五种杀鞘翅目δ—内毒素的生化,遗传及毒力特性的研究

研究了对鞘翅目昆虫有毒效的５个苏云金杆菌菌株ＹＭ－０３,Ｓｐｈ０４－０４,ＹＫ１４－０１,ＳＨ１１－０５,Ｓｐｈ１６－０１晶体蛋白的多肽组成及抗原特性,并以二龄柳叶甲虫为供试虫测定了它们的ＬＣ５０,其中以ＹＭ－０３的毒效最高,用琼脂糖凝胶电泳快速检测了五株菌的质粒,证明其质粒图型各不相同。     

苏云金芽孢杆菌δ—内毒素的杀虫机理及其增效途径

苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ,Ｂｔ）制剂是当前应用最广、最有效的微生物杀虫剂。Ｂｔ属于革兰氏阳性细菌,在形成芽孢的同时,产生伴孢晶体。伴孢晶体是Ｂｔ杀虫活性的主要来源,它可能由几种晶体蛋白即δ－内毒素组成。δ－内毒素的专一...     

苏云金杆菌6－内毒素基因及3’末端缺失基因在大肠杆菌和农杆菌中的亚克隆和表达

苏云金芽孢杆菌交种Bacillus thuringiensis aizawai 7-29 δ-内毒素基因及其3,末端缺失基因,亚克隆到质粒pUCl9上,构建了Pucf33和Puck63重组质粒。进一步将δ-内毒素基因及其3’端缺失基因,插入到植物表达载pBl121．2质粒中,构建了Pgy61和Pgyck63重组质粒。．用32P标记的δ-内毒素3’末端缺失的KpnI DNA片段的探针,与重组质粒进行DNA—DNA分子杂交,结果阳性。带有全长和3’末端缺失重组质粒,转入大肠杆菌HB101和农杆菌LA4404受体细胞中,其克隆子细胞抽提物,对大菜粉蝶和玉米螟幼虫均具有杀虫生物活性。结果证明δ－内毒素基因不仅能在大肠杆菌HB10l中,而且能在农杆菌LA4404中表达。     

土壤来源苏云金芽孢杆菌的形态、δ-内毒蛋白质及其毒力特性

在透射和扫描电镜下观察了土壤来源的94株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的菌体、鞭毛、芽孢及伴孢晶体的形态。以快速SDS—PAGE法分析了全部菌株δ-内毒素的蛋白质成分。用鳞翅目、鞘翅且及双翅目的9种昆虫进行了毒力试验。筛选出了数株杀鞘翅目和杀夜蛾科害虫的高效菌。发现了一些新型伴孢晶体,其形态和蛋白质成分均未报道过。     

昆虫肠道蛋白酶作用下δ内毒素的毒性肽及毒力特异性的变化*

本文报道杀斜纹夜娥(Prodenia lirura)δ-内毒素和杀鞘翅目昆虫δ-内毒素经昆虫肠液蛋白酶及胰蛋白酶作用后,其毒性肽及毒力特异性的变化。 以Sephadex G75柱层析提纯的130kD原毒素,经斜纹夜蛾幼虫肠液蛋白酶作用后,产生的70kD与75kD抗蛋白酶多肽(PRP)对斜纹夜蛾和家蚕皆有毒;经家蚕幼虫肠液蛋白酶作用后,产生的62kD与65kD的PRP失去对斜纹夜蛾的毒性,仅对家蚕有毒;经胰蛋白酶作用后产生的65kD与68kD的PRP,其毒力特性与经家蚕肠液蛋白酶作用后的相似。斜纹夜蛾肠液蛋白酶作用后产生的PRP,可进一步被家蚕肠液蛋白酶或胰蛋白酶降解为63-65kD的PRP,此种多肽对斜纹夜蛾无毒,对家蚕有毒。杀鞘翅目昆虫的原毒素不能为胰蛋白酶和粘虫肠液所完全降解。证明不同种类昆虫的肠道蛋白酶对占-内毒素蛋白质的作用位点不同,δ-内毒素对宿主昆虫的毒力特异性与其肠道蛋白酶的特性密切相关。     

苏云金杆菌δ—内毒素基因在大肠杆菌中的克隆及表达

分离了苏云金杆菌肯尼亚亚种7404(Bacillus huringiensis subsp．Kenyae 7404)和库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp．Kwrstaki HD-1)的质粒。经凝胶原位杂交证明苏云金杆菌肯尼亚亚种7404的δ—内毒素基因位于约47Md大小的一个质粒上。用蔗糖密度梯度离心法从sau 3 A1部分酶解的上述两种苏云金杆菌质粒DNA酶解片段中分离出大于 4kb的DNA片段,将这些片段克隆到pBR332的Barn HI位点上并转化大肠杆菌HB101。通过菌落原位杂交、菌落原位放射免疫试验及Western blct分析等方法,选到了带有δ—内毒素基因并能在大肠杆菌中表达此毒蛋白的转化体。初步的生物学试验表明,在四个试验过的转化体中带有肯尼亚亚种δ—内毒素基因的转化体TK89及带有库斯塔克亚种δ—内毒素基因的转化体THl2和TH48对烟青虫(Heliothis assulta)有毒杀活性。     

