月季‘绿萼’花器官发育相关microRNA的鉴定及分析

利用高通量测序技术,构建了中国古老月季‘绿萼’(Rosa chinensis ‘Viridiflora’)和‘月月粉’(R.chinensis‘Old Blush’)花蕾期的microRNA(miRNA)文库,并对其进行了测序和序列分析。结果显示,在‘绿萼’文库中,鉴定到已知的miRNA成熟体39个,miRNA前体42个;预测到新的miRNA成熟体56个,前体57个。在‘月月粉’文库中,鉴定到已知RNA成熟体39个,已知miRNA前体40个;预测到新的miRNA成熟体53个,前体57个。与‘月月粉’相比,‘绿萼’中差异表达的miRNA有31个,其中17个上调、14个下调。荧光定量PCR实验结果表明,miR156、miR398和miR535在2种月季的花蕾期表达上调,而miR167、miR172和miR396表达下调。进一步检测miR172和miR156在2种月季不同花器官中的表达差异,发现miR172在‘绿萼’的花瓣、雌、雄蕊中表达显著下调,提示miR172可能通过负调控其靶基因RcAP2的表达,在‘绿萼’花器官发育过程中起重要作用。     

文心兰25条miRNA前体序列特性及其表达分析

为了解文心兰miRNA的序列特性及其在不同组织部位中以及软腐病侵染过程中的表达规律,该研究对文心兰转录组及miRNA数据库中的25条miRNA前体(pre miRNA)序列和15条成熟体序列进行序列特性分析,并对25条pre miRNAs在文心兰不同组织部位及软腐病侵染的假鳞茎中的表达情况进行实时荧光定量分析。结果显示：（1）文心兰25条pre miRNAs序列可分为13个家族,其中包含15条成熟体序列。（2）Mfold二级结构预测显示,文心兰25条pre miRNAs的最小折叠自由能在-32.04~ -120.98 kal/mol之间,均可以形成典型、稳定的发夹结构。（3）序列比对分析发现,同一家族的前体与成熟体存在一个约20个碱基长度的保守区域,推测该区域可能为文心兰miRNA成熟体所在区域。其中,13个前体家族中,有10个家族的成熟体可以完全定位于其前体中。（4）实时荧光定量PCR结果显示,在文心兰不同组织部位中,miR159 unigene0037857、miR167 unigene0011236、miR167 unigene0002619、miR169 unigene0022341、miR172 unigene006514、miR396 unigene19032、miR398 unigene0009996、miR2950 unigene0006151、miR2950 unigene0006422等pre miRNAs在叶片中大量累积可能有利于其叶的形态建成;miR162 unigene0003615、miR162 unigene0013441、miR166 unigene0011870、miR168 unigene0009958等pre miRNAs同时在根和叶中均大量表达有利于其根和叶的发育;而miR171 unigene0045985、miR396 unigene0011179、miR396 unigene0011180在根和茎中的大量表达可能有利于其根和茎的发育。（5）在软腐病病菌侵染文心兰假鳞茎的过程中,miR159 unigene0037857、miR167 unigene0011236、miR396 unigene0011179、miR396 unigene0011180、miR396 unigene0019032、miR845 unigene0012489的表达总体呈下降趋势;miR162 unigene0040566、miR166 unigene0011870、miR168 unigene0009958、miR171 unigene0045985在软腐病菌液侵染4 h其表达量升高,之后表达量下调;miR162 unigene0003615、miR167 unigene0002619、miR168 unigene0047942、miR169 unigene0022341、miR845 unigene0012489在菌液侵染过程中其表达量呈现先下降后上升的趋势,并在侵染8 h后表达量达到最低。研究表明,文心兰pre miRNAs 13个家族不同成员在进化进程中具有高度保守性与特异性的结构特点,并可能广泛参与文心兰不同组织的生长发育及参与软腐病菌侵染的响应。     

5个葡萄microRNAs及其靶基因在冬芽二次成花过程中的表达

试验以‘藤稔’葡萄为材料,利用荧光定量PCR技术检测5个葡萄miRNAs( vv-miR160a、vv-miR171a、VVmiR159、vv miR164c和vv-miR167c)及其靶基因在不同摘心处理的冬芽发育过程中的动态表达特征,以探讨microRNAs调控花发育的分子机理.结果显示:5条miRNAs及其靶基因在二次成花的冬芽中的表达发生了明显变化.其中,vv-miR160a、vv miR171a和vvmiR159表达水平明显增强,在花序中有最高表达;vv-miR164c和VVmiR167c的表达水平明显减弱,在花序中的表达最低或较低,而这些vv-miRNAs在对照组中表达水平均无明显变化.研究表明,上述miRNAs参与了葡萄冬芽的二次花的发育;从miRNAs与其靶基因的表达呈现的消长变化趋势看,这些vvmiRNAs通过负调控其靶基因表达而起作用.     

