瘤背石磺Egr-1基因的克隆、分析及低频声音刺激对其表达的影响

早期生长反应因子1(Egr-1)基因又名为Zif268、NGFI-A、Krox-24、Tis8、ZENK,分布于脊椎动物的神经细胞中,参与识别功能相关的神经活动.本研究通过cDNA末端快速扩增法(RACE)获得瘤背石磺(Onchidium reevesii)Egr-1基因全长序列,进行蛋白质特征分析、氨基酸序列预测以及Egr-1基因的组织差异表达,并检测了不同低频声音(0～200 Hz)刺激0～24h后Egr-1基因表达量的变化.结果显示:瘤背石磺Egr-1基因cDNA序列全长2 556bp,含134 bp的5'端非编码区、709 bp的3'端非编码区和1 713 bp的开放阅读框,编码570个氨基酸.瘤背石磺Egr-1蛋白分子质量为61.31 kD,理论等电点为6.14,平均疏水指数-0.491,不含信号肽;二级结构和三级结构预测显示有α螺旋和β折叠.瘤背石磺Egr-1基因在其腹足、背部皮肤、神经节、肝胰腺、两性腺中均有表达,在神经节和两性腺中高表达,背部皮肤和肝胰腺中组织表达量最低(P＜0.05).相比对照组,受到低频声音刺激0.5 h,后瘤背石磺神经节中Egr-1基因的表达量显著升高,且不同频率声音间表达量差异显著(P＜0.05),推测Egr-1基因参与了瘤背石磺识别低频声音功能相关的神经活动,所得结果为进一步研究瘤背石磺识别处理声音信息的分子机制提供重要的基础数据.     

瘤背石磺Egr-1基因的克隆、分析及低频声音刺激对其表达的影响

早期生长反应因子1(Egr-1)基因又名为Zif268、NGFI-A、Krox-24、Tis8、ZENK,分布于脊椎动物的神经细胞中,参与识别功能相关的神经活动.本研究通过cDNA末端快速扩增法(RACE)获得瘤背石磺(Onchidium reevesii)Egr-1基因全长序列,进行蛋白质特征分析、氨基酸序列预测以及Egr-1基因的组织差异表达,并检测了不同低频声音(0～200 Hz)刺激0～24h后Egr-1基因表达量的变化.结果显示:瘤背石磺Egr-1基因cDNA序列全长2 556bp,含134 bp的5'端非编码区、709 bp的3'端非编码区和1 713 bp的开放阅读框,编码570个氨基酸.瘤背石磺Egr-1蛋白分子质量为61.31 kD,理论等电点为6.14,平均疏水指数-0.491,不含信号肽;二级结构和三级结构预测显示有α螺旋和β折叠.瘤背石磺Egr-1基因在其腹足、背部皮肤、神经节、肝胰腺、两性腺中均有表达,在神经节和两性腺中高表达,背部皮肤和肝胰腺中组织表达量最低(P＜0.05).相比对照组,受到低频声音刺激0.5 h,后瘤背石磺神经节中Egr-1基因的表达量显著升高,且不同频率声音间表达量差异显著(P＜0.05),推测Egr-1基因参与了瘤背石磺识别低频声音功能相关的神经活动,所得结果为进一步研究瘤背石磺识别处理声音信息的分子机制提供重要的基础数据.     

石磺科3种贝类皮肤显微结构比较

应用石蜡切片和H.E染色技术,对石磺科(Onchidiidae)3个属的代表物种:瘤背石磺(Onchidium struma)、平疣桑椹石磺(Platevindex mortoni)和里氏拟石磺(Paraoncidium reevesii)的皮肤进行了组织学观察及参数测量比较。结果表明,3种石磺的皮肤虽然厚度不一,但基本结构相似,均由角质膜、表皮和真皮构成。角质膜是一层覆盖于表皮角质层上的蛋白质薄膜;表皮由多层上皮细胞构成,包括角质层、颗粒层和生发层;真皮包括疏松层和致密层,疏松层中嵌有颗粒腺和黏液腺两种腺体。3种石磺的皮肤厚度、各组织相对厚度及腺体数量等均存在差异。将结构差异与石磺的栖息环境进行比较分析后得到:陆栖为主的瘤背石磺皮肤表皮角质化程度高,颗粒腺发达;以水栖为主的里氏拟石磺表皮角质化程度相对低,黏液腺发达;而水陆两栖的平疣桑椹石磺,皮肤角质化程度介于前述二者之间,颗粒腺与黏液腺均不发达。研究结果体现了三者不同的生态适应特征,也为深入探讨海洋无脊椎动物从海洋向陆地进化的研究提供形态学依据。     

