甜叶悬钩子(Rubus suavissimus S.Lee)中UDP-糖基转移酶基因的克隆、表达及序列分析

糖基化是植物次生代谢产物生物合成中重要的修饰反应。目前已报道的以二萜为底物的UDP-糖基转移酶(UGT)数量稀少。本研究基于甜叶悬钩子叶片的转录组数据,利用生物信息学分析手段,选定可能具有二萜类催化活性的UDP-糖基转移酶基因进行克隆。最终克隆得到18条UGT基因序列,在大肠杆菌中进行了异源表达,并对克隆的基因进行了初步的序列分析。本研究为进一步挖掘和验证甜叶悬钩子中UGT的功能奠定了基础。     

石榴PgUGT基因表达特性与重组表达分析北大核心CSCD

由糖基转移酶参与的糖基化反应是植物次生代谢产物合成中最广泛的一种修饰方式,也是次生代谢产物结构多样性的机制之一。该研究基于石榴(Punica granatum L.)转录组数据,以石榴果皮为材料,采用RT-PCR克隆得到石榴UDP-糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase,UGT)基因(PgUGT);采用生物信息学技术对编码蛋白的基本特性进行分析,并构建系统发育树;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在果实发育期内的表达模式;结合果实发育期内的总类黄酮和总花色苷含量,分析了基因表达与总类黄酮和总花色苷合成的关系;构建PgUGT的原核表达载体,对其进行原核重组表达。结果表明:(1)成功克隆得到石榴PgUGT基因(GenBank登录号为MW414607);PgUGT基因具有一个1557 bp的开放阅读框(ORF),编码518个氨基酸,预测蛋白分子质量为55.9 kD,等电点为6.55,为不稳定的亲水蛋白;PgUGT具有糖基转移酶家族保守的PSPG基序,属于GT-B糖基转移酶基因家族。进化树分析表明,该编码蛋白属于拟南芥UGT的F类群,与葡萄和草莓的UGT亲缘关系较近。(2)qRT-PCR结果表明,石榴PgUGT基因的表达量在果实发育期内呈先升后降的模式,与总类黄酮含量的逐渐下降和总花色苷含量的逐渐上升趋势并不完全一致。(3)成功构建原核表达载体pCZN1-PgUGT;重组原核表达结果显示,重组质粒在大肠杆菌中为可溶性表达,表达的蛋白分子量约为58 kD。该研究结果为PgUGT基因在石榴类黄酮糖基化反应中的作用及功能奠定了基础。     

石榴PgUFGT基因克隆及表达分析

利用RT-PCR和RACE方法,从石榴(Punica granatum L.)果皮中克隆到一个类黄酮糖基转移酶(UFGT)基因(PgUFGT)全长cDNA序列(GenBank登录号为KF841620)。PgUFGT基因编码区1 476bp,编码491个氨基酸。PgUFGT蛋白具有保守PSPG基序、UDP-糖基转移酶家族结构域和UDP-葡萄糖醛酸基/葡萄糖基转移酶保守域(UDPGT),与其他植物UFGT蛋白一致性较高;系统进化树分析结果表明,PgUFGT属于类黄酮3-O-糖基转移酶类。荧光定量qRT-PCR结果表明,PgUFGT基因在‘红宝石’和‘水晶甜’2个石榴品种的发育期内具有不同的表达模式,PgUFGT在‘红宝石’石榴中有2个转录表达高峰,而在‘水晶甜’石榴中仅有1个表达高峰,表明PgUFGT可能在2个石榴品种中具有不同的催化作用。该研究结果为进一步研究石榴果实色泽形成的分子机制奠定了基础。     

梭梭糖基转移酶基因克隆及序列分析

以梭梭叶片为材料,根据其他植物糖基转移酶基因的保守序列设计引物,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法克隆到2个同源的序列,分别命名为 HaUGT1和 HaUGT2。基因测序结果显示, HaUGT1基因编码区长1 485 bp,编码495个氨基酸; HaUGT2基因编码区长1 185 bp,编码394个氨基酸。HaUGT1和HaUGT2蛋白具有保守的PSPG 基序、UDP-葡萄糖基转移酶结构域,与其他植物中的糖基转移酶蛋白同源性较高。     

