高危型人乳头瘤病毒基因组整合的研究进展

高危型人乳头瘤病毒(HPV)基因组整合在宫颈癌等多种肿瘤中被发现。流行病学和实验证据支持高危型HPV基因组整合在宫颈癌等相关肿瘤中起重要作用,其发生可能与宿主染色体不稳定和DNA甲基化相关。近年来发现克隆选择与干扰素通路相关。另外,整合对宿主细胞基因影响和整合位点检测方法方面的研究也取得了重要进展。本文就高危型HPV基因组整合研究的最新进展作一综述。     

人乳头瘤病毒11型L2NE7E6融合蛋白的原核表达及其诱发的T细胞免疫反应

目的:在原核表达系统中表达人乳头瘤病毒11型(HPV11)L2NE7E6融合蛋白,纯化蛋白后免疫小鼠,检测其诱发的T细胞免疫水平,并筛选HPV11 E6、E7特异的T细胞表位肽。方法:用重叠PCR方法构建HPV11L2NE7E6融合基因并插入原核表达质粒,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达融合蛋白L2NE7E6,用SDS-PAGE和West-ern印迹鉴定融合蛋白的表达。Q柱纯化蛋白后免疫C57BL/6小鼠,分别用覆盖HPV11 E6和E7蛋白序列的肽库,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测其诱发的E7、E6特异的T细胞免疫反应,并筛选E7、E6特异的T细胞表位肽。结果:在原核表达系统中有效表达了HPV11 L2NE7E6融合蛋白,蛋白纯化后免疫C57BL/6小鼠,分别能检测到针对HPV11 E6、E7肽库刺激产生的特异性T细胞免疫反应。经肽池筛选到1条强的E6 T细胞表位肽E6aa41-55(AEI-YAYAYKNLKVVW);而E7只筛选到2条弱的T细胞表位肽,分别为E7aa53-67(QILTCCCGCDSNVRL)和E7aa73-87(DGDIRQLQDLLLGTL)。结论:HPV11 L2NE7E6融合蛋白能诱发小鼠产生E6、E7特异性细胞免疫反应,可作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。     

人乳头瘤病毒16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒的构建及鉴定

目的：构建人乳头瘤病毒16型与11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒并对其进行鉴定。方法：采用：PCR法从尖锐湿疣组织标本中扩增人乳头瘤病毒11型晚期基因L1,并对其进行克隆测序;利用基因重组技术将人乳头瘤病毒16型和11型L1晚期基因共同装入杆状病毒转移载体中,分别位于强启动子Ppolh和弱启动子P10之下;利用酶切和PCR技术对双价重组杆状病毒转移质粒进行鉴定。结果：PCR扩增法获得尖税湿疣组织中感染的人乳头瘤病毒11型的L1基因,得到人乳头瘤病毒16型L1和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒,经酶切电泳鉴定验证重组成功。结论：本研究成功构建了双价重组杆状病毒转移质粒,为进一步构建双价L1蛋白表达系统进而建立双价基因工程亚单位疫苗打下基础。     

重组人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒诱导中和抗体

为研究重组病毒样颗粒（virus-like particle,VLP)免疫血清的抗感染作用,用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的人乳头瘤病毒6型（human papillomavirus type 6,HPV-6)L1 VLP的HPV－6L1＋L2 VLP免疫BALB／c小鼠,获得抗血清,ELISA法测定抗体滴度,在细胞水平和裸鼠异源组织移植模型中评价了免疫血清的中和病毒抗感染作用。VLP诱导了高滴度（＞1：10000）的血清抗体,抗血清可以特异地阻断人胚上皮细胞对VLP的摄入,并且能抑制从尖锐湿疣活检标本提取的HPV对人上皮细胞的感染。重组HPV－6VLP免疫小鼠诱导的血清抗体具有中和病毒、抑制感染的作用。提示重组VLP可以用于研制HVP预防性疫苗。     

人乳头瘤病毒与细胞凋亡

近来研究表明病毒感染与细胞凋亡有着密切的关系。在研究中发现,许多病毒参与细胞凋亡的诱导和抑制,在这些过程中相关病毒的基因的表达起着关键作用,而细胞凋亡相关因子直接或间接参与这一过程,对于这些问题有助于阐明病毒感染后病毒和细胞相互作用的分子机理。本文对人乳头瘤病毒的E6、E7、E2、和E5等基因及表达蛋白与细胞凋亡相关因子p53、pRB等相互作用,以阐述HPV的致癌机理。     

