L-天冬氨酸脱羧酶研究进展

根据作用于L-天冬氨酸的位置不同,L-天冬氨酸脱羧酶可分为L-天冬氨酸α-脱羧酶和L-天冬氨酸β-脱羧酶,本文综述了两种酶在结构特点、酶学性质、基因表达、酶的应用等方面的研究进展。     

两种L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达与酶学性质分析

【目的】实现单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)L-天冬氨酸α-脱羧酶基因在Escherichia coli中异源表达,纯化重组蛋白并对其进行酶学性质分析。【方法】依照E.coli的密码子偏好性优化来源于L.monocytotogens和C.jeikeium的pan D基因序列。人工合成后以此构建表达载体pET28a(+)-pan D_(Lm)和p ET28a(+)-pan D_(Cj),转化E.coli BL21(DE3),实现panD_(Lm)和panD_(Cj)基因的异源表达。利用亲和层析纯化获得携带组氨酸标签的纯酶后进行酶学性质研究,并考察底物对酶反应的影响。【结果】重组菌蛋白电泳分析结果表明,重组酶panD_(Lm)和panD_(Cj)均有自加工功能,裂解后形成了α亚基和β亚基。重组酶比酶活分别为8.9 U/mg和11.8 U/mg。两种酶的最适反应温度均为60°C,最适p H分别为7.0和6.0,它们都在30-50°C,酸性条件下较稳定。与目前研究最多的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的Pan DC.g相比,Pan DL.m受底物天冬氨酸的抑制作用较小。【结论】panD_(Lm)和panD_(Cj)可在高温酸性条件下特异性转化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸,其中panD_(Lm)受底物的抑制作用较小,具有一定的工业应用潜力。     

L-天冬氨酸-α-脱羧酶高产菌株初筛方法的建立

通过试管法、平板法、Berthelot法和纸层析法对L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)高产菌株的初筛方法进行研究。分别检测转化体系中底物L-天冬氨酸减少引起的pH变化及产物CO2和β-丙氨酸的增加量,并用高效液相色谱法比较这四种方法的准确性。结果表明:CO2能溶于转化液,难以用倒置管收集完全;PanD系胞内酶,难以用平板点种法改变平板的pH;β-丙氨酸和L-天冬氨酸在Berthelot检测中吸收值均偏低,不适用于PanD高产菌的筛选;纸层析法可以直接检测β-丙氨酸和L-天冬氨酸,成本低,操作简单,具一定的精确度,可以较大规模地筛选PanD高产菌株。     

枯草芽胞杆菌L-天冬氨酸a脱羧酶的酶学性质

b-丙氨酸是一种重要的医药化工原料,目前主要依靠化学法进行生产。探寻更为环保和高效的生物生产法是未来研究的一个方向。L-天冬氨酸a脱羧酶 (PanD) 能特异地脱去L-天冬氨酸的a羧基,生成b-丙氨酸。本文比较了3种分别来源于大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌及枯草芽胞杆菌的PanD比酶活 (分别为0.98、7.52和8.4 U/mg)。后两者的最适pH均为6.5,最适反应温度分别为65 ℃及60 ℃。与目前研究最多的来源于大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的PanD相比,来源于枯草芽胞杆菌的PanD具有更好的活性和热稳定性,具有更强的工业应用潜力。同时,本文对该酶特有的翻译后自剪切及机理性失活现象进行了分析和讨论。     

产L-天冬氨酸α-脱羧酶细菌的分离、鉴定及发酵条件优化

【目的】从葡萄园土壤中分离L-天冬氨酸α-脱羧酶的产生菌株,对其进行分类鉴定,优化其产生L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵条件,为β-丙氨酸的生物合成提供基础。【方法】采用变色圈法和液体复筛培养基分离筛选具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活力的菌株,对菌株进行形态、生理生化特征试验及16S r RNA序列同源性分析鉴定菌株的系统发育学地位,采用单因素及正交设计试验优化培养基及发酵条件。【结果】筛选到一株L-天冬氨酸α-脱羧酶高产菌株Pan D37,其亲缘关系和特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)较近,且形态与培养特征、生理生化特性与特基拉芽孢杆菌基本相符。研究表明其最佳发酵配方和培养条件为:蔗糖22.5 g/L、富马酸7.5 g/L、蛋白胨20 g/L、L-天冬氨酸6 g/L、Triton X-100 2g/L,起始p H为7.0,装液量50 m L/500 m L,摇床转速220 r/min,种子液接种量为5%(V/V),35°C培养28h。在最优条件下L-天冬氨酸α-脱羧酶活力可达44.57 U/m L,比初筛时提高2.57倍。【结论】分离并获得一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)Pan D37,经条件优化后具有较高的L-天冬氨酸α-脱羧酶产生能力,有望应用于β-丙氨酸的工业生产。     

