乙型肝炎病毒DNA在患者血清及肝组织中存在状态的研究

对29例肝炎,1例尸检肝组织和血清中乙型肝炎病毒的DNA(HBV DNA)进行了研究,发现HBsAg( )/HBeAg( )患者中,有9/17(52.94％)血清HBV DNA阳性;HBsAg( )/抗-HBe( )患者中,2/6(33.33％)也为阳性。从30例肝组织中提取DNA经琼脂糖电泳,Southern吸印转移及分子杂交试验结果表明,27例HBV DNA阳性,全部有游离型HBV DNA。27例中有5例经用标记pBR322探针杂交排除非特异杂交带后,在高分子量区有HBV DNA特异的杂交带,提示有HBV DNA整合。     

乙型肝炎病毒DNA疫苗的研究进展

预防与控制乙型肝炎发病的乙型肝炎病毒(HBV)疫苗,是有重大的社会和经济意义。HBV的持续感染可引起慢性肝脏疾患,并逐步发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC)。目前的乙肝重组亚单位疫苗可以使90％的接种产生保护性抗体;但是对慢性HBV携带,由于其机体对HBsAg蛋白产生耐受,不能产生体液和细胞免疫,因此它只能作为一种预防性的疫苗。DNA疫苗(基因疫苗)是一种新的疫苗技术,通过向体内递送编码抗原的细菌质粒,刺激产生特异的体液和细胞免疫反应。在小鼠和其他的肝炎病毒感染动物模型中,HBV DNA疫苗可以特异性地引起体液和细胞免疫,清除HBV转基因动物血循环中的HBsAg颗粒和HBV DNA。如果加入各种免疫调节细胞因子的基因,可以进一步提高HBV DNA疫苗的免疫效果,因此它不仅可作为预防性疫苗,也可作为治疗型疫苗。     

肝病患者肝细胞内HBV DNA原位杂交研究——形态、分布及意义

应用生物素标记HBV DNA(乙肝病毒脱氧核糖核酸)作探针,对129例肝病患者肝组织作原位杂交研究。发现HBV DNA主要存在肝细胞浆内,可分为胞浆致密型、疏松型和包涵体型。HBV DNA阳性肝细胞在肝实质中分为三种型:小叶型、局灶型与散在点状分布。HBV DNA在慢性活动型肝炎中检出率最高(81％),显著高于肝硬化,慢性小叶型肝炎、急性肝炎及原发性肝癌组。乙肝复制指标阳性患者肝细胞内HBV DNA检出率明显高于非复制组;并观察到HBV DNA阳性肝细胞与肝细胞坏死灶关系密切,多数紧紧毗邻肝细胞坏死灶/或和位于坏死灶中间,尤以局灶型分布的HBV DNA阳性肝细胞为显著。     

从乙型肝炎病毒表面抗原阳性母亲流产的胎儿查出乙型肝炎病毒标志

应用Southern blot杂交试验检测HBsAg及HBeAg均阳性母亲流产的9例胎儿肝细胞中HBV DNA的存在状态,并与其HBV血清学、免疫电镜及肝脏免疫组织化学的结果相比较。结果在3例胎肝高分子DNA中检出了整合的HBV DNA顺序,且此3例HBV DNA整合到胎肝细胞基因组并无特定部位,提示为随机整合。3例中2例的血清及肝匀浆都检出HBsAg颗粒,其胎肝细胞胞浆HBsAg也阳性;另1例受HBV感染的唯一标志是在胎肝细胞中存在着整合的HBVDNA。此外,另1例则仅胎肝细胞中HBsAg阳性而无整合的HBV DNA。在胎肝细胞中检出整合的HBV DNA进一步证实HBV子宫内传播途径的存在。     