人乳头瘤病毒11型L1主要衣壳蛋白的B细胞表位多肽作为疫苗的研究

分析了人乳头瘤病毒11型(HPV11)L1主要衣壳蛋白的B细胞优势表位,并以此为基础研制表位多肽疫苗。研究中采用Goldkey和．PC／Gene软件系统,分析HPV11的L1主要衣壳蛋白的二级结构、抗原性、B细胞表位,并引人氨基酸抗原性指数,综合评估其B细胞优势表位。Fmoc固相合成表位多肽,高效液相层析方法纯化,毛细管电泳分析其纯度。与0．2ml佐剂完全乳化后,按50μg／只的剂量免疫小鼠,进行动物水平的免疫效果评价。取免疫小鼠血清,与HPV11 DNA阳性的尖锐湿疣患者的疣体上清液结合,鉴定免疫后小鼠所产生抗体的特异性。发现HPV11的L1主要衣壳蛋白的第426～439位和第487～501位具有较高的免疫原性,可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高,且该抗体与人尖锐湿疣的疣体组织上清液呈阳性反应。说明所选这两个肽段为HPV11的L1主要衣壳蛋白的B细胞优势表位,但是否具有功能特异性,尚需进一步研究。     

人乳头瘤病毒重组细胞模型应用的研究进展

人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）为双链环状小DNA病毒,它不仅能引起黏膜上皮的良性增生,也可以导致癌症如宫颈癌、阴茎癌、口咽癌的发生。HPV重组细胞模型的建立及其分化培养,可以应用于HPV早期感染、HPV感染对宿主细胞生命周期影响的研究,也可进一步诱导,用于深入研究DNA损伤修复途径对病毒复制的影响、以及HPV整合机制。本文将主要围绕HPV重组细胞模型的建立、分化培养的方法以及重组细胞模型的应用进行综述。     

人乳头瘤病毒致癌机制的研究进展

宫颈癌发病率居全球女性恶性肿瘤的第二位,每年约有50万宫颈癌新发病例,其中80％在发展中国家,我国每年约有新发病例13．15万,占世界新发病例的28．8％。近年来宫颈癌发病年龄趋向年轻化,从原来的40-50岁提前到35岁左右。人     

MTT实验检测重组人角质细胞生长因子-2诱导不同细胞系增殖的差异

目的:用MTT法检测重组人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)诱导不同细胞系增殖的差异,建立验证rhKGF-2生物活性的细胞模型.方法:利用载体pBV220-KGF-2原核表达和纯化rhKGF-2,然后用MTT法分别检测rhKGF-2诱导大鼠气管上皮细胞RTE、大鼠小肠上皮细胞IEC-6、小鼠成纤维细胞NIH/3T3...     

人永生化角朊细胞表达干细胞表型的流式细胞术分析

观察人永生化角朊细胞系HaCaT细胞表达的几种干细胞表型,为以该细胞系构建人组织工程皮肤和进行基因操作提供相应的实验依据。方法:采用无血清培养基对HaCaT细胞进行培养,获取处于对数生长期的细胞进行直接荧光双标法、直接荧光单标法和间接荧光单标法以分别CD49fCD71、角蛋白K19、CD29和CD133,依托流式细胞仪检测上述抗原在HaCaT细胞的表达情况。结果:特异性较高的角朊干细胞表型CD49f D71-和K19 在HacaT细胞的百分率分别为16．6±2．8%和14．94±1．23%。CD29 HaCaT细胞为49．55±6．68%,可能包括了角朊干细胞和短暂扩增细胞。分别反映细胞黏附特性和增殖能力的CD49f HaCaT细胞和CD71 HaCaT细胞各占98．1±0．8%和82．1±3．9%。HaCaT细胞仅表达3．43±0．77%的干细胞表型CD133。结论:人永生化角朊细胞系HaCaT细胞的表型特征表明它具有较高的角朊干细胞和短暂扩增细胞比例以及很强的黏附基底膜特性和增殖能力,提示它可以作为构建人组织工程皮肤种子细胞和基因修饰角朊干细胞的替代物。     

绞股蓝皂苷对PC12细胞增殖及细胞损伤模型的保护作用

本文通过采用四氮唑蓝(MTT)比色法检测绞股蓝皂苷对PC12细胞增殖活力的影响,并用低糖低血清、谷氨酸、β淀粉样蛋白(Aβ25~35)诱导PC12细胞制备细胞损伤模型,观察绞股蓝皂苷低(50μg·mL~(-1))、中(200μg·mL~(-1))、高(500μg·mL~(-1))剂量在3种细胞损伤模型中对细胞存活率和胞浆中乳酸脱氢酶(LDH)释放量的影响。结果表明,绞股蓝皂苷能显著提高正常PC12细胞的存活率,并能有效对抗低糖低血清、谷氨酸、β淀粉样蛋白引起的细胞凋亡,降低胞浆中乳酸脱氢酶(LDH)的释放量。     