细菌L-天冬氨酸α-脱羧酶的分子机制及分子改造研究进展

L-天冬氨酸α-脱羧酶能够催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸,是泛酸代谢中的关键酶之一,对生物体中的能量代谢和脂肪代谢至关重要。细菌L-天冬氨酸α-脱羧酶属于丙酮酰依赖型的一类酶,具有特别的翻译后加工机制和底物失活作用,本文对L-天冬氨酸α-脱羧酶的分子机制和分子改造进行了综述,并对其在β-丙氨酸合成方面的应用进行了展望。     

重组L-天冬氨酸-β-脱羧酶融合蛋白复性条件的研究

以本实验室构建保存的天冬氨酸脱羧酶工程菌为研究材料,通过基因表达,对所得到的重组胞内融合表达型天冬氨酸脱羧酶蛋白进行体外复性研究,考察温度、复性液的pH、复性时间、复性液种类等因素对重组天冬氨酸脱羧酶体外复性的影响。结果表明:最佳复性液为pH8.7的Tris-HCl缓冲液,在保温时间2h,温度40℃下,复性效果最好。另外一些pH能达到8.7的缓冲液复性效果都不如Tris-HCl缓冲液。     

L-天冬氨酸-α-脱羧酶的重组表达、定点突变及高通量检测方法的建立

将枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因进行了克隆和异源表达,并通过定点突变构建了2个突变体。针对该酶活力检测时存在的检测通量低、周期长和成本高等缺点,旨在建立一种简单高效的酶活力高通量检测方法。采用氯酚红(CPR)指示剂和4-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液体系,并对检测条件进行优化,提高检测的准确性和灵敏性,建立了基于比色法的微孔板高通量检测方法,然后以L-天冬氨酸-α-脱羧酶及其突变体作为模型酶,对高通量检测方法进行了验证。优化后的酶活检测条件为MES缓冲液2 mmol/L,CPR指示剂75 μmol/L,L-天冬氨酸75 mmol/L,pH 6.5,温度37℃,反应时间10 min,检测波长为567 nm。采用3种模型酶对微孔板高通量检测方法进行了验证,结果显示该方法与HPLC法测得的结果一致。高通量检测方法具有操作简便易行、灵敏度高等优点,能够用于L-天冬氨酸-α-脱羧酶的快速检测。该方法的建立将为L-天冬氨酸-α-脱羧酶进行定向进化及突变体的高通量筛选奠定基础。     

α-乙酰乳酸脱羧酶在大肠杆菌中的克隆表达

根据已知的α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）的基因序列,通过PCR获得了枯草芽孢杆菌168的ALDC基因,将该基因克隆到克隆载体pUC18和表达载体pQE60中,构建了pUC18-ALDC和pQE60-ALDC,经DNA测序证明序列正确。重组大肠杆菌DH5a／pQE60-ALDC经IPTG诱导能够高表达ALDC。对该酶进行了活力测定,结果显示工程菌产酶活力为0．11U／mL。     

双酶偶联转化富马酸制备β-丙氨酸的工艺的建立与优化

酶转化法是生产β-丙氨酸的重要途径,但单一酶法转化存在底物价格较高的问题。通过构建双酶催化体系制备β-丙氨酸,即将来源于大肠杆菌的天冬氨酸酶(AspA)和来源于谷氨酸棒杆菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)偶联,以富马酸和氨为底物进行酶促反应合成β-丙氨酸。催化反应中AspA与PanD的最适加酶比例为1∶80,其中AspA的浓度为10μg/mL,转化温度为37℃,pH为7.0;浓度为100 mmol/L的富马酸可在8 h内被完全转化,转化率为100%,摩尔产率为90.9%,β-丙氨酸的产量为90 mmol/L,约为7 g/L;浓度为200 mmol/L的富马酸在反应8 h后,体系中β-丙氨酸的产量为126 mmol/L,约合9.8 g/L,继续延长反应时间,转化率并没有明显提高。根据该研究提出的双酶偶联转化工艺可将价格低廉的富马酸一步转化为具有高附加值的β-丙氨酸。     

谷氨酸棒杆菌代谢工程高效生产L-缬氨酸北大核心CSCD

L-缬氨酸作为一种支链氨基酸,广泛应用于医药和饲料等领域。本研究借助多种代谢工程策略相结合的方法,构建了生产L-缬氨酸的微生物细胞工厂,实现了L-缬氨酸的高效生产。首先,通过增强糖酵解途径、减弱副产物代谢途径相结合的方式,强化了L-缬氨酸合成前体丙酮酸的供给;其次,针对L-缬氨酸合成路径关键酶—乙酰羟酸合酶进行定点突变,提高了菌株的抗反馈抑制能力,并利用启动子工程策略,优化了路径关键酶的基因表达水平;最后,利用辅因子工程策略,改变了乙酰羟酸还原异构酶和支链氨基酸转氨酶的辅因子偏好性,由偏好NADPH转变为偏好NADH,从而提高了L-缬氨酸的合成能力。在5L发酵罐中,最优谷氨酸棒杆菌工程菌株Corynebacterium glutamicum K020的L-缬氨酸产量、得率和生产强度分别达到了110g/L、0.51g/g和2.29 g/(L·h)。     