电转联合热休克蛋白佐剂疫苗引发抗HBV的免疫应答

针对HBV感染的治疗性DNA疫苗虽然具有很好的应用前景,但目前抗病毒效果并不高,表明在病毒长期感染过程中存在免疫抑制机制。以HBV的表面蛋白(HBsAg)和核心蛋白(HBcAg)为DNA疫苗抗原,采用gp96和HSP70作为佐剂联合电转以提高疫苗的活性。将gp96为佐剂的HBsAg/HBcAg DNA疫苗免疫HBV转基因鼠后引发抗原特异性的细胞免疫和体液免疫应答。使用gp96和HSP70佐剂引起Treg下调20%。与没有免疫的小鼠相比,以gp96和HSP70为佐剂的DNA疫苗显著降低血清中病毒S抗原水平和DNA拷贝数,大幅降低小鼠肝脏中HBc的表达。该研究为设计以gp96为佐剂的乙肝治疗性DNA疫苗提供了依据。     

基于微滴数字PCR技术建立单细胞水平研究HBV的方法

在单细胞水平研究肝组织内乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是十分重要的,但相关研究技术尚处于推进阶段,不能满足临床需要。基于微滴数字聚合酶链反应技术(digital droplet polymerase chain reaction, ddPCR),本研究建立了一套单细胞水平绝对定量HBV DNA和RNA的单细胞微滴数字PCR方法(single-cell ddPCR, sc-ddPCR)。通过混合不同比例的HBV阳性和阴性细胞来模拟HBV慢性感染状态下的肝脏,分析此方法检测HBV DNA的线性和检测下限。以cccDNA来源RNA(episome-derived RNA, eRNA)为例,进一步设计针对eRNA的sc-ddPCR检测方案。利用不同来源转录本在结构上的差异,设计针对eRNA的特异性引物探针体系,在HBV肝癌细胞系中验证此引物和探针体系的特异度,并利用梯度稀释的HBV细胞株分析此方法检测eRNA的线性和检测下限。结果显示,本研究建立了基于ddPCR的DNA和RNA的单细胞水平检测方法,该方法表现出良好的线性(HBV DNA:R²...     

检测低拷贝数HBV DNA含量的临床研究

目的:了解不同试剂在应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)以及巢式PCR方法在检测低拷贝数的HBV DNA量的差异与灵敏度。方法:用上海复星医学科技发展有限公司(A方法)检测出了68例HBV DNA结果为5.1×101-1.0×103拷贝数/亳升的低拷贝数标本。然后,三家不同公司的试剂(方法 B、方法 C、方法 D)对这些样本进行复核。另外,巢式聚合酶链反应PCR法检测此68例标本。随访巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA的病人。结果:用四种方法(A、B、C、D)检测的68个样本的HBV DNA拷贝数结果如下:无拷贝(0,9,12,4);101-102(21,17,18,22);102-103(47,36,28,35),大于103(0,6,10,7)。同时,用巢式聚合酶链反应检测此68例标本,有55例检测为阳性,有13为阴性结果。巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA含量的病人,随访发现此10病人有8例均在1~3月后出现HBV DNA的反跳,并伴肝功能的不正常,其HBV DNA的含量均在104拷贝数/毫升以上。结论:目前所用的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)的方法和试剂对低拷贝数HBV DNA存在不稳定性和不确定性。巢式PCR法对低拷贝数HBV DNA的检测灵敏度要远高于实时荧光定量PCR法。该研究提示测对抗病毒治疗过程中患者进行低拷贝数HBV DNA的检将提供有效的药物评价和预后信息。     

