丙型肝炎病毒核心抗原高效表达及产物抗原性的研究

用含谷胱甘肽转硫酶（ＧＳＴ）基因的ｐＧｅｘ－２Ｔ为表达载体在大肠杆菌中高效表达了含ＨＣＶ核心区部分基因片段（约１２２个氢基酸）的融合蛋白,表达产物Ｃ２７经测定占菌体总蛋白的３０％,Ｃ２７纯化后,用我国ＨＣＶ诊断试剂第二代血清参考品为标准与Ｇ１１核心抗原进行比较,结果显示二者具有相同的总体检出率和近似的抗原活性。因此,推测表达的部分区段基因可能是核心区重要功能区域。另外融合蛋白对提高重组蛋白的抗原活性和分离纯化等均有一定作用。     

Mn-SOD与抗癌胚抗原单链抗体基因的融合及高效表达

将Ｍｎ－ＳＯＤ与抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因（Ｓｃ－Ｆｖ ｇｅｎｅ）融合,重组到含Ｔ７启动子的表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）中,构建表达质粒ｐＥＴＭｎ－ＳＯＤ－ＳｃＦｖ,并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行高效表达,表达物占菌体可溶性总蛋白的２４％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质和迹图谱显示表达物分子量为４５ｋＤ与融合基因编码蛋白质的理论值相符。该蛋白质在大肠杆菌中为泌型表达有利于纯化。ＲＩＡ测定表     

液泡膜水通道蛋白γ—TIP表达载体的构建及其抗体的制备

利用PCR技术,从拟南芥（Arabidopsisthaliana（L．）Heynh．）液泡膜水通道蛋白γ－TIP的cDNA中扩增了含水通道特异保守区的205bp片段,并将其构入pGEX－KG原核表达载体。酶切、测序分析表明构建的重组质粒pGEX-TIP结构正确。0．4mmol/L的IPTG可诱导表达分子量为32kD融合蛋白GST-TIP,表达蛋白以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的50％。实验用SDS-PAGE制备电泳从菌体的超声裂解液中纯化了GST-TIP融合蛋白,以此融合蛋白为抗原制备了高质量的液泡膜水通道蛋白的抗体,为研究水通道蛋白在组织中的定位及生理功能提供了有用的蛋白探针。     

人白细胞介素-17基因的克隆、表达及其表达产物的分离纯化

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地从ＰＩ（ＰＭＡ,Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）、ＰＨＡ活化的人Ｔ细胞中扩增出ｈＩＬ－１７编码区ｃＤＮＡ（４６８ｂｐ）,克隆测序证实得到该基因．用特殊设计的引物扩增ｈＩＬ－１７成熟肽编码区（４１４ｂｐ）,接入表达载体ｐＥＴ３０ａ质粒中．ｐＥＴ３０ａ－ｍｈＩＬ－１７在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中获得高效表达,目的蛋白占总菌体蛋白５０％左右．经凝胶过滤和阴离子交换层析两步分离纯化和复性,得到单体型ｒｍｈＩＬ－１７,纯度达９８％以上,Ｎ端１６个氨基酸序列分析,结果与文献报道一致．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法测定分子量为１６ｋＤ,薄层丙烯酰胺凝胶等电聚焦分析该蛋白等电点为ｐＨ８．８～８．９,３ＨＴｄＲ参入法测定ｒｍｈＩＬ－１７单体的体外活性,实验结果表明ｒｍｈＩＬ－１７对ＰＨＡ活化人的ＰＢＭＣ细胞具有抑制作用,结果同可溶型ＩＬ－１７Ｒ性质相似     

Nm23-H1/NDPK-A基因在大肠杆菌中的高效表达及产物纯化的研究

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增人二磷酸核苷激酶Ａ亚基（ＮＤＰＫ－Ａ）基因,即ｎｍ２３－Ｈ１／ＮＤＰＫ－Ｋ基因的编码序列,经序列分析后,定向克隆于表达质粒载体ｐＢＶ２２０,在大肠杆菌ＤＨ５α中高效表达出重组人ＮＤＰＫ－Ａ．表达产物为可溶性的非融合蛋白,占菌体总蛋白４２％．斑点ＥＬＩＳＡ法鉴定表明表达产物与ＮＤＰＫ－Ａ标准抗血清呈阳性反应．以ＤＥＡＥ纤维素弱阴离子交换层析、ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ染料亲和层析结合高效液相排阻色谱技术纯化ｒＮＤＰＫ－Ａ,得纯度为９６．７％的目标蛋白．以反相高效液相色谱法进行酶活性分析,表明纯化的ｒＮＤＰＫ－Ａ能催化ＡＴＰ＋ＵＤＰ＝ＡＤＰ＋ＵＴＰ的反应,比活性为８００Ｕ／ｍｇ蛋白．     

