家蚕浓核病毒中国(镇江)株结构蛋白的生物信息学比较分析

运用生物信息学方法将家蚕浓核病毒中国(镇江)株的结构蛋白与其它类型家蚕浓核病毒的结构蛋白在理化特性、结构、功能等方面进行了比较分析。结果表明:家蚕浓核病毒结构蛋白是一类稳定的亲水性蛋白,BmDNV-ZJ与BmDNV-2的结构蛋白性质可能比较类似,而BmDNV-ZJ和BmDNV-1结构蛋白序列的理化性参数、序列内部重复片断以及折叠区域差异较大,表明这两种浓核病毒结构蛋白在性状、结构、功能上有较大差异。而BmDNV-ZJ和BmDNV-1结构蛋白序列中有3个不同的LCR功能区域。分子进化聚类分析可得到四大类浓核病毒结构蛋白。     

家蚕浓核病毒(镇江)株主要结构蛋白基因的克隆及表达

家蚕浓核病毒(Bombyx mori densovirus,BmDNV)是一种昆虫细小病毒.与其它昆虫细小病毒感染昆虫体内多种组织不同,家蚕浓核病毒只感染家蚕中肠上皮组织的圆筒型细胞,感染该病毒细胞的细胞核可以被孚尔根和甲基绿浓染,在病毒感染的早期中肠上皮组织细胞数量增加,形成褶皱,最后感染细胞脱落到肠腔中[1-3].自从20世纪70年代末日本学者证实家蚕浓核病是由于家蚕浓核病毒感染引起的以来[4],已经分离得到了多个病毒株系[5-8].根据它们在血清学、理化特性、品种感受性和病理特征等方面的差异,分为BmDNV-1(伊那株)和BmDNV-2(以山梨株为代表)[8-11].     

一种家蚕类浓核病毒的组织病理学特征

本文从家蚕病蚕中分离到一种家蚕类浓核病毒（BmDNV-Like）,对它的组织病理学研究表明:该病毒首先寄生家蚕中肠柱状细胞,继而引起其细胞核的膨大和破裂;组织原位杂交结果表明该病毒既能在家蚕中肠柱状细胞中增殖,也能在中肠的杯形细胞中增殖,甚至在感染后期能在家蚕幼虫的大部分组织细胞中感染和增殖。     

两个对浓核病毒(镇江株)具感性差异的家蚕品种的血液和围食膜蛋白的比较

家蚕品种间对浓核病毒(镇江株)具有不同的感染性,为了进一步探明家蚕对浓核病毒(镇江株)感性差异的分子机制,本文运用蛋白质电泳和质谱技术比较分析了两个对家蚕浓核病毒(镇江株)感性和抗性的近等基因系家蚕品种JS和NIL的血液和围食膜组织蛋白.结果表明:这两个家蚕品种的血液和围食膜组织蛋白组成差异很小.在血液组织蛋白中发现5个差异蛋白点,其中家蚕品种JS血液中有两个差异蛋白,可能分别为酪蛋白激酶和新型组织蛋白;在NIL血液组织中发现3个差异蛋白点,其中两个可能分别为线粒体延伸因子和类丝氨酸蛋白酶,另外1个的含量极显著高于JS,为血淋巴蛋白.在围食膜蛋白中共发现4个差异蛋白点,其中JS围食膜中有1个差异蛋白可能为新型组织蛋白;其余3个蛋白点在含量上相互间存在显著差异.本研究根据组织差异蛋白的功能初步推测家蚕对浓核病毒(镇江株)感性差异与血液蛋白差异无显著相关,与围食膜蛋白差异可能有关.     

家蚕浓核病毒 (中国镇江株)在不同感受性宿主体内的复制

家蚕浓核病毒中国镇江株是一株双生浓核病毒(bidensovirus)。其宿主感染后的病症与典型的家蚕浓核病毒(BmDNV-1伊那株)表现相似,病蚕软化,中肠的圆筒型细胞呈浓核症。该病毒的最大特点是基因组中含有二套DNA分子(VD1,VD2),这两种核酸分子以单链( VD1,-VD1, VD2,-VD2)线型方式被分开包装在各自的衣壳蛋白中,成为四种病毒体,而且它自身编码DNA聚合酶。有部分蚕品种对该病毒表现完全抗性,即不发病。分别对敏感性家蚕品种(华八35)和抗性家蚕品种(秋丰d)的幼虫进行经口接种病毒。在接种后,从2h到96h分9个时间点,对中肠组织进行取样。以家蚕细胞质肌动蛋白A3(actinA3)基因作为参比基因,用来标定取样组织细胞数。针对VD1和VD2分别设计特异引物,用荧光定量PCR的方法分别检测各个时间点的样品中的病毒基因组VD1和VD2拷贝数。结果表明:无论是在感性还是在抗性宿主体内,家蚕浓核病毒中国株的基因组VD1和VD2在各时间点拷贝数相近,表现出VD1和VD2是同步复制的;病毒侵入两种宿主中肠的初始量(接种后2h)基本相等,每个细胞约为6~10拷贝数。在敏感性宿主体内病毒感染过程表现为潜伏期,指数增长期,平台期。从接种后2h到12h为病毒潜伏期;12h到36h为指数增长期,倍增时间为1·71h,大约扩增15次;36h到96h为平台期,进入平台期病毒的拷贝数达到20万个。在抗性宿主体内病毒处于一种极低水平的增殖,从添毒后2h的6~10拷贝数到96h的150~200拷贝数,病毒复制倍增时间分别为3h和12h,大约扩增5次。推测家蚕对浓核病毒中国株的抗病性,只是一种慢性的带毒不发病的表现。     