检测低拷贝数HBVDNA含量的临床研究

目的:了解不同试剂在应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)以及巢式PCR方法在检测低拷贝数的HBV DNA量的差异与灵敏度.方法:用上海复星医学科技发展有限公司(A方法)检测出了68例HBV DNA结果为5.1× 101-1.0× 103拷贝数/毫升的低拷贝数标本.然后,三家不同公司的试剂(方法B、方法C、方法D)对这些样本进行复核.另外,巢式聚合酶链反应PCR法检测此68例标本.随访巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA的病人.结果:用四种方法(A、B、C、D)检测的68个样本的HBV DNA拷贝数结果如下:无拷贝(0,9,12,4);101-102 (21,17,18,22);102-103(47,36,28,35),大于103(0,6,10,7).同时,用巢式聚合酶链反应检测此68例标本,有55例检测为阳性,有13为阴性结果.巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA含量的病人,随访发现此10病人有8例均在1～3月后出现HBV DNA的反跳,并伴肝功能的不正常,其HBV DNA的含量均在104拷贝数/毫升以上.结论:目前所用的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)的方法和试剂对低拷贝数HBV DNA存在不稳定性和不确定性.巢式PCR法对低拷贝数HBV DNA的检测灵敏度要远高于实时荧光定量PCR法.该研究提示测对抗病毒治疗过程中患者进行低拷贝数HBV DNA的检将提供有效的药物评价和预后信息.     

13039例乙型肝炎患者血清HBV DNA水平流行病学分析

目的了解本地区近四年乙型肝炎患者HBV DNA阳性率与病毒载量分布特点。方法采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测2012年至2015年间13 039例HBsAg阳性患者HBV DNA载量,并进一步分析24例HBeAg阳性、31例HBeAg阴性初诊乙肝患者4年间接受正规治疗后HBV DNA变化趋势。结果本地区近4年间血清HBV DNA阳性率依次为48.6%、46.18%、38.69%、37.66%,呈逐年下降趋势,差异具有统计学意义(P0.01);各年度病毒载量均值的对数值分别为(5.48±1.56),(5.27±1.72),(5.29±1.68),(5.35±1.85)拷贝/mL。2013年、2014年、2015年分别与2012年相比,差异均有统计学意义(P0.01、P0.01、P0.05),而低病毒载量(即病毒拷贝数的对数值小于5拷贝/mL)患者比例2012年明显大于其他年份,2012年分别与2013年、2014年、2015年相比,差异具有统计学意义(P0.01,P0.01,P0.05);HBeAg阳性/阴性乙肝患者接受正规治疗后,其HBV DNA载量均呈逐年下降趋势,其中第一年下降显著(P0.01)。结论近4年本地区血清HBV DNA阳性率呈逐年下降趋势,且低病毒载量比例明显增加。     

乙型肝炎病毒e抗原定量检测的性能验证和临床应用探索

乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)的定量检测对乙型肝炎临床诊疗具有一定的重要性,但其定量检测还未成为常规检验项目。本研究对HBeAg定量检测系统进行性能验证,比较HBeAg定量和定性检测的相关性和一致性,分析HBeAg定量结果和乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus DNA, HBV DNA)的关系,为HBeAg定量检测在临床诊疗的应用提供依据。通过收集710例2019年3月至5月于复旦大学附属华山医院就诊的慢性乙型肝炎患者血清样本,参照美国临床实验室标准化协会(The Clinical & Laboratory Standards Institute, CLSI)相关文件的要求,对雅培ARCHITECTi4000SR全自动免疫分析仪检测的HBeAg定量试剂的精密度、分析灵敏度、线性范围/可报告范围、携带污染率进行验证和评价;采用化学发光微粒子免疫检测技术(chemiluminescence microparticle immuno assay, CMIA)对618例患者进行HBeAg定性和定量检测;采用荧光定量PCR对慢性乙型肝炎患者进行HBV DNA检测,比较HBV DNA和HBeAg定量结果的相关性。本研究证实HBeAg定量试剂检测性能验证结果良好;HBeAg定量和定性检测相关性良好;126例同时有HBeAg定量检测和HBV DNA定量检测的结果显示,两种方法呈正相关且一致性良好。HBeAg定量检测可用于常规实验室检测来辅助HBV感染的临床诊疗。     

