碱性纤维素酶革兰氏阴性菌株筛选及酶学性质研究

用CMC平板筛选方法,从造纸厂碱性淤泥中获得透明圈直径大于30mm的产碱性纤维素酶革兰氏阴性菌H8005。液体摇瓶培养产生碱性CMC酶活力高达4．2IU／mL。酶学性质初步研究显示,H8005产生的CMC酶反应的pH值以8．0左右为适;在碱性条件下具有较高的酶活和一定的稳定性;反应温度以55℃左右为宜;且具有较好的温度稳定性。Mn^2＋与Fe^3＋对酶反应有促进作用,Cu^2＋和Pb^2＋对酶反应有抑制作用。该菌产生的纤维素酶在棉织品的水洗整理及洗涤剂工业中具有非常良好的应用前景。     

产低温纤维素酶放线菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究

从青藏高原采集的牦牛粪中,经过CMC平板分离得到一株产低温纤维素酶能力较强的放菌Tibet-YD5227-2,经16S rDNA序列比对分析将其初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces sp.),目前尚无链霉菌产低温纤维素酶的研究报道。Tibet-YD5227-2液体摇瓶培养产生低温CMC酶活力高达145U/mL,最适产酶温度25℃,最适产酶pH值为8.0。酶学性质初步研究显示,Tibet-YD5227-2产生的CMC酶反应温度以35℃左右为适,反应的pH值以8.0左右为适,该菌株所产的纤维素酶在中碱性条件具有较强的稳定性;K+、Fe2+、Mg2+对酶反应有促进作用,Hg2+、Cu2+对酶反应有抑制作用。     

芽孢杆菌O74碱性纤维素酶的纯化和性质研究

对芽孢杆菌(Bacillus)O74菌株产生的纤维素酶经过Sephadex G-100,DEAE-Sephadex A-25和疏水相互作用Agarose 4B三种层析方法,分离纯化到一个仅具有内切β-葡聚糖酶(CMC酶)活性的纯组分.提纯后酶的比活力提高了27.9倍,总回收率为40%.分子量和等电位点分别为52 500和4.1.酶在pH4-12范围内均具有较高活性.其最适反应温度为50℃,最适反应pH为7.0,属于反应pH范围较广泛的耐碱性纤维素酶.除Hg⁺,Ag⁺,Zn²⁺和Cu²⁺等少数离子及少数表面活性剂、助剂对酶活性有一定影响外,酶活性相当稳定,符合洗涤剂用酶的条件.     

产中性纤维素酶耐碱芽孢杆菌的筛选及酶学性质研究

采用CMC碱性平板筛选方法,从造纸厂碱性淤泥中获得产中性纤维素酶的耐碱枯草芽孢杆菌C3004。根据其形态特征、生理生化特性和16S rRNA序列分析鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌,并命名为Bacillus subtilis C3004。液体摇瓶培养24 h产生CMC酶活力达46.6 U/mL。酶学性质初步研究显示,CMC酶反应的pH值以7.0左右为适;在弱酸和碱性条件下也具有较高的酶活和一定的稳定性;反应温度以50℃左右为宜;且具有较好的热稳定性。Mn~(2+)与Fe~(3+)对酶反应有促进作用,Cu~(2+)、Mg~(2+)和Zn~(2+)对酶反应有抑制作用。该菌可在碱性(pH 8.5～10)条件下培养,具有不易被杂菌污染的特点。     

碱性蛋白酶工程菌发酵条件及重组酶的纯化和性质的研究

在5L发酵罐中对重组碱性蛋白酶工程菌株BP071高产碱性蛋白酶的条件进行了研究,通过提高通气量和改变搅拌转速,BP071可在发酵40 h内达到产酶高峰,酶活力最高可达24480 u/mL。利用快速蛋白液相层析（FPLC）技术,建立了快速高效纯化碱性蛋白酶的方案。发酵液通过硫酸铵沉淀、DEAE-A-50脱色及聚乙二醇浓缩得粗酶,再经过CM-Sephadex-C-50、Sephadex-G-75柱层析后得到了单一组份的重组碱性蛋白酶,酶纯度提高了76.2倍。SDS-PAGE显示重组碱性蛋白酶分子量为28 kD。酶学性质研究表明,酶的最适作用pH为11,最适作用温度为60℃,具有良好的pH稳定性和热稳定性。Ca²⁺、Mg²⁺对酶的稳定性有促进作用,Hg²⁺、Ag⁺、PMFS和DFP能强烈抑制酶的活力。SDS和Urea对酶的活力无影响。     