‘红巴梨’果皮UFGT基因的克隆及表达分析

以‘巴梨’红色芽变品种‘红巴梨’果皮为材料,采用同源克隆技术和RACE结合的方法,克隆了UFGT(UDP-葡萄糖:类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶)蛋白的部分cDNA,命名为Pc UFGT。结果表明:该cDNA片段长为1 089 bp,与苹果UFGT基因序列一致性达89%,氨基酸序列同源性为85%,含有糖基转移酶的UDPGT、COG1819和MGT等保守域。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在‘红巴梨’幼果期表达强度约为‘巴梨’的2倍,而果实成熟期表达强度略低于‘巴梨’;该基因在‘红巴梨’果肉中不表达。     

七彩红竹中类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆及功能分析

类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(Flavonoid-3-O-glucosyltransferase,3GT)是花青苷(Anthocyanins)生物合成途径中的关键酶,它主要负责将不稳定的花色素转变为稳定的花色素苷,虽然目前已经从其他植物中克隆获得类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶,但是对竹子中的类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶并不清楚。该文以产生花青素的七彩红竹(Indosasa hispida Mc Clure cv.Rainbow)为材料,首先通过3GT的同源比对后设计3GT基因特异引物,获得3GT基因片段;然后运用RT-PCR及RACE技术从七彩红竹茎中克隆得到完整的3GT基因(Ih3GT)。结果表明:Ih3GT基因的c DNA全长序列为1 730 bp,含有1个1 425 bp的开放阅读框(ORF),编码474个氨基酸;系统进化分析显示,七彩红竹3GT与其他禾本科植物的3GT聚类到同一个分支;该基因推断的蛋白与水稻(Oryza sativa)3GT蛋白的相似性为69%,与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)3GT的相似性为67%;经氨基酸序列比对,推断七彩红竹3GT含有糖基转移酶基因家族特有的结构域PSPG-box;半定量PCR的结果显示,七彩红竹3GT基因在微红的幼茎中大量表达,而在其他组织中并不表达,说明Ih3GT具有组织表达特异性。该结果为今后深入研究七彩红竹花色苷的形成机理、鉴定Ih3GT酶活性以及利用Ih3GT基因培育竹子新品种奠定了基础。     

重叠延伸PCR法合成栀子两个糖基转移酶基因

[目的]糖基转移酶UGT94E5和UGT75L6催化栀子果实中西红花总苷生物合成途径的末端步骤。该研究利用重叠延伸PCR法,合成编码这两个酶的基因序列。[方法]首先将基因分段,每段两端均加上p UC57载体的多克隆位点作为接头,拼接成800 bp以下的片段,再输入到DNAWorks软件中,获得最优寡核苷酸片段组合;将合成的寡核苷酸片段混合,用作模板,进行两次PCR扩增,获得加了接头的各段序列,亚克隆到自制的p UC57 T载体上。酶切后回收插入片段,混合,用作模板,扩增全长基因,产物克隆到自制的p UC57 T载体上。[结果]成功合成了栀子Gj UGT9(编码UGT94E5)和Gj UGT1(编码UGT75L6)基因,分别长1 496 bp和1 583 bp。[结论]重叠延伸PCR法能够有效地合成栀子两个糖基转移酶基因序列,为遗传操作奠定了基础。     

管纹艳虎天牛UDP-葡萄糖基转移酶基因的鉴定及表达特征分析

【目的】昆虫UDP-葡萄糖基转移酶(UGT)在其内源性和外源性有毒化合物的解毒代谢过程中起着重要作用,但在管纹艳虎天牛Rhaphuma horsfieldi中UGT基因的研究尚属空白。【方法】采用转录组学、生物信息学、进化和表达谱分析、蛋白同源建模等技术研究了管纹艳虎天牛的UGT基因家族。【结果】从管纹艳虎天牛转录组中一共鉴定到36个RhorUGTs基因,其中17个具有全长序列。鞘翅目不同种间UGT基因数量的比较表明,管纹艳虎天牛具有中等数量的UGT基因。进化分析结果表明,RhorUGTs分布在10个亚家族中,其中UGT352亚家族为天牛科昆虫所特有,且该亚家族中RhorUGT2/7/10/16/18/27可能通过基因的复制产生。表达谱结果表明,大部分RhorUGTs基因在检测的所有组织中均有表达,部分基因呈现触角或跗节特异或高表达的特点,暗示它们具有嗅觉或触觉等功能。三级结构分析发现,RhorUGT17的α3、α4、β4和β5主要参与UDP-葡萄糖的结合。【结论】本研究明确了管纹艳虎天牛UGT基因的数量、序列特征、进化关系及组织表达特征,研究结果为该种天牛解毒代谢机制的阐明奠定基础。     

