草鱼胞浆谷胱甘肽过氧化物酶cDNA全长的克隆与分析

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases,GPXs,EC1.11.19)是生物体内抗氧化防御系统的重要组成部分。本文从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)克隆到胞浆谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPX1)cDNA全长序列。该序列全长890bp(GenBank accession No.EU828796),包括完全开放阅读框(ORF)576bp、5'非编码区(5'-UTR)17bp和3'-UTR297bp。其ORF编码191个氨基酸残基,包含一个由"UGA"(通常为终止密码子)编码的硒代半胱氨酸(selenocysteine,Sec40)残基,并与另2个残基(Glu75和Trp153)构成酶活性中心。同时,草鱼GPX1cDNA的3'-UTR中具有保守的硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence,SECIS)元件。氨基酸序列相似性比较显示,草鱼GPX1cDNA的推测氨基酸序列(GenBank accession No.ACF39780)与斑马鱼GPX1(GenBank accession No.NP_001007282)的相似性为95.8%,与鳗鲡GPX1(GenBank acces-sion No.ACN78878)的为84.8%,与哺乳类的为59%~72%。采用实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测草鱼GPX1的组织表达特征。结果表明,草鱼GPX1的mRNA在所检测的11种组织器官中均有表达,其中在肝、鳃和肾表达水平较高,在红肌、脂肪和肠道中表达水平较低。本研究结果将有助于进一步探讨鱼类GPX1基因的结构与功能,并为研究其抗氧化分子机理奠定基础。     

虾夷扇贝铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与转录表达特性分析

利用RACE和克隆等方法得到了虾夷扇贝铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因全长cDNA序列,该序列全长1 064 bp,5′和3′非编码区(UTR)分别为61 bp和541 bp,开放阅读框(ORF)462 bp,编码153个氨基酸和一个终止密码子.分析发现,此氨基酸序列含有形成二硫键的两个半胱氨酸残基以及4个铜结合位点、4个锌结合位点,与已知的Cu/Zn-SOD结构相似,与其它物种同源性较高.进行虾夷扇贝组织分布及发育过程中不同时期的实时荧光定量监测,发现鳃中Cu/Zn-SOD基因mRNA相对表达量最高,肾次之,血淋巴中最低;不同发育阶段Cu/Zn-SOD表达量变化明显,其中受精卵和早期D形幼体两个时期表达量相对较高.     

青岛文昌鱼过氧化氢酶基因的克隆及生物信息学分析

过氧化氢酶(catalase,CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶,是生物体内抗氧化酶体系的重要成员,因此本研究旨在克隆文昌鱼CAT基因并对其进行生物信息学分析。本研究以青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)为材料,用RACE技术首次克隆了其CAT全长cDNA的基因序列,命名为AmphiCAT(GenBank登录号:KU058636);该序列总长为2640 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1533 bp,编码510个氨基酸,含有一个长为19个氨基酸序列的潜在活性位点和一个长为9个氨基酸序列的血红素配体信号,总分子量在线预测约为57.85 kD;经生物软件分析确定该蛋白质无信号肽序列,预测该蛋白质为非分泌性蛋白,属于单功能CAT的clade3分支;该基因的分子进化树表明青岛文昌鱼CAT同软体动物的亲缘关系较近。     

三种锦鸡儿属植物过氧化氢酶基因的克隆及表达特性分析

为研究过氧化氢酶基因在锦鸡儿属植物抵御干旱胁迫中发挥的作用,采用兼并PCR (degenerate polymerase chain reaction, Deg-PCR)和末端克隆(rapid amplify cDNA ends, RACE)技术分离了柠条锦鸡儿(Caragana korshinskiikom)、小叶锦鸡儿(C. microphylla)和中间锦鸡儿(C. davazamcii)的过氧化氢酶(Catalase, CAT)基因cDNA序列,并对它们在干旱胁迫条件下的表达特性进行了比较分析。这3种锦鸡儿属植物CAT cDNA均为1 755 bp,含有1个1 479 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF)、85个碱基的5'非编码区和201个碱基的3'非编码区,编码492个氨基酸的蛋白质。序列比较分析发现,该3条序列仅在322 bp处有一个碱基的差异(CkCAT为T碱基, CmCAT和CdCAT为C碱基),但它们编码相同的氨基酸。生物信息学分析显示,CkCAT、CmCAT和CiCAT的与其他植物的CAT蛋白具有较高的同源性,在进化上与豇豆和大豆的CAT亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析结果显示,在干旱胁迫条件下CkCAT、CmCAT和CdCAT的表达量明显升高,显示CAT在锦鸡儿属植物抵御干旱逆境中发挥重要作用。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶基因的克隆与序列分析

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育得到的漆酶高产菌株。为了对其漆酶基因进行研究和利用,采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,从T.gallica诱变菌株SAH-12分离得到漆酶基因全长cDNA Lacc1(GenBank accession No.DQ431716)及其对应的结构基因Lac1(DQ431715)。该基因属于真菌漆酶基因家族,与来自出发菌T.gallica漆酶基因lacA(AY875867)在成熟肽编码区的同源性最高(一致性为98%)。Lacc1全长1891bp,由40bp的5'-UTR、1554bp的完整ORF和297bp的3'-UTR构成,具有polyA加尾信号AATACA和59bp的polyA结构;其完整ORF可编码21个氨基酸残基组成的信号肽和496个氨基酸残基组成的成熟蛋白。在Lacc1基因的推导氨基酸序列中有4个潜在的N-糖基化位点和4个参与二硫键形成的Cys残基,且含有真菌漆酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型铜离子结合区的4个高度保守序列。结构基因Lac1全长2338bp,含10个内含子和11个外显子,各内含子长度在51bp～76bp之间,且其序列均符合5'-gt……ag-3'规则。     