海藻糖酶产生菌的选育、鉴定及其酶学特性初探

海藻糖酶可特异性将1分子海藻糖分解为2分子葡萄糖,在乙醇工业、食品等行业中具有广阔的应用前景。从环境土壤中筛选到1株海藻糖酶产生菌C2,根据形态学分析和分子生物学鉴定将其命名为大黄欧文氏菌（Erwinia rhapontici）。该菌株产海藻糖酶的最适温度为40 ℃,最适pH为5.0,在酸性及低于35 ℃条件下,该酶具有较高的稳定性,Ca²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、K⁺、Na⁺和Fe²⁺对海藻糖酶酶活具有促进作用,DMSO和DTT对酶活具有一定的提升作用,而Triton X-114、SDS和PMSF则对酶活具有抑制作用。     

嗜热脂肪芽孢杆菌β-半乳糖苷酶的性质

利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析 (DEAE- 2 2 )、Sephadex G- 75凝胶过滤从嗜热脂肪芽孢杆菌胞内提纯得到 β-半乳糖苷酶。研究表明 ,该酶最适表观反应温度和最适 pH分别为 6 0℃和 6 .4。在 50℃该酶具有良好的热稳定性。碱金属和碱土金属盐对酶有激活作用 ,重金属 Zn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺抑制酶的活力。巯基保护剂能明显增强酶的活力 ,而巯基结合试剂强烈抑制酶的活性。该酶对 β-     

豆乳凝固酶产生菌UV-10发酵条件及其酶学性质的研究

豆乳凝固酶产生菌Bacillussp .UV 1 0的最适产酶条件 :初始pH6 4,温度 2 6℃ ,培养时间 1 9h ,需要较大的通气量。酶的最适作用pH和温度分别为 5 8和 70℃。在最适条件下酶活力可达 1 84u/mL。pH6 0～ 7 0稳定性较好。 6 0℃下 1h残余酶活 6 0 %。Ca²⁺,Fe²⁺,Mg²⁺,Na⁺对其有较强的激活作用 ,而Zn²⁺,Al相似文献   

木霉GXC产β-葡聚糖酶条件和酶学性质

研究了木霉GXC产 β 葡聚糖酶的条件。结果表明 ,最适产酶碳源为麸皮 ,氮源为硫酸铵 ;产酶的最适条件为 :初始pH为 4 0～ 5 0 ,30℃培养 44h。粗酶液经硫酸铵沉淀、SephadexG 2 5、SephadexG 1 0 0和DEAE SephadexA 50柱层析得到纯β 葡聚糖酶 ,SDS PAGE凝胶电泳显示一条带 ,测得分子量为 35kD。该酶最适反应pH5 0 ,最适反应温度为 60℃ ,在 40℃以下、pH4 0～ 5 0酶活力相对稳定。 5 0mmol L以下的Ca²⁺、Zn²⁺和Fe²⁺,以及 1 0 0mmol L以下的Co²⁺对酶活力有激活作用 ;而Cu²⁺和Fe³⁺具有抑制作用。     

金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶的研究

以磁性金属螯合琼脂糖微球为载体,利用金属螯合配体（IDACu²⁺）与蛋白质表面供电子氨基酸相互作用的原理,定向固定了木瓜蛋白酶。固定化最适条件为Cu²⁺1.5×10^-2mol/g载体、固定化时间4h、固定化pH7.0、给酶量30mg/g载体。固定化酶的最适反应温度70℃、最适反应pH8.0,固定化酶的热稳定性明显高于溶液酶,固定化酶活力回收为68.4％,且有较好的操作稳定性,载体重复使用5次后固定化酶酶活为首次固定化酶79.71%。     

Arthrobacter K1108乙内酰脲酶反应条件和立体选择性研究

研究了ArthrobacterK110 8乙内酰脲酶的反应条件 ,结果表明 ,K1108乙内酰脲酶的最适反应温度为 55℃ ,最适pH为 70 ,Co²⁺ 和Fe²⁺ 对该酶有激活作用 ,而Ca²⁺ 有严重抑制作用。K1108乙内酰脲酶的底物专一性较强 ,其最适底物为 5 苄基乙内酰脲 ,5 苯基乙内酰脲和 5 吲哚甲基乙内酰脲均不能作为其有效底物。对K1108乙内酰脲酶立体反应机制研究结果表明 ,其乙内酰脲水解酶不具立体选择性 ,决定产物立体构型的酶是N 氨甲酰氨基酸水解酶。     

