八肋游仆虫胞质核糖体蛋白基因序列特征分析

为了探讨八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)核糖体蛋白基因的数目及其结构的特殊性, 研究通过生物信息学方法, 对八肋游仆虫胞质核糖体蛋白进行了系统的分析。共鉴定得到98个基因编码78种不同的胞质核糖体蛋白。其中19种胞质核糖体蛋白基因发生了复制, 尽管都是有功能的, 但其中一个基因的表达受到限制。通过与高等真核生物比较, 我们发现: 八肋游仆虫核糖体蛋白eS30缺失了N端的类泛素结构域, eL6缺失了N端的Ribosomal_L6e_N结构域。另外, 不同于其他高等真核生物, 八肋游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白uL10为碱性蛋白。研究为进一步探讨低等真核生物核糖体的组装及功能奠定了基础。     

八肋游仆虫微管蛋白基因家族的鉴定及进化分析

为了系统分析八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)微管蛋白基因家族,从八肋游仆虫大核基因组中共鉴定得到20个微管蛋白基因,基于同源比对及系统进化分析,将其归入α、β、γ、δ、ε及η六个微管蛋白亚家族;多序列比对及Western blot结果显示八肋游仆虫η微管蛋白基因在翻译过程中需发生一次+1位编程性核糖体移码,其移码位点为AAA-TAA;所有自由生纤毛虫都含有多个α和β微管蛋白基因亚型,可能用于组成不同的微管结构。研究为后续深入探讨八肋游仆虫微管蛋白的生物学功能及微管多样性奠定了基础。     

八肋游仆虫含绿色荧光蛋白基因的大核人工染色体的构建

为研究八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)相关基因的功能,构建了八肋游仆虫大核人工染色体(macronuclear artificial chromosome of E. octocarinatus,EoMAC-G),其两端为克隆自八肋游仆虫大核β2-微管蛋白基因的5′和3′非编码区和两侧的端粒序列,中间为多克隆位点和密码子优化后的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP-Eo) 报道基因. 用脂质体转染方法将携带有EoMAC－G的pBTub-Tel载体转入八肋游仆虫大核,分析EGFP-Eo基因在八肋游仆虫细胞中的表达. 荧光显微镜观察发现,EGFP-Eo产生的荧光均匀分布于八肋游仆虫细胞质中. 在细胞进行有丝分裂的情况下,荧 光可持续20 d以上. 相比pEGFP-N1质粒转化的游仆虫,人工染色体中的EGFP-Eo基因表达的荧光亮度强、稳定且持续时间长. Western 杂交分析进一步证实,外源EGFP-Eo基因在细胞中过量表达. 通过细菌喂食法进行纤毛虫RNA干扰实验,抑制了外源EGFP-Eo基因在八肋游仆虫细胞中的表达. 利用构建的人工染色体不仅可以在八肋游仆虫细胞内表达外源基因,对目的蛋白质进行活细胞实时动态的定位分析,还可通过RNA干扰的方法调控外源基因在纤毛虫细胞中的表达,便于进一步分析目的蛋白质的功能.     

八肋游仆虫氨酰-tRNA合成酶基因序列分析

氨酰-tRNA合成酶 (aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS) 是蛋白质生物合成中的关键酶,能够催化特定的氨基酸和相应tRNA结合。为了研究八肋游仆虫氨酰 tRNA合成酶(Euplotes octocarinatus aminoacyl-tRNA synthetase, EoaaRS)基因的种类、数目、结构及起源,本研究利用生物信息学方法,对八肋游仆虫大核基因组编码的aaRS进行了系统分析。结果表明,八肋游仆虫大核基因组共包含45个aaRS基因,可编码20种不同的aaRS蛋白。其中,EoGlnRS和EoAlaRS仅由1个基因编码,其余EoaaRS均由多个基因编码。亚细胞定位分析显示,仅8个EoaaRS具有线粒体导肽,对应于6种EoaaRS。此外,基于核酸序列分析显示,多个EoaaRS在翻译过程中需要发生编程性核糖体移码,才能形成结构完整的蛋白质产物。结构域分析表明,部分EoaaRS存在特殊结构域,暗示其可能具有氨酰化以外的新功能。进化分析揭示,2个EoGlyRS起源于古菌,而2个EoLysRS起源于细菌。本研究为后续探讨低等真核生物aaRS的结构与功能奠定了基础。     