miR172-AP2模块调控植物生长发育及逆境响应的研究进展

MicroRNA (miRNA)是一类具有调控能力的非编码小分子RNA, 通过与靶基因mRNA特异或非特异性结合, 诱导靶基因mRNA降解或抑制其翻译, 从而调控植物的生长发育。其中, miR172的靶基因AP2所编码的转录因子为植物所特有, miR172在转录后或翻译水平对AP2进行表达调控, 进而调控植物的花发育、时序转换、小穗形态、块茎和果实发育、结瘤(豆科)以及逆境响应等过程。该文综述了近年来miR172-AP2模块在植物生长发育调控方面的最新研究进展。     

落叶松体胚发育中5个miRNA前体与成熟体的表达

利用同源比对或RACE克隆了5个落叶松(Larix leptolepis) miRNA前体。结果显示, 在各物种miRNA前体间, 成熟序列高度相似, 但其它序列相似度差异大, 序列相似度与亲缘关系有关。采用qRT-PCR分析了5个miRNA、前体和靶基因在落叶松体胚8个发育阶段的表达变化。结果显示, miRNA表达最高峰出现在后期子叶胚, 暗示与促进胚胎休眠有关; 表达次高峰出现时期不同, 表现为miR397和miR408在PEMIII, miR398在早期单胚, miR156和miR166在早期子叶胚, 表明其与保持薄细胞壁、质子传递、顶端分生组织形成等调控有关。miRNA成熟体表达与前体含量不呈线性相关, 可能受多重调控。研究结果对于阐明MIR基因进化、表达调控及在体胚发育中的调控功能具有重要理论意义。     

油棕（Elaeis guineensis）中果皮发育过程中miRNA的表达动态分析

以CTAB法提取油棕（Elaeis guineensis）中果皮5个不同发育时期（G1～G5）的小RNA。从前期研究获得的油棕小RNA测序数据库中筛选12个候选miRNA,实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测其在果实发育过程中的表达量变化,并进一步对显著差异表达的miRNA进行靶基因预测。结果表明：中果皮5个不同发育时期小RNA的OD260/OD280比值在1.7～2.0之间;浓度分别是289、364、476、213、390 ng/μL;qRT-PCR检测结果显示,12个候选miRNA在5个发育时期均显著性差异表达,特别是在中果皮发育第4个时期（G4）和第5个时期（G5）表达量极显著增高,其中miR395和miR156在第4个时期表达量最高;miR395和miR528在发育第5时期表达量最高;靶基因预测结果显示差异表达的部分miRNA,其靶基因可能参与了脂肪酸代谢通路,如磷脂酸磷酸脂酶和磷脂酶D。本研究筛选的与脂肪酸代谢相关的miRNA为今后油棕脂肪酸代谢调控通路研究提供了可能的线索。     

胡杨无性系幼苗响应盐胁迫的miRNA表达差异研究

植物miRNA在调控基因表达、细胞周期、生物体发育、抗逆等方面起重要作用。为研究胡杨(Populus euphratica Oliv.)的耐盐机制,以1年生胡杨无性系幼苗为材料,构建具有空间代表性的盐胁迫胡杨cDNA文库,利用二代测序技术测定NaCl胁迫下和正常培养条件下胡杨叶和根miRNA表达情况。结果表明,不同的miRNA之间表达量存在明显差异,表达丰度最高的miRNA有miR156、miR157、miR165、miR166和miR167等,合计占总表达量的90%以上。胡杨根部存在特异表达的miRNA,在整个耐盐调控机制中发挥着生理调节、分子调控和信号传导等极为重要的作用。盐处理样品中发现大量响应盐胁迫的miRNA,对这些转录因子进行靶基因预测和注释后,发现很多盐胁迫响应的miRNA与NAC和SPL等重要转录因子家族相关,与前人的结论一致,另外还发现许多miRNA的调控对象是ATP酶和激素响应因子。     