六种石磺科贝类超氧化物歧化酶和酯酶同工酶分析

采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳分离技术对中国东南沿海的石磺科6种石磺的腹足、肝胰脏两种组织的超氧化物歧化酶和酯酶同工酶进行分析.明确了其酶谱的特征及分布,并利用聚类分析方法对种间的亲缘关系进行了研究.同工酶聚类分析显示,紫色疣石磺(Peronia verruculata)和小紫疣石磺(Peronia sp.)的亲缘关系最近;里氏拟石磺(Paraoncidium reevesii)和白底拟石磺(Paraoncidium sp.)聚为一类;平疣桑椹石磺(Platevindex mortoni)和瘤背石磺(Onchidium struma)聚为一类.种间的个体酶谱表型有差异,同属的种间差异小于不同属的种间差异.酶谱的差异程度与形态分类学中的亲缘关系相近.利用超氧化物歧化酶同工酶和酯酶同工酶酶谱表型也可以作为一种蛋白分子标记应用于石磺科属种的分类鉴定.     

我国华东沿海4种石磺形态学比较

我国华东沿海分布有瘤背石磺(Onchidium struma)、平疣桑椹石磺(Platevindex mortoni)、里氏拟石磺(Paraoncidium reevesii)、紫色疣石磺(Peronia verruculata)4属4种石磺,后3种为我国大陆沿海新纪录种。通过野外实地调查和实验室暂养分别观察了其生态习性及外部形态,测定外形主要生物学性状指标进行统计分析;同时解剖比较4种石磺的生殖系统和消化系统等内部结构。结果显示,4种石磺的生活区域分别从潮间带中潮区至高潮区再到潮上带而呈现梯度分布状态,生活区域的不同导致生活习性、呼吸方式的不同;4种石磺外部形态差别明显,身体背部和腹足的颜色不同,平疣桑椹石磺没有背眼,腹足灰黑色或灰白色,惟紫色疣石磺有树枝状鳃;在内部结构中,平疣桑椹石磺无阴茎附属腺,里氏拟石磺无阴茎牵引肌且与紫色疣石磺一样不具有肛门腺。主要生物学性状数据分析得出足长和足宽是典型代表数据,判别分析得出呼吸孔至身体末端距离与肛门至呼吸孔距离的比例是属种间具有显著性意义的观察指标,从外形及内部主要结构比较发现将它们分属4个种是准确的。外部形态的特殊结构以及内部结构主要差异可作为石磺科分类的主要依据;比较我国华东沿海石磺的形态学差异能为石磺科贝类模式种资料的重新修订提供良好的研究基础。     

瘤背石磺低频听力基因PMCA2的克隆、相对表达及神经组织原位杂交分析

低频听力基因PMCA2在生物听力方面占据着重要位置,基因突变或缺失后会引发神经性耳聋和平衡功能障碍.为探究基因PMCA2在瘤背石磺潮汐感知中的作用,本研究通过RACE技术克隆得到瘤背石磺PMCA2基因的全长cDNA,并进行系统进化分析.利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术和原位杂交技术分析两组(暂养无处理组和潮汐干扰刺激组)瘤背石磺PMCA2基因在各组织中相对表达量和在神经组织各神经节中的相对表达部位.实验结果表明,瘤背石磺PMCA2基因cDNA全长5 091 bp,包含492 bp的5'非编码区(UTR)以及972 bp的3'UTR,3 627bp的开放阅读框,共编码1 208个氨基酸,基因序列较为保守.序列分析结果显示,瘤背石磺与加州海兔、绿色海蜗牛和福寿螺PMCA2氨基酸序列同源性分别为81.79％,78.25％和72.91％.通过系统进化树分析研究得出,瘤背石磺与加州海兔进化关系相对较近.RT-qPCR结果显示,两组石磺神经组织PMCA2基因表达量皆高于其他组织的,且潮汐干扰刺激组神经组织表达量明显高于暂养无处理组,有显著性差异.两组瘤背石磺神经组织原位杂交实验结果显示,相较于暂养无处理组,潮汐干扰刺激组石磺神经组织杂交信号明显增强,该结果与荧光定量PCR结果相符.实验初步表述了瘤背石磺PMCA2基因的生物信息学特征,在瘤背石磺各组织中的表达情况及在神经组织中的分布部位,为研究滩涂生物感知潮汐能力提供原创性成果.     