兔肌3-磷酸甘油脱氢酶的提纯及性质研究

目的:研究兔肌3-磷酸甘油脱氢酶的分离纯化方法及其酶学性质,为测定血清甘油三酯所用酶联试剂的开发提供试验基础和理论依据。方法:通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose、Blue-Sepharose和羟磷灰石纯化兔肌3-磷酸甘油脱氢酶,利用凝胶过滤和梯度PAGE(5%～15%)法测定酶分子量,采用常规酶学动力学分析方法,考察pH、温度、底物浓度以及部分金属离子与有机化合物对酶促反应的影响。结果 纯化后的兔肌3-磷酸甘油脱氢酶经PAGE(12%)分析为单一条带;酶分子量为115～122 kDa;酶最适温度45℃,最适pH 9;酸碱稳定范围pH6～9,低于45℃时热稳定性好;最适条件下,以3-磷酸甘油和NAD⁺为底物,测得酶的K_m分别为7.4×10^-3mol/L和1.47×10^-4mol/L;Ba²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Ag⁺、Hg²⁺、NaN₃、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Mg²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Zn²⁺有一定程度的激活作用,其中Co²⁺和Zn²⁺对酶的激活作用能达到200%以上,有机化合物NaF对酶的活性没有影响。     

嗜碱细菌环状糊精葡糖基转移酶的纯化和性质

嗜碱细菌52—2除去菌体的培养液经硫酸铵沉淀和DEAE－纤维素离子交换柱层析,得到凝胶电泳均一的环状糊精葡糖基转移酶,纯化了11.5倍,酶活力回收为5.7％。用浓度梯度PAGE测分子量为151700。酶反应最适温度为65℃,50℃以下比较稳定。酶反应最适pH为7．0,在6．0～9.0范围内稳定。Zn²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Ag⁺和Fe²⁺强烈抑制酶活力。紫外光谱在270nm和244nm处分别有最大和最小吸收。荧光光谱的最大激发波长和发射波长分别为283nm和335nm。用NBS、NEM、NAI、DEP和EDC对酶进行了化学修饰,初步推测组氨酸和色氨酸残基可能为酶活力必需基因,羧基与酶活力有一定关系。     

氧化铝为载体的固定化葡萄糖异构酶某些性质的研究

本文报道了以廉价的大孔氧化铝作为葡萄糖异构酶的固定化载体。该固定化酶的热稳定性是60—70℃,如高于70℃就开始失活。最适Ph和温度分别为7．2—8．0和70℃。Gu²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和Ba²⁺等金属离子对它的酶活有抑制作用,Co²⁺和Mg²⁺金属离子却有明显的激活作用。该固定化酶酶活是6000—7000μ／g。通过柱运转,它的半衰期为40天以上,转化率是葡萄糖异构为果糖理论值的80一85％。     

极端嗜热菌Thermus thermophilus HB8中天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

为获得具有热稳定性的天冬氨酸转氨酶,从极端嗜热细菌Thermus thermophilus HB8中克隆得到天冬氨酸转氨酶基因aspC,并在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中进行表达,发现在Rosetta(DE3)中具有较高的表达量。重组酶的最适反应pH是7.0,37 ℃下在pH8～10的缓冲液中保温1 h酶活几乎不改变。重组酶反应的最适温度为75 ℃,酶活稳定的温度范围为25～55℃。重组酶在65℃时半衰期为3.5h,75℃时为2.5h。重组酶的K_m^KG为7.559mmol/L,V_max^KG为0.086mmol/(L·min),K_m^Asp为2.031mmol/L,V_max^Asp为0.024mmol/(L·min)。Ca²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺等金属离子对酶活性有微弱抑制作用。     

极端嗜热菌Thermus thermophilus HB8中天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

为获得具有热稳定性的天冬氨酸转氨酶,从极端嗜热细菌Thermus thermophilus HB8中克隆得到天冬氨酸转氨酶基因aspC,并在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中进行表达,发现在Rosetta(DE3)中具有较高的表达量。重组酶的最适反应pH是7.0,37 ℃下在pH8～10的缓冲液中保温1 h酶活几乎不改变。重组酶反应的最适温度为75 ℃,酶活稳定的温度范围为25～55℃。重组酶在65℃时半衰期为3.5h,75℃时为2.5h。重组酶的K_m^KG为7.559mmol/L,V_max^KG为0.086mmol/(L·min),K_m^Asp为2.031mmol/L,V_max^Asp为0.024mmol/(L·min)。Ca²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺等金属离子对酶活性有微弱抑制作用。     

AMP对蛇肌果糖-1,6-二磷酸酯酶pH9.2活力的激活作用——蛋白水解酶限制性酶解作用不是果糖-1,6-二磷酸酯酶变成碱性酶的唯一原因

低纯度的NADP⁺ 中含有一种在pH 9.2能够激活蛇肌果糖- 1 ,6 -二磷酸酯酶活力的物质 .经过分离鉴定 ,证明它就是 5′- AMP .该激活作用只有当较高浓度的Mg ²⁺ 存在时才表现出来 .在AMP的存在下 ,果糖 -1 ,6 -二磷酸酯酶的行为很像碱性酶 .Mg ²⁺ 激活动力学表明 ,AMP和Mg ²⁺ 在对蛇肌酶活力调节上存在着竞争关系 .AMP能解除高浓度Mg ²⁺对酶在碱性pH活力的抑制作用 .以往认为果糖- 1 ,6 -二磷酸酯酶由中性酶变成碱性酶均是由蛋白水解酶限制性酶解引起的 ;现报道 5′- AMP也能将蛇肌酶变成碱性酶 ,指出蛋白水解酶限制性酶解作用不是造成该酶由中性酶变为碱性酶的唯一原因 ,并且也可能有生理调节作用 .     

