利用GUS基因瞬时表达探索佛手叶盘基因枪转化参数

佛手是芳香科枸橼类植物,有很好的药用和观赏价值,但其品种较为单一,对其进行遗传改良和品种选育显得十分必要.为了将基因枪转化方法应用于佛手的遗传改良和品种选育,本实验以GUS基因为报告基因,利用基因枪方法将其转入金华佛手外植体内,通过检测GUS基因在佛手叶盘中的瞬时表达情况,分析了外植体的幼嫩程度、射程、氦气压力、真空度、轰击次数等参数对GUS瞬时表达的影响,并研究了最佳检测时间.结果表明,以幼叶为受体,在射程为6 cm、氦气压力为7.584×106Pa,真空度为88.046 kPa条件下,2 d后可检测出GUS基因的最佳表达活性.轰击次数多少对GUS基因瞬时表达影响不明显.     

不同调控序列控制下的GUS基因在水稻和毛白杨愈伤组织中的瞬时表达

用CaMV35S启动子、玉米Ubil启动子、TMVΩ增强子(Ω序列)以及拟南芥18S rRNA基因同源序列构建的6种GUS基因表达载体分别转化水稻和毛白杨愈伤组织,研究不同调控序列对外源基因表达的调控作用.结果表明:(1)在水稻中,以独立Ubil启动子驱动下的GUS基因表达水平为最高,CaMV35S启动子附加18SrRNA基因同源序列调控下的GUS基因为最低.而在毛白杨中,则呈相反趋势;(2)在水稻中,CaMV35S-Ubil复合启动子的表达活性比独立CaMV35S启动子提高了近1.5倍.而在毛白杨中,前者比后者的低;(3)Ubil启动子附加Ω序列,使GUS基因在毛白杨中的表达水平提高一倍以上.但CaMV35S-Ubil复合启动子附加Ω序列,对GUS基因在毛白杨及水稻愈伤组织中的表达活性均没有明显的增强作用.     

不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性

以pB1121为出发质粒,利用烟草泛素启动子Ubi．U4、CaMV35S启动子以及Kozak序列构建4种GUS基因表达载体,通过叶盘转化法转化烟草叶片,检测瞬时表达活性,研究不同调控序列对外源基因表达的调控作用。结果表明：CaMV35S启动子附加Kozak序列后使GUS活性比独立使用CaMV35S提高了近2倍：双CaMV35S启动子附加Kozak序列驱动GUS基因的表达活性与单CaMV35S附加Kozak序列相当;烟草泛素启动子附加Kozak序列的表达活性为CaMV35S启动子附加Kozak序列的1．5倍;Ubi．U4-CaMV35S复合启动子附加Kozak序列驱动GUS基因表达水平最高,其表达效率是双CaMV35S启动子附加Kozak序列调控下GUS表达效率的3倍,为CaMV35S独立作用时的10倍。     

抗氧化剂对农杆菌介导的大豆下胚轴GUS基因瞬时表达的影响

大豆(Glycine max)下胚轴作为大豆遗传转化的外植体材料,能快速高频再生不定芽。然而,在遗传转化过程中褐化影响基因转化效率。在该研究中,我们用含有GUS染色基因和hpt II(Hygromycin phosphotransferase II)筛选基因的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404侵染大豆下胚轴,并用组织化学定位法测定了GUS基因的瞬时表达,以确定大豆的优化基因转化条件。结果显示,在共培养基中加入硫代硫酸钠、L_半胱氨酸以及二硫苏糖醇等抗氧化剂,可以有效地抑制大豆下胚轴在组培过程中褐化的发生,并大幅度提高农杆菌在下胚轴的瞬时表达率。这些结果说明抗氧化剂可以降低这种影响并有效提高基因转化效率。     