杀鞘翅目苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫剂的研究

从中国土壤中分离出2株杀鞘翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) YM03及SHQ11-10。YM03的血清型为H8a8b,SHQ1110的H血清型未知。二菌株皆产近菱形的薄扁伴孢晶体,分别含68～70kD和65kD的晶体蛋白质。毒力生物测定证明对柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)及马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)有高毒效。发酵性能良好。YM03粉剂田间防治马铃薯甲虫有高效。稀释400倍喷雾,防治效果达94.6%。     

电脉冲穿孔法将苏云金杆菌δ-内毒素基因导入野生型芽孢杆菌

利用电脉冲穿孔法将带有苏云金杆菌毒蛋白基因的穿梭质粒导入几株野生型芽孢杆菌中。它们是野生型的蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。通过观察在新霉素和氨苄青霉素平板上长出的抗性菌落数,计算出转化效率为10~1—10~4转化子/μgDNA。从转化子中分离到的质粒DNA大小及其用HindⅢ酶切的片段与原始质粒DNA相同,毒性测试表明重组转化子对烟青虫六天的致死率达90—100％。     

电脉冲穿孔法将苏云金杆菌δ－内毒素基因导人野生型芽孢杆菌

利用电脉冲穿孔法将带有苏云金杆菌毒蛋白基因的穿梭质粒导人几株野生型芽孢杆菌中。它们是野生型的蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。通过观察在新霉素和氨苄青霉素平板上长出的抗性菌落数t计算出转化效率为10¹一10¹转化子/μgDNA。从转化子中分离到的质粒DNA大小及其用HindⅢ酶切的片段与原始质粒DNA相同,毒性测试表明重组转化子对烟青虫六天的致死率达90—100％。     

CLONING AND EXPRESSION OF CryIVD GENE OF INSECTICIDAL CRYSTAL PROTEIN OF BACILLUS THURINGIENSIS IN THE ACRYSTALLIFEROUS STRAIN

Abstract The plasmid pGEMl, carrying CryIV D, CytA and 20-kDa protein genes, was extracted and digested with Hind II /BamH I. A 5.4 kb fragment containing Cry IV D and 20-kDa protein gene was purified and ligated to an E. coli TG1. The recombinant plasmid was analyzed by restriction map and Southern blotting to determine the correct insert. Then the recombinant was transferred into Bacillus thuringiensis acrystalliferous mutant Bti. IPS. 78/11 by electroporation. The clones with strong expressiveness were obtained. The engineered strains express 72-kDa and 20-kDa proteins and form irregular hexagon paras-pore crystal. One strain bioassayed is very toxic to Culex fatigans larvae with LC₅₀ of 0. 53 μg/ml.     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白 CryⅣD基因在无晶体突变株中的克隆和表达

本文用HindⅢ/BamHⅠ对含Cry Ⅳ D基因的pGEMl质粒进行双酶切,获得了含CryⅣ和20-kDa蛋白质基因的5.4kb片段,将其与穿梭质粒pⅪ61连接,转化到感受态大肠杆菌TG1细胞,对克隆的重组质粒经质粒抽提,进行斑点杂交,Southern分析加以证实后,电转化到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株Bti.IPS. 78/11细胞中,可形成不规则的六边形晶体。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,工程菌表达72-kDa杀虫晶体蛋白和20-kDa的蛋白质,对致倦库蚊有很高的毒力,其LC_(50)值为0.53ug/ml。     

苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体蛋白基因的属性

通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交发现高毒力苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＢＴ－１５２０菌株含有两个杀虫晶体蛋白基因片段,其５’＝末端所在ＨｉｎｄⅢ片段分别为６．８ｋｂ和４．６ｋｂ,它们对应的基因分别命名为ｃｒｙ２１８和ｃｒｙ４．６。经ＰＣＲ鉴定,该菌含有ｃｒｙ１Ａａ、ｃｒｙ１Ａｂ和ｃｒｙ１Ａｃ基因,以及ｃｒｙ２基因,其中ｃｒｙ２１８属于ｃｒｙ１Ａｃ。分析了ｃｒｙ１Ａｃ基因     