两种石磺齿舌形态差异分析

显微观察了瘤背石磺(Onchidiumstruma)和石磺(O. verruculatum)齿舌的形态结构。运用差异系数法对两种石磺齿舌参数进行比较分析。利用SPSS10.0对瘤背石磺、石磺齿舌参数(齿舌长、齿舌头宽、齿舌中宽、齿舌尾宽、横列数、每排最少齿片数和每排最多齿片数)与个体参数(体长、体宽、体高、足长、足宽和体重)作回归分析。结果表明,两种石磺齿舌都很发达,外观呈长统靴状;齿片排成许多横列,每一横列均有中央齿一枚,侧齿若干无缘齿;两种石磺的齿舌头宽、齿舌中宽和齿舌尾宽差异极显著,但差异系数小于1.28,认为两种石磺的齿片形态存在明显的种间差异,但齿舌参数不适合作为石磺属贝类的分类依据;瘤背石磺的体宽和石磺的体重在评估各自齿舌生物学性状方面起到比较重要的作用。     

瘤背石磺交配规律的初步研究

雌雄同体动物的交配行为和机制具有多样性的特点。利用身型大小与交配之间的关系来推测雌雄同体动物的交配规律是一个重要的手段。瘤背石磺属雌雄同体动物,通过实验室研究观察及数理分析结果显示：瘤背石磺的求偶行为方式是2个或3个个体进行追逐,追逐具有随机性;其交配行为方式较复杂,既存在同型大小个体交配,也有异型大小个体交配,并且小个体更趋向于扮演雄性角色而大个体多扮演雌性角色。瘤背石磺在繁殖季节时会出现多次交配高峰期,在各交配高峰期时,交配形式具有差异,并且瘤背石磺具有发生互惠性交配的条件。     

瘤背石磺Os-NMHC的克隆、表达分析以及NMHC进化节点探讨

本研究以石磺科贝类转录组数据库为基础,克隆出一条Ⅱ型非肌肉型肌球蛋白重链(NMHCⅡ)基因的全长c DNA,将其命名为Os-NMHC。该序列全长为6 057 bp,包括5 733 bp的开放阅读框,236 bp的5'端非翻译区,88 bp的3'端非翻译区,共编码1 910个氨基酸。预测蛋白质等电点为5.26,相对分子质量为220.46 k D。通过Phyre2程序和Pymol软件构建蛋白质三级结构图,预测蛋白质二级结构以α螺旋和β折叠为主;通过Clustalx和dna MAN软件进行氨基酸序列比对,发现其与爪蟾NMHCⅡA序列一致度为60.37%,其与爪蟾NMHCⅡB序列相似度为61.47%;通过Bayes软件构建系统进化树,发现其与加州海兔亲缘关系最近。通过q RT-PCR技术检测,发现该基因在四种石磺的背部、腹部、腹足部、肺囊、心脏、神经节中均有不同程度的表达。种间表达水平与进化趋势相一致,依次为:瘤背石磺≥平疣桑椹石磺里氏拟石磺紫色疣石磺。     

瘤背石磺的生殖系统结构特点及生殖周期研究

采用活体性腺观察和组织切片方法对瘤背石磺的生殖系统及生殖周期进行了周年的研究.结果表明,瘤背石磺的生殖系统由三部分组成:两性腺、雄性生殖管道及附属腺体、雌性生殖管道及附属腺体.雄性生殖管道由输精管、阴茎、刺激器组成,附性腺为主要的附属腺体;雌性生殖管道由输卵管、受精囊、阴道组成,附属腺体主要为卵黄腺和蛋白腺.瘤背石磺的生殖周期具有典型的腹足类动物的特征,性腺发育周期可以分为:休止期、增殖期、生长期、成熟期、排放期5个时期,生殖周期为1年,成熟和排放期在6月上旬到9月上旬,繁殖高峰期在7月上旬至8月上旬,10月后进入休止期.本文还讨论了瘤背石磺在繁殖过程中精卵的输送、受精等过程及相关的交配器和附属腺体的功能.     