八肋游仆虫氨酰-tRNA合成酶基因序列分析北大核心CSCD

氨酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase,aaRS)是蛋白质生物合成中的关键酶,能够催化特定的氨基酸和相应tRNA结合。为了研究八肋游仆虫氨酰-tRNA合成酶(Euplotes octocarinatus aminoacyl-tRNA synthetase,EoaaRS)基因的种类、数目、结构及起源,本研究利用生物信息学方法,对八肋游仆虫大核基因组编码的aaRS进行了系统分析。结果表明,八肋游仆虫大核基因组共包含45个aaRS基因,可编码20种不同的aaRS蛋白。其中,Eo GlnRS和Eo AlaRS仅由1个基因编码,其余EoaaRS均由多个基因编码。亚细胞定位分析显示,仅8个EoaaRS具有线粒体导肽,对应于6种EoaaRS。此外,基于核酸序列分析显示,多个EoaaRS在翻译过程中需要发生编程性核糖体移码,才能形成结构完整的蛋白质产物。结构域分析表明,部分EoaaRS存在特殊结构域,暗示其可能具有氨酰化以外的新功能。进化分析揭示,2个Eo GlyRS起源于古菌,而2个Eo LysRS起源于细菌。本研究为后续探讨低等真核生物aaRS的结构与功能奠定了基础。     

八肋游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1有2个亚型

真核生物酸性核糖体磷酸化蛋白(P0、P1、P2)位于核糖体60S大亚基上,它们在核糖体上共同组成一个向外侧凸出的五聚体的柄状复合物［P0·(P1·P2)2］,该复合物在蛋白质合成延伸过程中起着重要作用．为了探讨单细胞真核生物核糖体柄状复合物的组成形式及在蛋白质合成中的作用,对八肋游仆虫（Euplotes octocarinatus）的P1进行了研究．通过生物信息学方法,分析八肋游仆虫基因组及转录组数据,找到2个酸性核糖体蛋白P1基因,从DNA 和cDNA中都扩增到这2个P1基因,表明八肋游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1确实存在2个亚型. 将2个基因克隆后分别构建重组表达质粒pET28a-P1A和pGEX-6P-1-P1B,在大肠杆菌BL21中获得高效表达.经镍柱和GST柱亲和层析后,获得较高纯度的八肋游仆虫酸性核糖体蛋白EoP1A和EoP1B,表达产物经Western印迹检测为阳性．Pull-down分析了EoP1A和EoP1B之间的相互作用．结果表明,游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1的2个亚型EoP1A和EoP1B之间存在相互作用.     

八肋游仆虫第二类释放因子基因的克隆与序列分析

分离八肋游仆虫 (Euplotesoctocarinatus)大核eRF3基因 ,为进一步研究第二类释放因子结构与功能 ,探讨低等真核生物新生肽链释放机理提供实验素材 .以八肋游仆虫基因组DNA为材料 ,根据已知的第二类释放因子eRF3保守氨基酸序列设计引物 ,扩增克隆了该游仆虫的第二类释放因子基因片段 ,并对其核苷酸序列进行了分析 .根据测得的序列设计特异性引物 ,并利用游仆虫的端粒序列 (C4 A4 C4 A4 C4 A4 C4 )为引物 ,扩增得到该基因的全序列 .序列分析表明 ,该基因位于 2 782bp长的大核染色体上 ,编码区由 2 4 0 0bp组成 ,编码 80 0个氨基酸 ,不含内含子     