芥蓝miR156a家族进化特性及表达分析

miRNA广泛参与植物的发育过程。芥蓝形态多样,叶片发育因品种而异。为了解miR156a家族的进化特性及其在芥蓝叶片发育中的表达模式。该研究对芥蓝miR156a成员及其前体pre miR156a成员进行生物信息学分析,比较不同品种芥蓝叶形的差异,并采用qRT PCR方法分析芥蓝不同组织部位中pre miR156a的表达水平、以及叶形相似的芥蓝品种‘翠宝’和‘改良香菇’中不同类型叶片的pre miR156a成员及其靶基因的表达水平。结果表明：(1)多序列比对和进化树分析发现芥蓝miR156a家族成员和pre miR156a 3p_1在进化过程中高度保守;二级结构预测发现pre miR156a每个成员均能形成茎环结构并包含2～3个miR156a成员序列;靶基因预测显示miR156a 5p和miR156a主要靶向SPL,而miR156a 3p_1则靶向CTPS等不同的基因。(2)‘翠宝’和‘改良香菇’芥蓝的叶形最为相似,qRT PCR分析显示,pre miR156a在‘翠宝’营养生长期的叶片中高度表达。(3)pre miR156a成员在‘翠宝’和‘改良香菇’不同类型叶片中差异表达,pre miR156a主要在成熟叶和菇叶中表达,而pre miR156a 3p_1和pre miR156a 5p在第一片真叶中表达量更高。(4)靶基因分析的结果在不同品种中呈现不同趋势,‘翠宝’成熟叶中SPL10/15高表达,SPL2表达量降低;‘改良香菇’中SPL10在成熟叶和菇叶中表达降低,SPL15在菇叶中高表达,SPL2在不同类型叶片中表达无差异。研究认为,miR156a成员及其靶基因SPL2/10/15可能参与调控芥蓝叶片发育,不同品种中作用的靶基因可能存在差异,从而导致了各品种芥蓝叶片发育的差异。     

粗梗水蕨营养期和生殖期微RNA的测定与分析

miRNA控制着开花植物从营养期到生殖期的转变,但这种机制的进化仍不得而知。蕨类植物是陆地植物进化的重要环节,本研究分别测定了粗梗水蕨营养期和生殖期的小RNA,鉴定了42个保守的miRNA,并证实了miR397等7个miRNA最早出现在蕨类植物。miR156在粗梗水蕨的生殖期表达下调,而其SPL靶基因与此同时表达上调。miR172则在生殖期表达上调,并同时有其AP2-like靶基因下调的现象。miR171和miR159的积累水平也发生了变化,因此miRNA控制生长时期转变的机制应该出现在原始的真叶植物中。miR160/166/319/394可能与粗梗水蕨可育叶向下内卷的形态有关。粗梗水蕨能产生tasiR-ARF,从而表明miR390-TAS3-ARF的通路第1次出现于蕨类植物。     

芥蓝miR172家族成员进化特性比较及时空表达分析

为了明确植物miR172家族成员的进化特性及其在不同组织部位的表达情况,该研究以芥蓝miR172a家族为例,通过芥蓝miR172a成熟体序列比对、前体(pre-miRNA)二级结构预测、系统发育进化树构建、靶基因预测及实时荧光定量等手段,对芥蓝miR172a和miR172b基因家族的进化特性及其在芥蓝不同组织部位中的表达规律进行分析。结果显示:(1)芥蓝miR172家族存在20个成熟体成员,通过比对发现20条序列都存在一个重叠区域,该区域中ACTAGATC 8个碱基高度保守,并且在芥蓝pre-miR172的3′和5′端均能形成成熟体。(2)mfold预测结果显示,miR172a家族5个前体成员的最小折叠自由能在-54.55~-78.60kal/mol之间,均能自发形成典型、稳定的茎环二级结构。(3)系统发育进化树显示,芥蓝miR172a家族的前体成员具有一定的保守性和多样性,并与番木瓜pre-miR172a亲缘关系较近。(4)靶基因预测发现芥蓝miR172a共有13个不同靶标基因,多个成员也可以作用于相同靶标基因。(5)实时荧光定量PCR显示,芥蓝pre-miR172a和pre-miR172b家族不同成员在不同组织部位表达量差异显著,10个成员在9个组织部位中的表达各不相同。其中,芥蓝pre-miR172a-1、pre-miR172a-2、premiR172a-3和pre-miR172b在芥蓝荚中大量表达;pre-miR172b-5p和pre-miR172b-5p-2在芥蓝花中大量表达。研究表明,miR172在芥蓝花和荚的发育过程中起着重要的作用。