嗜热脂肪芽孢杆菌耐热木糖异构酶的特性

嗜热脂肪芽抱杆菌在木糖或木聚糖诱导下产生木糖异构酶。从破碎细胞中分离到该酶。经硫酸铵沉淀,热处理及SephadexG-200柱层析等步骤获得纯化了19倍的酶制备物。该酶反应的最适pH值为7.5,在pH6．2～8．0范围内稳定,最适反应温度为80℃,低于此温度时酶有很好稳定性。该酶对底物木糖的Km值为6．67mmol／L,Mg₂₊、Co₂₊和Mn₂₊对该酶有激活作用,而Zn₂₊、Cu₂₊和Fe相似文献   

一株海洋来源铜绿假单胞菌Gxun-7角蛋白酶基因的克隆、表达及重组酶酶学性质

【背景】角蛋白酶是一类特异性降解角蛋白的水解酶,在动物饲料、生物肥料、医学、洗涤、制革及环境治理等方面具有重要的应用潜力。【目的】对前期从海洋环境筛选出的一株铜绿假单胞菌Gxun-7的角蛋白酶基因进行克隆、表达,并探究重组酶酶学性质,为角蛋白酶在工业生产中的应用奠定基础。【方法】以铜绿假单胞菌Gxun-7基因组推定的角蛋白酶基因为基础,设计引物克隆获得角蛋白酶基因kp2,构建重组表达质粒pET22b-kp2,并转化到E. coliRosettagamiB (DE3)中进行诱导表达,同时对重组表达菌株的表达条件进行优化。利用镍柱分离纯化重组角蛋白酶并研究其酶学性质。【结果】重组角蛋白酶的分子量约为33 kDa,最适温度和pH值分别为40 ℃和8.0,在温度30-60 ℃和pH 6.5-8.0具有较好的稳定性。金属离子Co²⁺、Cu²⁺和化学试剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfonate,SDS)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)对酶活力有抑制作用,而Mg²⁺、K⁺、巯基乙醇和二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)对酶活力有促进作用。重组角蛋白酶具有良好的耐盐性,在12.5%的NaCl作用下相对酶活为87.55%。以酪蛋白为底物时,酶的K_m值为60.92 mg/mL、V_max值为9.70 U/mL。【结论】海洋来源铜绿假单胞菌Gxun-7的重组角蛋白酶具有良好的温度、碱、盐稳定性,可应用于工业生产中。     

多形拟杆菌肝素酶I的SUMO融合表达及酶学特性分析

[目的]克隆多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）Heparinase I基因,在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行基因工程表达获得重组酶SUMO-Bt-HepI和Bt-HepI,并研究其酶学特性。[方法]对B.thetaiotaomicron肝素酶I（Bt-HepI）的基因序列进行密码子优化,PCR扩增得到目的基因,构建表达载体pET-28a-Bt-HepI和pE-SUMO-Bt-HepI,并转化至E. coli Rosetta（DE3）进行表达,分别得到重组产物Bt-HepI和SUMO-Bt-HepI,以肝素钠为底物研究两者的酶学性质。[结果]SDS-PAGE检测显示Bt-HepI和SUMO-Bt-HepI的分子量大小分别约为42.5 kDa和55 kDa。与Bt-HepI相比,融合SUMO-Tag后的肝素酶I比酶活提高了48.9%。酶学性质表明：Bt-HepI和SUMO-Bt-HepI的最适pH和温度均为pH 9、45℃,二者在pH 5-9都具有很好的稳定性,但pH<5时,SUMO-Bt-HepI的耐酸性明显高于Bt-HepI。同时,在温度低于50℃时,SUMO-Bt-HepI的比酶活高于Bt-HepI。此外,Ca²⁺和Mg²⁺对重组肝素酶I具有明显的促进作用,而Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺则表现出一定的抑制作用,提示在多形拟杆菌肝素酶I的结构中除了存在已知的Ca²⁺结合位点外,可能还存在Mg²⁺的结合位点。[结论]本研究首次将多形拟杆菌来源的肝素酶I和SUMO-Tag进行了融合表达,使其比酶活得到了显著的提高,为其生产应用奠定了基础。