丙型肝炎病毒核心重组抗原C_（27）的纯化

高效表达了ＨＣＶ核心区基因抗原之后,对表达蛋白Ｃ_（２７）进行了纯化。经研究,重组蛋白是以包涵体形式存在于宿主菌内的。Ｃ_（２７）重组蛋白分别经过包涵体洗涤、ＤＥＡＥ阴离子交换层析和Ｓ－２００分子筛两步柱层析纯化之后,纯度大于９５％,纯化得率为５３．２％,总回收率为１７．９％。纯化工艺流程简单、得率高,适合向规模化生产发展。     

日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达

研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ,ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ）等分子生物学技术,以表达Ｓｊ２６ＧＳＴ的Ｅ．ｃｏｌｉｐＧＥＸ衍生质粒为模板,经ＰＣＲ得到编码Ｓｊ２６ＧＳＴ的全长ｃＤＮＡ片段．将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ）７０的启动子下游,再将ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因一起亚克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中,得到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达质粒ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６．ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６电转化入ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ２１５５中表达Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原,所表达的天然重组Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带．其表达量分别占ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌体总蛋白的１５％和１０％．可见,Ｓｊ２６ＧＳＴ基因能在ＢＣＧ中高效表达．     

人T细胞白血病病霉Ⅰ型env基因的克隆与表达

本文通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从整合有人Ｔ细胞白血病病毒Ⅰ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）的ＭＴ－２细胞株中,扩增出ＨＴＬＶ－Ｉ外膜蛋白（ｅｎｖ）的全基因（１．４５ｋｂ）,并成功地克隆入ｐＵＣ１９载体,构建成ｅｎｖ基因克隆ｅｎｖ／ｐＵＣ１９．利用原核高效表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ,在大肠杆菌中有效地表达了与谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）融合的ｅｎｖ羧基末端抗原的重组蛋白,融合基因的转录由ｔａｃ启动子调控。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明,有一约５２ｋＤ的目的蛋白带,表达量占菌体总蛋白的１０％;ＷｅｓｔｅｒＮｂｌｏｔｔ及ＥＬＩＳＡ结果显示,表达产物能与ＨＴＬＶ－Ｉ多抗血清结合。本研究为研制ＨＴＬＶ－Ｉ的诊断试剂及进一步了解ｅｎｖ的免疫学和生物学性质打下了基础。     

人重组GM－CSF／HAS－D3嵌合蛋白（GM－HSA）在大肠杆菌中的表达及其产物稳定性的研究

将人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和人血清白蛋白第三功能区（ＨＡＳ－Ｄ３）的基因串联后,在Ｅ．ｃｏｌｉ中获高效表达,表达量占菌体蛋白的３２．６％．利用ＴＦ－１体外细胞活性测定表明,ＧＭ－ＨＳＡ的活性单位为１．０４×１０~６Ｕ／ｍｇ,虽然其比活性低于ＧＭ－ＣＳＦ,但比后者具有更高的体外热稳定性和储藏稳定性．     

大肠杆菌cai DE的基因克隆与表达

从Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ４１００菌体的染色体ＤＮＡ中利用鸟枪法克隆含编码肉碱消旋酶及相关因子的ｃａｉＤＥ基因片段,并经序列分析验证,由重组质粒ｐｌＸ３９３亚克隆得到ｐＤＳＷ２重组表达质粒,后者转入Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中是丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导,在聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上分子量为３０ｋＤ和２４ｋＤ附近可见明显的表达蛋白带。     

TGF-βⅡ型受体mRNA及蛋白在人IgA肾病肾小管上皮的表达

为探讨转化生长因子-β（TGF-β）在人IgA肾病肾小管间质纤维化中的应用。本用原位杂交及免疫组织化学方法研究转化生长因子-βⅡ型受体（TGF-βRⅡ）mRNA和蛋白在肾小管上皮细胞的表达。结果表明：TGF-βRⅡmRNA定位于肾小管及集合管上皮细胞,TGF-βRⅡ蛋白定位于肾小管及集合管上皮细胞的基底面,腔面及侧面,或呈与基底膜相垂直的基底部纵纹出现于一些细胞的胞质内,肾小球系膜细胞也可见TGF-βRⅡmRNA及蛋白表达,但不如肾小管明显,以上结果提示肾小管和集合管上皮细胞的受体可与TGF-β特异性结合。TGF-β则通过自分泌作用促进小管上皮细胞合成与分泌ECM。过多的ECM在小管周围沉积;或TGF-β抑制ECM的降解,终将导致IgA肾病的肾小管间质纤维化。     