SIRT3激动剂对乙肝病毒转录和复制的影响

该文探讨了SIRT3激动剂(Honokiol,HKL)对乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)转录和复制的影响。培养HepG2-NTCP和人原代肝细胞(primary human hepatocytes,PHH),感染HBV颗粒后,用Honokiol(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)处理细胞后继续培养10天,通过荧光定量PCR检测细胞内HBV DNA、cccDNA和HBV RNAs水平,Southern blot实验进一步检测胞内HBV DNA水平。构建SIRT3-KO细胞,检测敲除SIRT3后,Honokiol对细胞内HBV DNA、cccDNA和HBV RNAs的影响。通过小鼠尾静脉高压注射pCMV-KRAB-Cre质粒和precccDNA质粒构建持续感染小鼠模型,一周后腹腔注射Honokiol持续20天。荧光定量PCR检测小鼠血清中HBV DNA拷贝数,肝组织内HBV DNA、cccDNA和HBV RNAs水平。结果表明,Honokiol浓度依赖性地抑制HepG2-NTCP和PHH细胞内HBV DNA以及HBV RNAs水平,此外,Honokiol可以降低cccDNA的转录活性;敲除SIRT3后,Honokiol不能发挥抗病毒作用;小鼠模型中,Honokiol能够降低血清中HBV DNA和肝组织内HBV DNA拷贝数,以及能够显著抑制肝组织内HBV RNAs水平和cccDNA的转录活性。该研究结果表明,Honokiol能够抑制乙肝病毒转录和复制。     

自然人群乙型肝炎病毒慢性感染者HBV DNA的流行病学分析

目的了解寿光市自然人群乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染者HBV DNA的流行病学特征,为乙型肝炎的防治提供依据。方法采集2012年寿光市3个镇街道居民体检发现的HBs Ag阳性者静脉血5 m L,以实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测血清HBV DNA载量,分析HBV DNA与性别、年龄、有无乙肝/肝癌家族史、密切接触史、输血史等因素的相关性。结果在2 026例HBs Ag阳性感染者中,HBV DNA阳性率为49.41%(1 001/2 026),HBV DNA载量的平均值为6.27×107拷贝/m L。其中男性HBV DNA阳性率为53.28%(585/1 098),女性为44.83%(416/928),差异有统计学意义(χ2=14.370,P<0.01);HBV DNA均值男性为(6.72×107±2.07×108)拷贝/m L,女性为(5.56×107±1.44×108)拷贝/m L,差异无统计学意义(t=0.447,P>0.05)。HBVDNA阳性率与年龄呈负相关(r=-0.983),与HBV感染的主要影响因素乙肝/肝癌家族史、密切接触史、输血史等均无关。结论 HBV DNA阳性率与慢性HBV感染者的性别、年龄有关,与HBV感染的主要影响因素无关。     

三链DNA的形成抑制DNA结合蛋白与启动子的结合

电泳迁移分析方法及DNaseⅠ足迹实验表明21nt脱氧寡核苷酸G3TG2T GT2G5TG2TGT(CP1)与乙肝病毒(HBV)核心启动子(Cp)片段之间三链DNA的形成有较高的特异性及稳定性.凝胶滞留实验显示, 在大鼠肝细胞核提取物体外转录系统中, CP1可特异地抑制DNA结合蛋白与Cp片段的结合, 而不能与Cp结合形成三链DNA的脱氧寡核苷酸CP3(TGTG2TG5T2GTG2TG3)对蛋白与Cp的结合并无抑制作用.这些结果表明, 三链DNA的形成有可能抑制HBV DNA的转录.     