30K蛋白对家蚕细胞及幼虫存活的作用

利用杆状病毒表达系统在家蚕BombyxmoriL.细胞BmN中表达家蚕30K蛋白,以亲本病毒BmPAK6为对照,将重组病毒Bm/r-30K分别感染BmN细胞及家蚕幼虫,观察其感染后不同时间的凋亡及存活率。与对照相比,重组病毒感染后的BmN细胞的存活率明显高于对照组,并且感染的家蚕幼虫存活时间也较长,表明体内过量表达家蚕30K蛋白有助于延长其细胞及幼虫的存活。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Bmserpin2对酚氧化酶原激活和抗菌肽基因表达的抑制作用

【目的】丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白是昆虫中调控自身免疫反应的重要蛋白酶抑制剂,本研究旨在研究家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂2(Bmserpin2)在家蚕2个重要的自身免疫通路即酚氧化酶原(prophenol oxidase, PPO)激活通路和革兰氏阳性菌诱导抗菌肽的TOLL通路中的调控作用。【方法】PCR扩增家蚕Bmserpin2基因片段后原核表达并通过镍柱纯化。利用纯化后的重组Bmserpin2蛋白分别与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和蛋白酶K反应,检测Bmserpin2对上述蛋白酶活性的影响。通过RT-qPCR检测Bmserpin2在家蚕5龄第3天幼虫头、中肠、脂肪体、血淋巴、丝腺和表皮组织中表达的模式。往家蚕5龄第3天幼虫注射Bmserpin2重组蛋白,检测Bmserpin2对其血淋巴中PPO活性的影响。通过滕黄微球菌Micrococcus luteus诱导家蚕5龄第3天幼虫产生抗菌肽并注射Bmserpin2重组蛋白后,RT-qPCR检测其血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin表达量。【结果】成功构建重组质粒并表达纯化目的蛋白Bmserpin2。通过与不同蛋白酶反应得出Bmserpin2可极显著抑制消化酶胰蛋白酶和弹性蛋白酶活性,对胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K活性影响不显著,提示Bmserpin2对不同蛋白酶具有生物学活性和催化特异性。基因表达模式显示Bmserpin2在家蚕5龄幼虫血淋巴和脂肪体中表达量最高。家蚕5龄幼虫注射重组Bmserpin2蛋白后发现目的蛋白能有效抑制血淋巴中PPO活性。利用滕黄微球菌诱导家蚕5龄幼虫产生抗菌肽后,滕黄微球菌和Bmserpin2混合注射组中血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin的转录表达与只注射滕黄微球菌的比较被显著下调。【结论】Bmserpin2可能参与家蚕酚氧化酶原激活和TOLL途径的胞外级联反应的免疫通路。     

小RNA病毒蛋白与细胞凋亡的关系

很多小RNA病毒科病毒感染宿主细胞后可引发宿主细胞凋亡,这种现象被认为是宿主细胞对抗小RNA病毒侵染的防御机制。凋亡机制可由某些病毒蛋白对细胞产生信号干扰来实现多种凋亡通路。虽然这些凋亡通路的上游事件是不同的,但最后的效应却很一致。此外,一些病毒蛋白具有抑制细胞凋亡的功能,它们能够令感染病毒后的细胞不死亡,形成病毒与宿主细胞共存的持续性感染状态。     

冠状病毒感染调控细胞凋亡机制研究进展

冠状病毒是常见的感染人类和动物并造成健康危害的主要病原性微生物之一,冠状病毒感染细胞后,细胞产生免疫应答,病毒为了在细胞内转录翻译和装配下一代,应对细胞免疫应答的同时,还参与到许多细胞活动中,当细胞特定受体与病毒蛋白结合后,细胞即启动凋亡程序。冠状病毒的许多蛋白在细胞凋亡程序中起促进或抑制凋亡的不同作用,如病毒S蛋白与细胞膜死亡受体作用诱导细胞启动外在凋亡途径,病毒感染细胞后产生的M、S蛋白引起细胞内质网应激、Ca2+失衡,诱导细胞启动内在凋亡途径,而E蛋白则抑制细胞凋亡的发生。本文综述了冠状病毒对侵染细胞的促凋亡或抑制凋亡作用及其作用机制,通过了解病毒不同蛋白在各种凋亡途径中的不同作用,希望为人工干预调控细胞研究提供思路,为冠状病毒感染防控提供理论支持。     

利用优化改造的家蚕杆状病毒表达系统提高NS1表达产量

为优化家蚕杆状病毒表达系统,提高外源基因的表达产量。文中通过同源重组技术,用串联的氯霉素基因(Cm)表达盒和绿色荧光蛋白基因(egfp)表达盒将其替换,从而获得Chitinase和Cystein Protease两个基因缺失的家蚕杆状病毒载体。通过转座,将多角体启动子控制的家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)ns1基因表达盒,定点插入到改造后的该分子载体中。将重组载体转染Bm N细胞,获得能表达家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)NS1的缺失型重组病毒;另外,将多角体启动子控制的ns1基因转座到野生型Bm-bacmid中,获得能表达Bm BDV NS1的野生型重组病毒。将这两种病毒分别皮下注射家蚕,对感染后的家蚕血液中NS1表达水平进行比较,发现缺失Chitinase和Cystein Protease重组病毒感染的家蚕血液中,NS1的表达量是对照组的3倍,从而建立了一种高效表达可溶性NS1蛋白的方法,为靶蛋白的结构与功能研究奠定基础。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism