性营养物质的消化吸收,高脂肪的摄入刺激胆汁酸