HBsAg定量检测在慢性乙型肝炎自然病程中的意义

目的 研究慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染自然病程中HBsAg水平变化情况以及和HBV DNA的关系.方法 将183名HBV感染者按感染的不同阶段分为免疫耐受期(IT)42例,免疫清除期(IC)46例,非/低水平复制期(LR)57例,和再活动期(HBeAg阴性肝炎组ENH)38例,回顾性分析每个阶段血清中HBsAg和HBV DNA水平以及两者之间的关系.结果 HBsAg含量分别为IT期最高[(3.81±0.46) Ig IU/mL],其次为IC期[(3.41±0.77) Ig IU/mL],最低是LR期[(2.87±0.61)Ig0.61IU/mL],每期之间HBsAg含量差异有统计学意义(P＜0.05),ENH组HBsAg含量又有所升高[(3.31 ±0.78)Ig IU/mL].IT期HBsAg与HBV DNA无相关(r=0.231,P＞0.05),IC期HBsAg与HBV DNA呈正相关(r=0.612,P＜0.05),ENH期两者无相关(r=0.189,P＞0.05);不同时期HBsAg含量与ALT均无相关性.结论 HBV感染的不同阶段HBsAg水平有差异,IT期最高,进入IC期后开始下降,在LR期降至最低,ENH期再度升高,HBsAg与HBV DNA仅在IC期有相关性,血清HBsAg的表达与不同的免疫背景有关.     

不同方法检测血清HBV DNA的比较研究

采用夹心斑点杂交法、PCR-EB定性及Amp-lisensor定量法对HBsAg与抗-HBs同时阳性、HBsAg阳性、抗-HBs阳性和HBsAg与抗-HBs均阴性的乙型肝炎病毒(HBV)感染者检测血清HBV DNA.结果三种方法的阳性率分别为29.1%、47.7%和80.2%;各组HBV DNA含量分别是106.13±1.86、106.08±1.82、104.12±1.40和105.07±1.21(拷贝/ml).结论是Amplisensor法检测HBV DNA具有更高的敏感性;抗-HBs阳性的HBV感染者血清中仍可检出HBV DNA.     

乙型肝炎病毒复制水平对原发性肝癌发病的影响

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)复制水平对原发性肝细胞肝癌(HCC)发病的影响.方法:调查226例HCC患者和51例乙型肝炎后肝硬化(LC)患者,分别应用ELISA法和聚合酶链式反应(PCR)检测血清乙型肝炎病毒标志物(HBV-M)和DNA含量.结果:HCC患者中HBsAg阳性率为96.9%;168例HCC患者和51乙型肝炎后LC患者接受HBV DNA定量检测.阳性率分别为85.1%、88.2%,两组患者lg HBV DNA均服从正态分布,HBV DNA的均数为105.49±1.49拷贝/ml、106.15±1.38拷贝/ml,乙型肝炎后LC组患者血清HBV DNA含量较高(P＜0.05);乙型肝炎后LC患者中HBeAg阳性率较HCC组高(P＜0.05);HCC患者血清HBVDNA含量与HBeAg阳性没有明显的相关性(P＞0.05),乙型肝炎后LC患者血清HBV DNA含量与HBeAg阳性密切相关(P＜0.05);两组患者血清HBV DNA含量与性别、年龄、感染HBV的时间等因素均无明显的相关性(均为P＞0.05).结论:我国HCC的发病与HBV感染密切相关,但可能与患者是否存在HBV高水平复制无关.     

乙型肝炎病毒共价键闭环DNA的表观遗传调控研究进展

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染仍然是威胁全球人类生命与健康的重要危险因素。虽然目前的抗病毒治疗药物在控制乙型肝炎进展有显著疗效,但却始终无法达到根治HBV感染的目标。HBV共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)是HBV转录复制的原始模板,也是HBV持续感染的关键因素。但由于缺少有效的完全清除HBV cccDNA的治疗方法,慢性乙型肝炎患者需长期服药以防治疗后停药复发。研究证实HBV cccDNA的转录受表观遗传机制调控,其中cccDNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA、染色质重塑等均影响HBV cccDNA的功能。本文就HBV表观遗传调控的最新研究进展进行综述。     