杰氏棒杆菌L-天冬氨酸α脱羧酶半理性改造及全细胞催化合成β-丙氨酸

β-丙氨酸是多个药物合成的重要砌块,可以通过天冬氨酸α脱羧酶（Pan D）催化L-天冬氨酸脱羧来合成,但普遍在用的Pan D酶活性不高是制约全细胞催化合成β-丙氨酸的瓶颈。因此,本研究通过酶的挖掘,选择将杰氏棒杆菌来源（Corynebacterium jeikeium）Pan D在Escherichia coli中异源表达。对杰氏棒杆菌来源Pan D进行Alaph Fold2建模和分子对接,采用Rosetta虚拟突变确定突变热点,结合薄层层析初筛和纯化后复筛,最终筛选到突变体L39A,其比酶活为13.45 U/mg,相比野生型酶的比酶活（9.6 U/mg）提升了1.4倍。酶学性质表征数据表明,野生型酶和L39A突变体最适p H均为6.5,且在p H 6.0-7.0之间酶活性稳定;两者最适温度为55℃,但L39A热稳定性较野生型提高;突变体酶的催化效率比野生型提升了1.4倍。对突变体进行结构解析发现,39位取代为侧链基团更小的丙氨酸,亲水性增强,增加了关键催化氨基酸58位酪氨酸与其他氨基酸的相互作用,使活性中心周围的区域稳定性提高,从而提高了催化活性。全细胞催化数据表明,在OD600=4...     

谷氨酸棒杆菌TL1105的L-组氨酸生物合成途径分析

目的：对谷氨酸棒杆菌TL1105由葡萄糖生物合成L-组氨酸的代谢途径进行分析,以确定L-组氨酸合成的最佳途径和最大理论产率。方法：运用METATOOL软件对谷氨酸棒杆菌TL1105合成L-组氨酸进行途径分析。结果：确定了L-组氨酸合成的最佳途径,并确定最大理论产率为1．2;通过比较途径分析所获得的基础反应模型,确定了5-磷酸核糖焦磷酸是L-组氨酸合成途径的关键节点,并且确定了谷氨酸的大量合成是L-组氨酸合成的重要前提;添加谷氨酸,L-组氨酸的产量提高了39．2％。结论：以途径分析为指导,改变外界环境因子,L-组氨酸的产量得到显著的提高。     

α-乙酰乳酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合型表达

α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒生产中能加快啤酒成熟,有重要的应用价值。本研究将枯草芽孢杆菌启动子P43克隆到质粒pUC19-ALDC中的α-乙酰乳酸脱羧酶基因之前,得到重组质粒pUC19-P43-ALDC。重组质粒pUC19-P43-ALDC与质粒pMLK83-BN同源重组,筛选得到枯草芽孢杆菌整合质粒pMLK83-ALDC。用此整合质粒转化枯草芽孢杆菌1A751,挑选出新霉素抗性且无淀粉酶活性的重组菌株。此菌株用LB培养基在37℃、220r/min摇瓶培养过夜,测得α-乙酰乳酸脱羧酶活力为15.6U/mL,说明整合的α-乙酰乳酸脱羧酶基因能够在重组菌株中稳定传代和表达。本研究首次在枯草芽孢杆菌中用整合型的方式重组表达了α-乙酰乳酸脱羧酶,提出了一种有潜力的生产α-乙酰乳酸脱羧酶的新方法。     

L-天冬氨酸-β-脱羧酶发酵条件的响应面优化

利用Plackett-Burman设计和响应面分析方法对L-天冬氨酸-β-脱羧酶产生菌德阿昆哈假单孢菌XG-2-81的发酵条件进行优化.得出影响产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的3个重要的因素为:玉米浆,多肽朊和装液量.通过对实验结果的方差分析,得到其最适条件分别为:玉米浆浓度0.64%,多肽朊浓度1.21%,装液量14.7...     