滑动序列对游仆虫中识别+1位和+2位编程性核糖体移码具有关键作用

编程性核糖体移码(programmed ribosomal frameshifting,PRF)广泛存在于生命进化谱系的各个分支,是一种翻译水平上的基因表达调控方式。单细胞真核生物游仆虫(Euplotes)中不仅PRF基因比例高,而且移码类型有+1和+2位两种。本研究从基因组水平对八肋游仆虫(E.octocarinatus)中的+2 PRF基因进行了鉴定,比较分析+1及+2 PRF基因中可能的调控元件。为了探讨游仆虫中滑动序列对移码类型的影响,克隆了八肋游仆虫的+1 PRF基因——η微管蛋白基因,将其构建到含绿色荧光蛋白报告基因的游仆虫大核人工染色体中,转染游仆虫细胞,通过检测GFP的表达来确定不同滑动序列突变体对应的移码类型。结果表明,滑动序列的改变能使游仆虫+1 PRF转变为+2 PRF,且这种移码类型的改变与滑动序列第1个密码子编码何种氨基酸无关。本研究揭示了滑动序列对游仆虫中识别+1和+2位的编程性核糖体移码具有关键作用。     

肽链释放因子和核糖体蛋白L11在八肋游仆虫细胞中的定位

原生动物纤毛虫是一类单细胞真核生物,其蛋白质合成终止过程中密码子使用的特殊性使其成为研究蛋白质合成终止机制的一个经典模型。为了能够有效地分析生物大分子在该细胞中的功能作用位点,本研究根据该生物染色体结构的特征,构建了含有红色荧光蛋白基因的大核人工染色体EoMAC_R,并与之前构建的含绿色荧光蛋白基因的大核染色体EoMAC_G一起,对蛋白质合成终止有关的3个重要因子核糖体大亚基蛋白L11、多肽链释放因子eRF1和eRF3在八肋游仆虫细胞中进行了荧光共定位分析。结果显示,在八肋游仆虫细胞中,蛋白质翻译过程主要位于"C"形大核内侧区域。构建的人工染色体能够作为一种有效的工具,对目的蛋白质在八肋游仆虫细胞中进行定位分析。     

八肋游仆虫Rab家族基因克隆和多样性分析

Rab蛋白是在真核细胞内膜泡运输过程中起重要调节作用的一类小分子Ras-like蛋白,为Ras超家族中最大的家族。Rab家族成员在不同的生物中表现出数量的多样性和功能上的分化。为进一步了解Rab蛋白的多样性及其在真核细胞内膜泡运输网络中的功能,本研究利用游仆虫大核染色体特异的端粒结构和基因大小的染色体结构特征,通过简并引物PCR方法从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)中克隆到9种新的Rab基因,分别为EoRab1A、EoRab2b、EoRab2c、EoRab2d、EoRab6、EoRab7、EoRab2-like、EoRabL2和EoRan(GenBank登陆号为HM371131～HM371139)。序列分析表明,游仆虫中Rab基因家族成员既包括具有维持细胞结构核心功能保守基因,又包括为适应环境而进化出的特殊功能的新基因。     

EoRab43为八肋游仆虫中编码非典型Rab的基因

Rab蛋白是与真核细胞内的膜泡运输密切相关的调节分子。本研究运用简并引物PCR技术从原生动物八肋游仆虫大核基因组中克隆获得了一个全新的Rab基因,EoRab43 (GenBank登陆号为EU365391) ,该基因拟编码蛋白的氨基酸序列基本包括Rab蛋白保守的GTP结合区以及RabF模序。Blast结果显示,EoRab43序列与其它生物中Rab5A、Rab6和Rab13的一致性相对较高,但也仅为36·4 %-38·5 %,无法将其归类于任何现有的Rab蛋白亚家族。序列分析显示该基因拟编码的蛋白质属于非典型Rab,这是首次在游仆虫中发现的编码非典型Rab蛋白的基因,推测其在原生动物八肋游仆虫细胞内可能执行某些特殊的生理功能。     

EoRab43参与游仆虫细胞内大核周围的物质运输

Rab家族蛋白是真核细胞内膜泡运输途径中重要的调节因子。EoRab43是八肋游仆虫中一种编码非典型Rab蛋白的基因。本研究依据已获得的EoRab43基因序列设计引物．从八肋游仆虫大核DNA中扩增了EoRab43基因的3’端153bp片段,即EoRab43 153bp（对应于EoRab43蛋白的C末端50个氨基酸,EoRab43C）,构建重组表达质粒pGEX—EoRab43,53bp转化大肠杆菌BL21（DE3）进行表达．纯化后的融合蛋白GST—EoRab43C免疫BALB／c小鼠制备多克隆抗体。经检测,制备的抗体具有较高的效价及良好的特异性。利用制备的抗体对EoRab43在游仆虫细胞内进行免疫荧光定位．结果显示该蛋白主要定位于该生物细胞内大核染色体的周围。     