基于18S rRNA的中国大陆沿海石磺科贝类分类的初步分析

对采自上海崇明、福建宁德、海南海口等沿海地区9个群体的石磺科贝类进行外部形态特征差异分析和内部结构比较,在初步分类基础上利用核糖体小亚基18S rRNA基因部分序列对9个群体进行系统发育分析,以菊花螺为外群,结合GenBank上石磺科4个18S rRNA基因序列构建系统发生树来探讨我国大陆沿海石磺科属种间的亲缘关系.结果显示:我国石磺科贝类南方沿海种类多于北方沿海;除报道的瘤背石磺(Onchidium struma)和石磺(O.verruculatum)外,可能还有新记录5种:Onchidium属1种、Platevindex属2种、Peronia属1种和Paraoncidium属1种.分子系统发生树显示,我囝大陆沿海石磺科9个群体可分为4个亚群,分别为Onchidium、Platevindex、Paraoncidium、Peronia,其中Peronia亚群的置信度较高;Onchidium verruculatum应更名为Peronia verruculata.     

苏沪沿海瘤背石磺的形态和习性

瘤背石磺(Onchidium struma)是生活在潮间带高潮区的一种肺螺类。属软体动物门(Mollusca)腹足纲(Gastropoda)肺螺亚纲(Pulmonata)柄眼目(Stylommatophora)石磺     

浅议瘤背石磺酶解多肽开发前景

作为海洋活性物质的重要组成部分,多肽类化合物在人体降血压、抗氧化、抗肿瘤等诸多方面有着重要的作用。本文在阐述近些年来贝类酶解多肽研发的基础上,论述了瘤背石磺酶解多肽的开发前景。     

瘤背石磺的生殖系统和性腺发育

2003年5~8月对瘤背石磺(Onchidium struma)的生殖系统结构和性腺发育进行了组织学研究。瘤背石磺生殖器包括两性腺、卵黄腺、蛋白腺。两性腺具有外管和内管,两管相连后通入蛋白腺,内管分支为收集管与腺泡相通。蛋白腺包括腺体部和分泌物两部分,中央为生殖输送管,蛋白腺具食指突和拇指突。性腺腺泡包括精子期腺泡、卵子期腺泡、精卵同泡和排空期腺泡4种类型。本文还对卵黄腺、受精囊、雄性交接器等结构进行了组织学观察,分析了精子和卵子的发育过程、运输路径。     

不同体重瘤背石磺性腺发育规律

利用组织学方法研究了瘤背石磺体重(2—28g)与性腺发育、性腺指数与肝胰腺指数或卵黄腺指数间的关系,不同体重瘤背石磺性腺内各期生殖细胞的组成与比例以及瘤背石磺卵子和精子发生的规律。结果表明,(1)瘤背石磺的性腺指数有随体重增加而增加的特点:10g以上个体性腺指数达到最高且基本无变化;不同体重瘤背石磺性腺指数与肝胰腺指数和卵黄腺指数有明显的正相关性(P<0.05);(2)6g以下组的瘤背石磺性腺滤泡管内未发现有雌性生殖细胞,6g以上组的性腺滤泡管内雄性与雌性生殖细胞并存;(3)所有瘤背石磺个体性腺内均有精子分布,6g以下个体雄性生殖细胞组成以次级精母细胞为主,而6g以上个体则以精子为主;6g以上组的雌性生殖细胞成熟程度随体重增加有明显增加,其中6—8g以卵原细胞为主(57%),8—10g开始出现外源性卵黄合成期的卵母细胞,10—14g时的外源性卵黄合成期的卵母细胞约为69%,且开始出现成熟卵母细胞。(4)卵子发生共经历6期:分别为卵原细胞期、卵黄合成前卵母细胞期、内源性卵黄合成期、外源性卵黄合成期、近成熟期和成熟卵母细胞期,成熟卵母细胞直径约为(59.36±3.88)μm。精子发生经历精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子共5个阶段,精子长约(52.44±20.65)μm。石磺体重与性腺发育程度密切相关,10g以上的个体可做为亲本使用。     

崇明岛瘤背石磺的化学成分研究

综合利用各种层析方法对采自上海崇明岛的瘤背石磺进行分离纯化。共分离到5个化合物,经理化性质,波谱数据分析并结合参考文献,分别鉴定为2,2'-oxybis(1,4-di-tert-butylbenzene)(1)、胆甾醇(2)、鲨肝醇(3)、硬脂酸乙酯(4)、硬脂酸(5)。其中化合物1首次以天然产物形式获得,所有化合物均为首次该属种中分离得到。     