DNA甲基化通过锌指蛋白185调控慢性粒细胞白血病细胞的增殖

锌指蛋白185(ZNF185)属于LIM结构域蛋白,参与细胞的增殖和分化,在多种肿瘤细胞中具有抑癌基因的功能.ZNF185在正常人血液系统细胞中高表达,但目前对白血病细胞的作用未见研究.采用Western blot检测人外周血中性粒细胞、急性粒细胞白血病细胞系HL-60和慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞中ZNF185的表达,发现ZNF185在HL-60和K562细胞中的表达水平显著低于外周血中性粒细胞.为了阐明ZNF185对慢性粒细胞白血病细胞增殖的影响,从人外周血中性粒细胞克隆ZNF185编码序列,转染K562细胞,MTT检测细胞增殖,发现过表达ZNF185显著抑制K562细胞的增殖.甲基化特异PCR分析表明:ZNF185启动子在HL-60和K562细胞中高甲基化,用5-氮杂-2′-脱氧胞苷处理K562细胞,促进ZNF185的表达,显著抑制细胞增殖.研究结果表明,ZNF185启动子高甲基化导致其在K562细胞中的表达降低和细胞增殖抑制作用减弱.可能是慢性粒细胞白血病发生或发展的原因之一.     

辐射诱导转录子RIGb cDNA对HeLa细胞增殖的抑制作用

核酸序列同源性分析和RT -PCR确定辐射诱导转录子RIGb是染色质重构基因CHD6表达的一个剪接转录子.Northern杂交结果表明,0 . 5Gyγ射线诱导RIGbmRNA表达增加,但4Gy大剂量照射对其表达无明显的影响.正常成人组织Northern杂交结果显示,RIGb基因在心脏、肝脏和睾丸中有高表达.细胞生长曲线分析结果表明,转染和稳定表达RIGb的人宫颈癌细胞(HeLa)的增殖生长受到明显抑制,细胞周期分析发现G1/S期阻滞.     

抗酶1基因转染对HeLa细胞增殖及细胞周期的抑制作用

研究抗酶(antizyme)1对人宫颈癌HeLa细胞增殖与细胞周期的影响,并分析抗酶1对细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达影响.采用定点突变技术,将抗酶1的frameshift位点缺失,随后将突变基因重组至真核表达载体pEGFP-N1中,鉴定后转染HeLa细胞.通过MTT法检测细胞增殖变化,流式细胞术分析抗酶1对细胞周期的影响.RT-PCR和Western印迹检测抗酶1转染对细胞周期蛋白 D1基因表达的影响.酶切结果显示,抗酶1突变基因成功克隆至pEGFP-N1中.成功转染HeLa细胞后,检测结果显示,抗酶1能够减慢HeLa细胞增殖速度,并使细胞停滞于G₀/G₁期,细胞周期蛋白D1基因的表达同时受到抑制.实验说明,抗酶1基因能够抑制HeLa细胞增殖,通过降低细胞周期蛋白D1的表达阻滞细胞周期.     

肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

肿瘤抑素抗肿瘤相关肽-19肽是由肿瘤抑素185~203位氨基酸组成, 具有直接抑制黑色素瘤细胞生长作用, 但其对肝癌细胞增殖和凋亡是否有影响, 对肝癌是否具有治疗作用还需进一步研究。本研究中采用基因工程技术将合成19肽基因与载体pTYB2重组后进行蛋白表达、纯化获得19肽。通过MTT法、生长曲线观察19肽对人肝癌细胞生长抑制作用; TUNEL标记法、流式细胞仪细胞周期检测法、透射电镜观察19肽对肝癌细胞凋亡的影响; 小鼠H22腹水型转移型肝癌实体瘤抑瘤实验证明其体内的抑瘤作用。MTT实验和生长曲线实验表明随着19肽浓度的增加肝癌细胞的存活率下降。在相同19肽浓度下, 随着作用时间延长存活细胞逐渐减少。电镜观察治疗组细胞出现明显凋亡, 流式细胞仪可检测到前G1峰, TUNEL标记法也证实治疗组可见明显的凋亡细胞, 体内19肽作用的小鼠H22腹水型转移型肝癌的抑瘤率达48.46%。可见, 肿瘤抑素19肽可抑制肝癌细胞生长, 促进肝癌细胞凋亡, 对肝癌具有一定的治疗作用。     

CRISPR/Cas9沉默PAK5抑制乳腺癌细胞增殖并促进细胞衰老

p21活化激酶5(p21-activated kinase 5,PAK5)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,调节多种细胞进程,包括细胞骨架重构、细胞增殖、迁移和侵袭.研究表明,PAK5是调控乳腺癌进程的关键因子,但与衰老关系的研究尚未见报道.本研究利用CRISPR/Cas9慢病毒感染方法,构建敲低PAK5的人乳腺癌MDA-MB...