人白细胞介素12(hIL\|12)基因在杆状病毒表达载体系统中的表达

人白细胞介素12(hIL-12)是细胞介导免疫发生的关键调节因子,也是目前发现的唯一的异源二聚体细胞因子,由P35和P40两个亚基经二硫键连接而成.利用DNA重组技术,分别构建了含hIL-12p35基因和p40基因的重组转移载体质粒pAcAB3-p35和pAcAB3-p40.将两个重组转移载体分别与致死缺陷型线性化苜蓿丫纹液蛾核型多角体病毒(AcNPVBaculoGold LinearizedBaculovirus)基因DNA共转染昆虫细胞,构建出遗传稳定的重组病毒AcNPV-OCC-hIL-12(p35)与AcNPV-OCC——hIL-12(p40).将两种病毒分别感染Sf9细胞,取细胞培养物上清和细胞裂解物上清进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示hIL-12p35和p40两基因均在昆虫细胞中获得表达,且能分泌至胞外.表达产物具有免疫原性.     

HCV核心抗原基因的克隆和表达

用ＰＣＲ方法扩增人丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｃ抗原部分基因片段,将其克隆到一种新的表达载体ＰＱＥ中构成重组质粒ＰＱＥ－Ｃｏｒｅ短,转化大肠杆菌Ｍ１５株。含ＰＱＥ－Ｃｏｒｅ重组质粒的工程菌株以２ＹＴ中３７℃下培养加入ＩＰＴＧ诱导７小时,经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳分离蛋白质,证明工程菌合成了大量改造的ＨＣＶ Ｃｏｒｅｎｈｊ ｒ     

病毒ki-ras表达质粒的构建

用重组DNA技术构建了病毒ki-ras表达质粒,用Eco R Ⅰ和Bam H Ⅰ酶解pUC-9DNA,小牛肠碱性磷酸酶脱磷酸,病毒ki-ras编码基因来源于Hi-Hi-3质粒DNA的Sat Ⅱ和Eco R Ⅰ酶切的0.6kb片段,用连接酶和DNA聚合酶Klenow片段将两个片段连接,转化大肠杆菌JM103,免疫筛选表达质粒,从156个转化克隆中得到两株表达质粒,其中一株pKras83的p21蛋白表达量为细菌总蛋白量的10％。     

粟酒裂殖酵母钙调素基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的分离纯化

用带有粟桌酒裂殖酵母钙调索基因的质粒PEC/PCA和质粒PSB6来转化大肠杆菌SB1,扩增培养后破碎离心,上清液经Phenyl-SepharoseCL－4B柱、DEAEcellulose-52柱、SephedesG－75柱分离,得到纯化的表达产物,此产物经SDS—PAGE电泳鉴定和对环核苷酸：酷酶（cyclicnucleotidephosphodiesterase,PDE）活性的激活鉴定,确定为酵母钙调素,且其分产量小于猪脑钙调素。     

用λZAP Express作载体构建金针菇子实体表达型cDNA文库

采用QuickPrep micro mRNA Purification 试剂盒从新鲜金针菇子实体中快速提取、纯化mRNA,Time Saver cDNA Synthesis试剂盒逆转录成cDNA分子后,通过在cDNA分子两端加上EcoRⅠ/NotⅠ接头,在T4多核苷酸激酶的作用下磷酸化,与表达载体λZAP Express Predigested Vector连接,然后用包装蛋白在体外包装连接产物,感染E.coli XL1-Blue MRF'构建成表达cDNA文库.经检测文库滴度为4.0×106 pfu/ml,文库扩增后,滴度达2.0×1010 pfu/ml,重组率为90%,cDNA分子长度在0.3-3.5 Kb范围.应用原位免疫杂交,初步筛选出火菇素相关基因的阳性克隆.     

用λZAPExpress作载体构建金针菇子实体表达型cDNA文库*

采用QuickPrepmicromRNAPurification试剂盒从新鲜金针菇子实体中快速提取、纯化mRNA,TimeSavercDNASynthesis试剂盒逆转录成cDNA分子后,通过在cDNA分子两端加上EcoRⅠ/NotⅠ接头,在T4多核苷酸激酶的作用下磷酸化,与表达载体λZAPExpressPredigestedVector连接,然后用包装蛋白在体外包装连接产物,感染E.coliXL1-BlueMRF捁菇ǔ杀泶颿DNA文库。经检测:文库滴度为4.0×106pfu/ml,文库扩增后,滴度达2.0×1010pfu/ml,重组率为90%,cDNA分子长度在0.3-3.5Kb范围。应用原位免疫杂交,初步筛选出火菇素相关基因的阳性克隆。