八肋游仆虫eRF3 C端的76个氨基酸对于释放因子eRF1a的结合不是必需的

以八肋游仆虫第二类肽链释放因子eRF3基因为模板,用PCR的方法获得eRF3的C端(eRF3C)和C端缺失76个氨基酸的突变体eRF3Ct片段,并构建重组表达质粒pGEX-6p-1-eRF3C和pGEX-6p-1-eRF3Ct,转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达。通过Glutathione Sepharose 4B柱亲和层析纯化,重组蛋白GST-eRF3C和GST-eRF3Ct获得纯化。Western blotting分析表明获得的蛋白为目的蛋白。PreScission酶切割后得到eRF3C和eRF3Ct蛋白。体外pull down分析显示eRF3C和eRF3Ct均能与八肋游仆虫第一类释放因子eRF1a相互作用,这表明八肋游仆虫eRF3 C端的76个氨基酸对于释放因子eRF1a的结合不是必需的。     

游仆虫重组核糖体蛋白L11与肽链释放因子的体外相互作用分析

核糖体蛋白L11(ribosome protein L11)是一种高度保守的蛋白质．为研究真核生物的核糖体蛋白L11的功能,从八肋游仆虫（Euplotes octocarinatus）大核基因组中克隆到核糖体蛋白L11基因,构建了重组表达质粒pGEX-6p1-L11,通过谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析,纯化了重组融合蛋白GST-L11．Pull down 分析显示,八肋游仆虫的核糖体蛋白L11与第一类肽链释放因子eRF1a可以在体外相互作用．这一结果提示,与原核生物一样,低等真核生物的核糖体蛋白L11在肽链终止过程中可能起一定的作用．     

八肋游仆虫大核基因组中组蛋白基因 H4A和H4B的克隆及分析

组蛋白作为核小体的基本组分,是染色质的结构和功能必需的。组蛋白的变体和修饰共同参与染色质修饰及基因的表达调控。真核生物细胞中的5种组蛋白在进化中高度保守,然而纤毛虫的组蛋白H4与其他真核生物相比有较大的差异。本实验应用PCR技术从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)中获得了2种组蛋白H4基因,分别为H4A和H4B,GenBank登录号为:JN715068和JN715069。序列分析表明,H4A基因开放阅读框324 bp,预测编码107个氨基酸,分子量为11.6 ku,等电点为10.99。而H4B基因编码框384 bp,编码127个氨基酸,分子量为14.4 ku,等电点为9.93。Blast结果显示,H4A序列与其他生物中H4的一致性相对较高,达81%～94%,而H4B的一致性为36%～70%。H4A和H4B的一致性仅为44.7%。实时荧光定量PCR表明,H4A的转录本高于H4B。结果提示:在进化过程中八肋游仆虫可能进化出特殊的组蛋白H4基因,不同的组蛋白H4可能发挥不同的功能。     

八肋游仆虫核糖体蛋白L11的基因克隆与序列分析

以单细胞真核生物八肋游仆虫Euplotes octocarinatus为实验材料,采用PCR、RT-PCR方法克隆了核糖体蛋白L11基因(EoRPL11).将该序列与GenBank中其他物种的RPL11基因序列进行同源性比对,采用DNAStar软件进行聚类分析.结果显示,成功克隆到游仆虫RPL11基因,大核中该基因全长709 bp,开放阅读框(ORF)为531 bp,编码176个氨基酸;cDNA序列与大核中ORF序列一致,表明该基因具有转录活性;所推导的氨基酸序列与嗜热四膜虫Tetrahymena thermophila的RPL11同源性最高,为66%.     