类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白基因的克隆

芽胞杆菌CTC菌被鉴定为苏云金芽胞杆菌,鞭毛血清型H2,幕虫亚种;产生卵圆形伴胞晶体,伴胞晶体蛋白为100kD;测定了该蛋白 N－末端序列,该序列与炭疽芽胞杆菌的细胞表面S－层蛋白具92－93％相似性,根据Southern杂交制作了该晶体蛋白基因ctc所在位置的限制性酶切图谱,分别克隆了该基因5’和3’端所在2．9kb XbaI片段和3．1kb Cla I DNA片段,彼此间具0．6kb重叠,通过拼接获得含完整ctc基因的克隆,含该基因的大肠杆菌与表达S－层蛋白的大肠杆菌具相似生长特征,初步表明CTC菌株的伴胞晶体由细胞表面S－层蛋白组成,苏云金芽胞杆菌区别于蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌的唯一标准是能形成伴胞晶体,由于S－层是细胞表面的结构成分,本文对CTC菌株鉴定为苏云金芽胞杆菌以及伴胞晶体作为苏云金芽胞杆菌鉴别的唯一标准提出了质疑。     

利用PCR技术直接鉴定苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因型的快速方法

根据PCR程序中热变性温度可使菌体裂解,释放出DNA的原理,利用苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白不同基因型的特异混合引物,对苏云金芽孢杆菌营养体直接进行PCR分析。根据不同基因型的特异扩增产物片段的分子量大小便可直接确定该苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的基因型。本文对本室筛选天然菌株和苏云金芽孢杆菌克隆菌株分别进行了cryl基因的PCR分析。表明,该法结果可靠快速易行,在方法学上,为苏云金芽孢杆菌菌株鉴定、新菌株的筛选和基因型分析提供了极大的方便。     

A54外毒素与Bt毒蛋白对棉铃虫的交互作用

研究测定了A5 4胞外毒素与Bt毒蛋白对棉铃虫的交互作用。结果发现随着棉铃虫饲料中A5 4外毒素浓度的增加 ,棉铃虫幼虫的死亡率显著上升 :随着棉铃虫饲料中Bt毒蛋白浓度的增加 ,棉铃虫幼虫的死亡率也显著上升。方差分析的结果表明二者互有增效作用。     

Bt毒素蛋白基因的PCR鉴定及定位

利用合成的cryI、cryIII和cryV基因专一性引物 ,检测了从土壤中分离到的 56株苏云金芽孢杆菌菌株所含的晶体毒素蛋白基因。含有cryI基因的有 7株 ,含有cryIII基因的有 2株 ,同时含有cryI和cryV基因的有 2 1株。斑点杂交及Southern杂交分析表明 ,cryV基因定位于 1 50MD的大质粒上。     

含二元毒素基因的苏云金杆菌重组子晶体蛋白分析及其对蚊幼虫的毒性

通过电转化方法将含球形芽孢杆菌（Bacillussphaericus简称B.s)二元毒素基因的重组质粒pCW2转化野生型苏云金杆菌以色列亚种（B．thuringiensissubsp.israelensis简称B．t．i）,获得一株含二元毒素基因的重组菌株B＋CW-1。重组菌株能表达二元毒素及δ-内毒素和CytA毒素,并形成2类位于芽孢孢外膜外的伴孢晶体。B＋CW-1对伊蚊（Aedes）、按蚊（Anopheles）和抗性库蚊（Culex）的毒力明显高于B．s,同时也略高产B.t.i菌株,但其杀蚊谱和杀活性水平同B．t．i相似。未发现二元毒素同B．t．i毒素间的协同作用。     

Bt杀虫基因与Bt转基因抗虫植物研究进展

苏云金杆菌是一类非常重要的昆虫病原体,它能产生特异性的杀虫结晶蛋白,对农业上和生物医学上的许多有害的昆虫有毒杀作用,这些害虫包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、螨类和线虫。近三十年来,以苏云金杆菌为基础的生物杀虫剂已在世界范围内商业化用于防治重要经济作物的害虫。近年来有关Ｂｔ基因的遗传、分子生物学和基因工程已取得显著进展。本文对苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类和杀虫机理及用该类基因构建的工程转基因植物研究状况作一简要综述,同时对Ｂｔ基因工程存在的潜在问题和解决途径作了简单的探讨。     

苏云金芽孢杆菌cry1基因在荧光假单胞菌Pfx-18中的表达特性

用DIG标记的cry1Aa基因EcoRI-F片段的RNA探针,对筛选的鳞翅目高毒力菌株的质粒进行Southern分析,将cry基因定位在39．3MD质粒上。该质粒经HindⅢ酶解,用同样探针进行杂交,呈现6．5kb和7．1kb两条阳性带,其中7．1kb片段的杂交强度明显高于6．5kb片段。将7．1kb片段与多寄主质粒pSUP106连接,转化荧光假单胞菌Pfx－18,获得克隆子LZP-1。克隆基因用PCR鉴定,显示典型的cry1Ab谱带。经SDS-PAGE分析,克隆株表达66kD杀虫晶体蛋白和一些小分子多肽。其发酵液稀释1000倍对三龄小菜蛾幼虫的致死率为33％。