不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性的研究

以pBI121为出发质粒, 利用烟草泛素启动子Ubi.U4、CaMV35S启动子以及Kozak序列构建4种GUS基因表达载体,通过叶盘转化法转化烟草叶片, 检测瞬时表达活性, 研究不同调控序列对外源基因表达的调控作用。结果表明: CaMV35S启动子附加Kozak序列后使GUS活性比独立使用CaMV35S提高了近2倍; 双CaMV35S启动子附加Kozak序列驱动GUS基因的表达活性与单CaMV35S附加Kozak序列相当; 烟草泛素启动子附加Kozak序列的表达活性为CaMV35S启动子附加Kozak序列的1.5倍; Ubi.U4-CaMV35S复合启动子附加Kozak序列驱动GUS基因表达水平最高, 其表达效率是双CaMV35S启动子附加Kozak序列调控下GUS表达效率的3倍, 为CaMV35S独立作用时的10倍。     

利用GUS基因瞬时表达对大豆子叶节和胚尖转化方法的比较及优化

建立了一个综合利用CaMV 35S：：GUS基因的瞬时表达水平、表达位点和表达率来评价大豆转化效率的检测体系,并利用该体系对分别以栽培大豆（Glycine max L．）“科丰6号”、“合丰35”、“中黄13”和“垦农18”的子叶节和胚尖为外植体的农杆菌介导的2种不同转化方法进行了比较和优化。实验结果表明,不同的转化方法对大豆的品种要求不同,“科丰6号”和“合丰35”2个品种适合子叶节转化法．而“中黄13”更适于胚尖转化法。大豆萌发培养基和共培养基对转化频率的影响存在交互作用,低6-BA的萌发培养基和高6～BA的共培养基配合、或者高6-BA的萌发培养基和低6-BA的共培养基配合使用适合“科丰6号”子叶节转化法,而“中黄13”胚尖转化法要求萌发培养基和共培养基中的6-BA浓度都较高。另外,在子叶节转化系统中,6d苗龄的子叶节共培养3dGUS基因的瞬时表达率较高,而在胚尖转化系统中大豆的萌发时间对GUS基因的瞬时表达率并没有显著的影响,胚尖与农杆菌共培养较宜的时间为5d。     

高羊茅组织培养再生体系及GUS基因瞬间表达研究

以成熟种子为外值体,对高羊茅纰织培养和植株再生体系进行了优化,分析了不同浓度2．4-D、6-BA和激动素对高羊茅愈伤组织诱导和愈伤组织分化成苗的影响．结果表明：9．0mg／L 2．4-L)对愈伤组织的诱导效果最佳．0．2mg／L激动素是愈伤组织分化成苗的最适浓度．二者的诱导率和分化率分别达到68．08%和45．83％。在愈伤组织继代培养基中附加1．0mg／L 2．4-D、0．5mg／L 6-BA和1．25mg／L CuSO4;有利于胚性愈伤组织的形成,可以明显促进愈伤组织分化。同时．采用基因枪法将GUS基因导入高羊茅愈伤组织中,通过组织化学染色检测到了GUS瞬间表达活性;并对影响CUS基因瞬间表达的因素进行了分析．以期为提高基因枪法遗传转化效率提供参考。     

利用病毒载体在烟草中瞬时表达融合HBsAg基因

利用马铃薯PVX病毒载体构建了外源人工融合乙肝表面抗原HBsAg基因的表达载体,在烟草中利用农杆菌介导进行瞬时表达,以快速鉴定外源基因瞬时表达的状况以及重组蛋白的免疫活性。利用PCR技术从含有人工融合HBsAg基因的表达载体中分别扩增出LP PreS1 PreS2 S、PreS1 PreS2 S、PreS2 S序列,将其分别与PVX病毒载体pgR106连接,构建成PVX-LP、PVX-S1和PVX-S2等3个转化载体,并将此载体导入农杆菌菌株GV3101中用于侵染烟草植株叶片。感染植株经RT-PCR、RNA Dot blotting和HBsAg蛋白的ELISA检测显示,3个人工融合的HBsAg基因均可在植物体内得到转录,翻译成具有活性的蛋白。结果表明,外源融合HB-sAg基因经过植物病毒载体瞬时表达系统可以在植物系统中正常转录和翻译。     

Class I patatin基因5‘侧翼区驱动的GUS基因在马铃薯块茎中专一性表达

Binary vectors pPATIs (with partial signal sequence) and pPATI (without signal sequence) were constructed by fusing 1.4 kb 5' flanking regions of Class I patatin gene with GUS. Transient GUS expression was observed in in vitro tuber slices bombarded with pPATI. These constructs were then introduced into potato (cv. Desiree) via Agrobacterium tumefaciens transformation. Transgenic potato plants were confirmed by X-Gluc staining and PCR. Using in vitro tuberization system, GUS activities were assayed by fluorescence. It was shown that, in plants transformed with PATI-GUS, GUS specific activities were about 10-20 fold higher in tubers than in stems. Increased sucrose concentration could not induce PATI-GUS expression, but light enhanced PATI-GUS expression in cultured shoots.     