原生动物八肋游仆虫cDNA文库的构建

细胞内蛋白质合成过程是一个由多种蛋白质相互作用参与调节的开放系统,形成了复杂的mRNA代谢和蛋白质翻译为核心的基因表达调控的网络和信号转导途径。【目的】为了获得更多参与调节蛋白质合成终止过程的蛋白质种类和功能信息,进一步了解其中的网络和信号转导途径,本研究构建了原生动物八肋游仆虫的cDNA文库。【方法】构建过程严格遵循Clontech公司的BD MatchmakerTM Library ConstructionScreening kit提供的方案进行文库构建和筛选.【结果】首次得到了可用于筛选功能基因的原生动物纤毛虫的cDNA文库,文库滴度为2.437×107cfu/mL。利用第二类肽链释放因子为诱饵,筛选得到了一些可能与之相互作用的蛋白质,其中包括一个可能编码RNA解旋酶的基因序列。该文库为进一步筛选和研究八肋游仆虫功能基因提供了便利的平台。     

八肋游仆虫Rab家族新成员Eo-rab-1N基因的克隆与序列分析

Rab蛋白家族属于小分子GTP结合蛋白家族Ras超家族中最大的亚家族,主要在囊泡运输中起作用。本实验运用PCR、RT-PCR等技术,从八肋游仆虫中克隆到一种新的rab基因。序列分析结果表明：在大核中,该基因全长884bp,除去两端的端粒与非编码区,该基因在大核中由723bp组成。从小核中克隆相应的基因片段,此基因片段序列与大核中序列一致,表明该基因在小核中无内部删除序列的存在。通过RT-PCR,从mRNA获得的该基因的开放读框为663bp,表明该基因在转录过程中有内含子的删除。大核基因序列和cDNA序列比较,发现60bp的内含子序列位于大核基因的153~212bp之间,并符合一类内含子GU-AG剪切规则。在遗传密码使用上,该基因内部含有2个TGA,在游仆虫中编码半胱氨酸。同时首次发现,八肋游仆虫基因使用TAG作为终止密码子。NCBI上序列比对表明该基因翻译的蛋白与其它物种Rab1蛋白的同源性达49%~52%,因此我们将它命名为Eo-rab-1N,GenBank登录号为DQ105562。Eo-rab-1N与其他物种的Rab1蛋白构建进化树,发现该蛋白的进化与物种的进化保持一致,表明该基因在细胞中具有重要功能。     

八肋游仆虫γ—微管蛋白及其基因的研究

γ－微管蛋白是一种新发现的与微管形成有关的蛋白质。利用ＰＣＲ技术从一种下毛类纤毛虫－八肋游仆虫大核ＤＮＡ中扩增出γ－微管蛋白基因并对其核苷酸序列进行了分析。另外,在有些分裂间期及有丝分裂期的小核内以及部分大核内也发现有γ－微管蛋白存在。     

小腔游仆虫形态学、个体发育与分子系统学研究

游仆类是纤毛虫中进化最为复杂和高等的一大类群,为了进一步探索和完善游仆类的多样性,本研究利用活体观察、蛋白银和银浸法染色技术对采自青岛小西湖的小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)的形态学及细胞发生学进行了详尽的研究,并在完整的形态学及发生学研究基础上,测定了小腔游仆虫的核糖体小亚基基因(SSU r DNA)序列,通过序列比较和分子系统树构建等方法,对小腔游仆虫的系统地位进行了分析。结果表明:本种鉴别特征为9根额腹棘毛,5根横棘毛,2根缘棘毛,2根尾棘毛,8列背触毛,double-eurystomus型银线系。发生学特征包括:(1)后仔虫口原基在表皮下独立发生,前仔虫完全继承老口围带;(2)额–腹–横棘毛原基从左向右按照3:3:3:2:2的模式形成额腹棘毛和横棘毛;(3)前后仔虫最左侧额腹棘毛分别由独立产生的原基形成;(4)缘棘毛原基独立发生;(5)初级背触毛原基来自虫体中部老结构的反分化;(6)前后仔虫尾棘毛分别来自最右侧2列背触毛原基和老背触毛列末端;这些特征显示出游仆虫属个体发生模式的高度保守性。分子系统分析与形态学数据一致,即游仆虫属为单元发生,且小腔游仆虫与艾美游仆虫(Euplotes amieti)、阔口游仆虫(E.eurystomus)和伍氏游仆虫(E.woodruffi)聚在一起。