乙肝患者血清的HBV-DNA含量与ALT水平的关系研究

目的:探讨和研究乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)DNA复制水平与丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平之间的关系,为临床中乙肝患者的诊治提供参考。方法:对240例慢性乙型肝炎患者采用荧光标记定量PCR方法测定血清HBV-DNA含量,采用全自动生化分析仪测定血清ALT水平,比较和分析HBV-DNA含量与ALT水平之间的关系。结果:慢性乙肝轻、中、重度患者的HBV-DNA含量三组之间差异有统计学意义(p0.01),肝脏的损害程度与HBV-DNA含量之间具有一定的关联,等级相关系数为0.162(P=0.012);ALT水平也与HBV-DNA载量之间存在关联,等级相关系数为0.371(P0.0001)。结论:肝损伤程度与HBV-DNA含量有显著相关性;同时血清ALT水平与HBV-DNA含量呈正相关。检测血清中的HBV-DNA含量和ALT水平为指导乙肝患者HBV感染、复制、传染性的判断、治疗方案的选择和疗效评定提供有一定的依据。     

HBV阳性原发性肝癌的高危因素探讨

目的探讨HBV阳性原发性肝癌（HCC）与血清HBV-DNA水平、饮酒史及性别因素的关系。方法回顾性分析浙江大学医学院附属第一医院2005年1月至2007年7月住院的HBV阳性HCC401例和同期住院的慢乙肝（CHB）患者401例,采用以年龄为配比变量的1：1匹配的病例对照研究,将HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性分为大三阳组,HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性分为小三阳组。结果计量资料采用配对t检验,计数资料采用Pearson卡方检验,结果提示不管是大三阳组还是小三阳组,HBV DNA水平、饮酒史和性别均与HCC有关系;Logistic回归分析HBV DNA、饮酒史和性别与HCC的关系,同样提示HBV DNA水平、饮酒史和性别与HCC的发病有关系。结论HBV DNA水平、性别和饮酒史在HBV阳性的原发性肝癌的发生中占重要作用,对HBV DNA高水平的男性饮酒患者,更应建议戒酒并采取合适的抗病毒治疗方案,并加强监测随访,降低肝癌的发生率或及早发现肝癌。     

HBV耐药相关DNA突变体的构建及在寡核苷酸基因芯片分析中的应用

拉米呋啶（Lamivudine)是近年来开发成功的一种治疗HBV慢性感染病人的核苷类药物。随着拉米呋啶在临床上广泛使用,HBV耐药现象已成为临床实践中的棘手问题。建立HBV耐药测定技术成为HBV基础研究和临床实践中企待解决的一个重要问题。寡核苷酸芯片（Oligochip)是近年来发展并逐步成熟的一种高通量基因检测技术,已成功应用于基因突变快速和高通量检测。本研究在构建HBV拉米呋啶抗性相关HBV多聚酶基因突变体基础上,设计并制备了HBV耐药寡核苷酸芯片（HBV－Lam Oligochip)。根据HBV拉米呋啶抗药性相关突变主要位于HBV多聚酶基因的L526、A546、M550和V553等氨基酸位点,设计了28条寡核苷酸探针。探针对应序列为HBV DNA聚合酶基因反义链,HBVHBVhb长度为15－18nt。探针合成时在其3′端接氨基和间隔臂（spacer)等特定修饰;探针纯化与定量后,用基因芯片点样仪点到醛基修饰载玻片上,制成HBV耐药寡核苷酸芯片（HBV－Lam Oligochip)。为了分析基因芯片的性能,克隆了833号HBV病人血清中HBV DNA聚合酶基因,测序证实为HBV DNA野生型（即未发生突变）。以该DNA为模板,用PCR法构建了HBV耐药相关突变体。用HBV－Lam Oligochip对HBV野生型DNA和人工构建DNA突变体进行了检测。结果发现,HBV－Lam Oligochip能有效检测出野生型DNA序列。检测突变体时,HBV－Lam Oligochip检测结果与相应突变体DNA序列一致,表明HBV－Lam Oligochip不仅可检测出野生型序列,而且可有效地分辨出单碱基突变,可应用于HBV耐药基因突变临床检测。