植物源内含子对GUS基因表达模式的影响

采用报告基因的瞬间表达来优化转化体系是提高农杆菌介导法转化效率的重要手段,GUS以稳定、易于定性定量分析等独特优点成为瞬间表达体系的首选。pCaMV 35S启动下的GUS基因可在农杆菌中表达,另外还首次报道该嵌合基因同时也可在大肠杆菌中高效表达。为避免GUS基因在农杆菌中的表达对瞬间表达体系的影响,一拟南芥蛋白基因的内含子被插入到GUS基因的编码区,进而构建了含内含子的GUS植物表达载体pBI121-GUSint。组织化学染色结果表明,GUSint在农杆菌中没有表达,而在接种3d的油菜中可高效瞬间表达,其中在子叶柄（带子叶）中瞬间表达率高达100%,这一方面证实载体构建成功,另一方面也为进一步优化油菜及其它芸薹属植物转化体系及在油菜中快速研究目的基因的功能和表达调控模式奠定了基础。     

水稻蜡质基因第一内含子碱基突变引起其RNA二级结构的可能变化

通过体外转录得到籼稻品种232蜡质基因第一内含子5’端430 bp的ssRNA分子,以及在此区域发生了自然突变的粳稻品种寒丰蜡质基因第一内含子5’端同样长度的ssRNA分子。部分变性胶电泳结果表明两种ssRNA分子的迁移速率不同。将两种ssRNA分子的核酸序列用计算机分析,表明此两种ssRNA分子能形成不同的茎-环结构,自由能值也有差异。对突变引起的这些不同与两种水稻品种蜡质基因转录本剪接的差异进行了讨论。     

外源GUS基因在PEG介导的花椰菜原生质体中的瞬间表达

为了将外源基因导入花椰菜原生质体获得转基因植株,本文研究了ＰＥＧ介导的外源基因在花椰菜下胚轴原生质体中的瞬间表达。（１）２０％ＰＥＧ将质粒ｐＢＩ２２１导入原生质体后ＧＵＳ表达比１３％ＰＥＧ导入的高,但易造成原生质体损伤。（２）热激处理增强表达,但在随后的培养过程中易造成原生质体降解。（３）原生质体状况对表达有重要影响,５ｄ龄下胚轴原生质体比８ｄ龄的表达强。（４）不同质粒及启动子表达强度不同。质粒ｐＫＩＷＩ１０１比ｐＢＩ２２１表达强３倍左右。     

利用同源重组提高外源GUS基因在植物组织中表达

将１８Ｓ ｒＲＮＡ基因的部分片段,或烟草的核骨架结合序列（ＳＡＲｓ）作为同源序列与外源ＧＵＳ基因作为报告基因构建成用于基因打靶载体,以枪或农杆菌介导转化到拟南芥的根组织中,检测ＧＵＳ基因瞬间表达的结果显示,两种同源基因序列均可提外源ＧＵＳ基因的表达。     

小麦中外源基因瞬间表达调控研究及兔防御素（NP—1）基因的转化

将不同５上游调控序列驱动下的ＧＵＳ基因用基因枪法导入小麦幼胚和胚性愈伤组织,通过组织化学分析法和荧光分析法对ＧＵＳ基因的表达进行定量检测,比较了几种烟草花叶病毒（ＴＭＶ）Ω增强子序列对小麦中外源基因瞬间表达的调控作用;然后将其中效率最高的玉米Ｕｂｉｌ启动子与兔防御素（ＮＰ－１）连接起来,并加上Ｎｏｓ终止子,构民ＮＰ－１基因小麦表达载体,并转化小麦幼胚,经ＰＣＲ－Ｓｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析,初步确