瘤背石磺产卵前后脂类和脂肪酸组成的变化

本研究测定了瘤背石磺产卵前后肌肉、肝胰腺、两性腺、卵蛋白腺、雄性附性腺和黏液腺指数、水分含量、总脂含量、脂类和脂肪酸组成.结果表明:(1) 瘤背石磺产卵后的肝胰腺指数(HIS)、两性腺指数(DGSI)和卵蛋白腺指数(EAGI)都显著下降(P＜0.05), 其水分含量显著上升, 而脂肪含量显著下降; (2) 瘤背石磺各种组织总脂主要有磷脂(PL)、胆固醇(Cho)、游离脂肪酸(FFA)和甘油三酰(TG), 仅在肝胰腺中检测出少量甘油一酰(MG), 产卵后肝胰腺中的FFA含量和两性腺中的PL含量大幅度下降, 分别下降了41.36%和80.53%, 其它组织中的脂类成分变化幅度不大;(3) 产卵后瘤背石磺肝胰腺中的C16:1n7、C20:5n3(EPA)和C22:6n3(DHA)显著下降, 而饱和脂肪酸(∑SFA)含量显著上升.产卵后两性腺中的C20:2n6、C22:2n6和C22:5n3(DPA)显著下降, 而C20:4n6(AA)含量显著上升.产卵后雄性附性腺和黏液腺中的AA和EPA含量均有所下降, 而C16:0和C18:1n9却有所上升.结果表明:卵蛋白腺和黏液腺对于瘤背石磺产卵和胚胎的形成具有重要的作用, PL和多不饱和脂肪酸(PUFA)对瘤背石磺的两性腺发育具有十分重要的作用, 肝胰腺中的脂肪可能是瘤背石磺产卵过程中主要的能源物质之一, 性腺发育过程中肝胰腺中的PUFA可能被转运到两性腺中.     

一种石磺科贝类线粒体基因组全序列分析

石磺线粒体基因组全序列对研究石磺科分子系统进化具有重要意义。利用LA-PCR技术对一种石磺Platevin-dexmortoni线粒体基因组全序列进行了测定和分析。结果表明,线粒体基因组序列全长13 991 bp,碱基组成分别为27.27%A、16.78%C、20.23%G、35.72%T;由22个tRNA、2个rRNA、13个蛋白编码基因和25个长度为2-118 bp的非编码区组成。4个蛋白质编码基因和5个tRNA基因从L链编码,其余基因均从H链编码。蛋白质基因的起始密码子,除ND2为GTG以外,均为典型的起始密码子ATN。ND2和Cytb基因使用了不完全终止密码子T,其余基因均使用典型的TAA或TAG。预测了22个tRNA基因的二级结构,发现tRNASer和TrnaAsn缺少DHU臂,tRNASer和tRNAThr的反密码子环上有9个碱基,而不是通常的7个碱基。最长的非编码区含有两个类似于的tRNAGln和tRNAPhy的二级结构。     

瘤背石磺的精子结构

用光学显微镜和透射电子显微镜技术研究了瘤背石磺精子的结构特点,分析了其生理生态适应性以及在肺螺亚纲系统演化中的意义。瘤背石磺的精子由头部、中段和末段组成。头部由奶嘴形的顶体和长圆筒状的细胞核构成。顶体包括顶体囊和顶体构架体两部分;两者的内含物都分布均匀,电子密度稍低于细胞核;顶体基部平整,与核前端之间有一空隙,内含物电子密度极低。细胞核由电子密度高的均匀颗粒物质组成,并出现核泡;核的后端有一"杯形"的凹陷,称为核后窝。中段结构复杂,主要包括一对位于核后窝内的中心粒、轴丝、质膜、线粒体及由线粒体衍生的糖原质螺旋体、基质层和类晶体层等。末段由"9 2"结构的轴丝及外包的质膜组成,无糖原质螺旋体和其它线粒体衍生物。比较瘤背石磺精子与肺螺亚纲其它物种的精子结构,我们认为该物种的精子属于"进化型",是一类在进化地位中比基眼目高等的动物。     

瘤背石磺的形态、习性和生殖行为

2003年5月～2004年5月研究了上海崇明瘤背石磺(Onchidium struma)的形态特征、生活习性,分别对其消化、呼吸、循环、排泄、生殖、神经等六大系统进行了阐述。结果表明,瘤背石磺生活在潮间带高潮区滩涂的芦苇丛里,摄食泥滩上的有机质和单胞藻类;雌雄同体、异体交配、卵生。生殖系统包括生殖器和雌、雄交接器三部分：生殖器由两性腺、卵黄腺和蛋白腺组成;雄性交接器由输精管、附性腺、阴茎、刺激器等组成,雄性生殖孔位于右侧第一触角中部;雌性交接器由输卵管、受精囊、阴道等组成,雌性生殖孔位于肛门右侧约5．0mm处的腹足与外套膜的交界处。本文并详细描述了石磺的交配行为。