草鱼RBM cDNA克隆及序列分析

目的:克隆草鱼RNA剪切蛋白(RNA binding motif protein-RBM)基因.方法:采用RT -PCR技术从草鱼性腺总RNA中克隆RBM基因,将其插入pBS-T载体上,经菌液PCR鉴定后进行 测序并对测序结果进行生物信息分析.结果:获得草鱼RBM cDNA部分序列 ,大小为384bp,预 测编码127个氨基酸残基;RBM基因进化与物种形态进化类似;不同物种间RBM基因一级结构 保守性不高,但氨基酸序列保守性较高,且存在高度保守的氨基酸位点.结论: 成功地克隆了草鱼RBM cDNA部分序列,为获RBM cDNA全长序列及后续研究提供理论基础.     

鳜鱼CRP cDNA和斜带石斑鱼AAT cDNA的克隆与序列分析

采用RT-PCR及RACE法分别克隆得到鳜鱼(Siniperca chuatsi)C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)cDNA全序列和斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,AAT)cDNA全序列.鳜鱼CRP基因cDNA全长为914 bp,其中5'非翻译区(5'-UTR)为49 bp,3'非翻译区(3'-UTR)为199 bp,开放阅读框(ORF)为666 bp,编码222个氨基酸.序列同源性分析发现,推测的鳜鱼CRP氨基酸序列与小鼠(Mus musculus)、人类(Homo sapiens)、大鼠(Rattus,norvegicus)、非洲蟾蜍(Xenopus tropicalis)和中国鲎(Tachypleus tridentatus)的CRP氨基酸同源性分别为33.2%、32.4%、31.5%、24.9%和22.4%.斜带石斑鱼肝脏ATT基因cDNA全序列长1 785 bp,其中,5'-UTR为13 bp,3'-UTR为530 bp,ORF为1 242 bp,编码414个氨基酸.序列同源性分析发现,推测的斜带石斑鱼AAT氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)、非洲爪蟾(X.laevis)、楔齿蜥(Sphenodon punctatus)、大鼠、人类、狒狒(Papio papio)和小鼠的AAT氨基酸序列同源性分别为59.2%、40%、38.6%、38.5%、37.7%、37%和36%.鳜鱼CRP基因和斜带石斑鱼AAT基因cDNA全序列的获得为其疾病相关分子机理研究奠定了基础,对今后进一步进行种苗育苗的研发,并以此为依据提高其人工育苗仔鱼成活率有重要意义.     

牛催乳素基因组及其cDNA全长序列的分子克隆和分析

通过LongPCR等技术首次克隆得到全长9388bp的牛催乳素（bPRL)基因组序列（GenBank登录号AF426315）,其中包括bPRL基因全部5个外显子和4个内含子,5′端854bp的上游调控区以及3′端69bp的UTR,AF426315基因编码的蛋白质在GenBank中的序号为AAL28075,由229个氨基酸残基组成,1-30位氨基酸残基为信号肽序列,成熟的多肽含有199个氨基酸残基,将bPRL基因组DNA真核表达载体转染COS-7细胞后通过RT-PCR得到长度为804bp的bPRLcDNA序列,该序列涵盖了bPRL基因的全部ORF区,证明本研究所获得的bPRL基因组DNA具有转录的生物学功能,Blast搜索结果显示,GenBank数据库中收集有多条bPRL基因的mRNA和EST序列,各序列间存在多个SNP位点,主要分布于下游编码区和3′端的UTR,这些位点均未改变相应的氨基酸残基的性质,此外,5′端编码信号肽序列的区域呈现高度保守性。     

苦荞谷胱甘肽转移酶(FtGST)基因的克隆与序列分析

采用RACE技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到一个谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase protein,FtGST)基因。序列分析表明,FtGST基因全长DNA序列和cDNA序列编码区分别为746 bp和666 bp,DNA序列含有一个长度为80 bp(342-421 bp)的内含子;开放阅读框(ORF)长666 bp,编码221个氨基酸。生物信息学分析表明,FtGST基因推导的蛋白质含有Tau家族典型的底物结合口袋、谷胱甘肽结合位点(G-site)和疏水性底物结合位点(H-site)氨基酸残基,表明FtGST为Tau家族蛋白。     

草鱼Annexin A4基因克隆、表达特性及进化

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Annexin A4基因克隆于肝肾cDNA文库,该cDNA全长为1307bp,其中,5′非编码区为104bp,3′非编码区为237bp,开放阅读框为966bp,编码321个氨基酸。草鱼Annexin A4编码的蛋白质N端由15个氨基酸残基组成,C端具有4个重复序列,每个重复序列都有一个Ⅱ型钙结合位点,在第4个钙结合位点中包含一个"KGD"序列。Annexin A4在草鱼肝、肾、脾、心、鳃、肠中的表达量均较高,而肌肉和脑中不表达;PolyⅠ:C诱导后,其表达均有所下调。系统发育树显示,草鱼Annexin A4与斑马鱼(Danio rerio)的进化距离最近。适应性进化分析没有检测到正选择位点,表明Annexin A4非常保守,受到强烈的功能约束。