一步法生产1,5-戊二胺谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建

1,5-戊二胺是一种重要的化工原料,发酵法生产1,5-戊二胺是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径。以蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)AS1.1009基因组为模板,通过PCR扩增,得到大小约为2.2kb的赖氨酸脱羧酶基因ldc。以大肠杆菌(Escherichia coli)/谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)穿梭质粒pXMJl9为载体,将扩增得到的目的基因片段克隆至谷氨酸棒杆菌C.glutamicum TK260512,获得重组菌株C.glutamicum TK260512/pXMJl9-ldc.在摇瓶发酵水平上,通过IPTG诱导ldc基因的表达,并采用反相高效液相色谱方法测定了发酵液中1,5-戊二胺的含量,结果显示,经36h发酵,工程菌C.glutamicum TK260512/pXMJ19-ldc的1,5-戊二胺产量为0.96g/L。     

α-乙酰乳酸脱羧酶在毕赤酵母中的分泌表达

根据已知的α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）基因序列,通过PCR从枯草杆菌168基因组上扩增得到编码ALDC的结构基因。将该基因克隆到大肠杆菌一毕赤酵母穿梭载体pPIC9中,构建了重组质粒pPIC9-ALDC,电击转化毕赤酵母GS115。在甲醇诱导下,毕赤酵母分泌表达了ALDC。SDS—PAGE分析可见到Mr约62000的表达条带,经测定,表达产物活力为0．03U／mL。     

赖氨酸-尸胺反向转运蛋白cadB基因谷氨酸棒杆菌表达载体的构建及转化

旨在提高谷氨酸棒杆菌合成尸胺的能力,将CadB克隆至谷氨酸棒杆菌中,与LDC共表达,在谷氨酸棒杆菌合成尸胺的同时,帮助尸胺转运至细胞外,解除尸胺的反馈抑制作用。谷氨酸棒杆菌能够高产赖氨酸脱羧酶的底物L-赖氨酸,但不含ldc和cadB基因,因而不能够直接合成尸胺。从E.coliK12中克隆出赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因,与绿色荧光蛋白基因gfp融合构建成融合表达载体pXBG,并转化至谷氨酸棒杆菌进行诱导表达,结果表明表达的CadB蛋白可以正确的定位于谷氨酸棒杆菌的细胞膜上。将基因cadB连接到含有赖氨酸脱羧酶基因的pXMJ19-ldc上,构建成能够共表达赖氨酸脱羧酶和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白的重组质粒pXLB,并转化到谷氨酸棒杆菌中。     

重组谷氨酸棒杆菌发酵L-苯丙氨酸培养基的优化

【目的】提高重组谷氨酸棒杆菌发酵L-苯丙氨酸(L-phenylalanine,L-Phe)的产量。【方法】使用正交试验设计以及响应面优化法分别对种子培养基及发酵培养基进行优化,确定了重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe的最佳种子培养基及最佳发酵培养基。【结果】重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe最佳种子培养基(g/L):葡萄糖25.0,玉米浆25.0,硫酸铵15.0,硫酸镁1.0,磷酸二氢钾2.0,尿素2.0,p H 6.8-7.0;最佳发酵培养基(g/L):葡萄糖110.0,玉米浆7.0,硫酸铵25.0,硫酸镁1.0,磷酸二氢钾1.0,柠檬酸钠2.0,谷氨酸1.0,碳酸钙25.0,p H 6.8-7.0;在最佳培养基条件下L-Phe产量最高达到9.14 g/L,较优化前的7.46 g/L提高了22.5%。【结论】通过正交试验和响应面分析对重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe培养基进行优化,明显提高了L-Phe的产量,并确定了葡萄糖、玉米浆和硫酸铵为发酵培养基中影响L-Phe产量的3个关键因子。研究结果为L-Phe的发酵放大提供了依据。     

谷氨酸棒杆菌一步法发酵糖质原料生产γ-聚谷氨酸

γ-聚谷氨酸在食品、化妆品、生物医药等领域具有广泛的应用,目前主要的生产菌株是谷氨酸依赖型菌株,在生产过程中需要添加谷氨酸作为前体,因而生产γ-聚谷氨酸的成本较高。文中主要研究从糖质原料一步法发酵合成γ-聚谷氨酸的生产工艺。首先,从产γ-聚谷氨酸的菌株枯草芽孢杆菌中克隆γ-聚谷氨酸合成酶的基因簇pgs BCA,在谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032中进行诱导型和组成型表达,结果显示,仅诱导型表达菌株可以积累γ-聚谷氨酸,产量为1.43 g/L。进一步对诱导条件进行优化,确定诱导时间为2 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L,γ-聚谷氨酸产量为1.98g/L。在此基础上,在一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中外源表达pgs BCA,对重组菌进行发酵,结果表明,在摇瓶发酵中γ-聚谷氨酸产量达到10.23g/L,在5L发酵罐中产量达到20.08g/L;继而对γ-聚谷氨酸进行分子量测定,结果显示,产自F343重组菌的γ-聚谷氨酸的重均分子量比产自枯草芽孢杆菌的提高34.77%。文中构建了一步法发酵糖质原料生产γ-聚谷氨酸的新途径,同时为开发其潜在应用奠定了基础。