葡萄风信子MaGT1基因的克隆及其表达分析

该研究以葡萄风信子(Muscari ameniacum)‘亚美尼亚’为试材,克隆了花青素合成途径过程中的类黄酮糖基转移酶基因MaGT1(GenBank登录号MK652470)。该基因开放阅读框全长1 338 bp,编码445个氨基酸,预测蛋白分子量为49.301 kD,理论等电点为5.40。结构分析显示,MaGT1蛋白具有PSPG保守结构域、UDP 糖基转移酶家族结构域和UDP 葡萄糖醛酸基/葡萄糖基转移酶保守域(UDPGT)。进化分析表明,MaGT1蛋白与油棕、海枣、葡萄亲缘关系相近,聚类于类黄酮糖苷糖基转移酶类分支,以UDP 葡萄糖/鼠李糖为主要糖供体。花青苷含量测定显示,花青苷仅在葡萄风信子着色的花中积累,在根、鳞茎和叶以及未着色的花蕾(S1)中几乎检测不到花青苷,且随着花的发育,花青苷含量不断增加,并在衰败期(S5)达到最高。荧光定量PCR分析表明,MaGT1基因的表达具有显著的时空特异性,并在花中优势表达,而在根、鳞茎和叶片中微量表达;在花发育不同阶段,MaGT1基因的表达量随着花发育不断增加,并在盛花期达到峰值。研究表明,MaGT1蛋白催化反应是花青素合成途径中的重要修饰步骤。该研究结果为进一步分析MaGT1基因在葡萄风信子花青素合成和调控中的功能提供了依据。     

链霉菌UDP-葡萄糖脱氢酸编码基因Ste6的克隆表达和性质研究

链霉菌139能够产生一种全新的胞外多糖——依博素（139A）,该多糖体内具有显著抗类风湿性关节炎活性。其生物合成基因簇（GenBank Accession Number：AYl31229）已被鉴定约31．3kb,包含22个开放阅读框（ste1—ste22）。以pET-30a为载体,克隆并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行了ste6基因的表达,对该基因的克隆、表达与性质进行了研究。亲和层析法证实,纯化后重组蛋白具有催化UDP-葡萄糖脱氢变成UDP-葡萄糖醛酸的活性。这表明ste6编码产物是葡萄糖脱氢酶。为了证实ste6基因与依博素生物合成的关系,采用单交换基因破坏策略构建了ste6基因阻断突变株。结果初步显示ste6和依博素生物合成相关。     

箭叶淫羊藿EsUF3GT基因的克隆及表达分析

类黄酮3-O-糖基转移酶(flavonoid 3-O-glucosyltransferase,UF3GT)可以把不稳定的花色素催化成花色素苷。本研究采用同源基因克隆技术获得箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum(Sieb.and Zucc.)Maxim.UF3GT基因c DNA开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列,命名为Es UF3GT(Gen Bank注册号为KJ648620)。序列分析表明,该基因ORF全长为1356 bp,编码451个氨基酸,与其它植物中UF3GT蛋白序列的相似性为40%~50%。进化树分析发现,Es UF3GT同催化类黄酮3-O糖基化的糖基转移酶聚为一枝。qRTPCR分析结果显示,Es UF3GT在花中的表达量最高,约为叶片、花蕾中表达水平的2.3倍,果实及根中表达水平的19倍。花青素含量检测表明,花蕾中的含量最高(130.4 mg/100 g),分别是叶片、花、果实及根中含量的3.5、5.2、72、87倍。我们推测Es UF3GT参与了箭叶淫羊藿花色素苷的生物合成,此结果为深入开展EsUF3GT的生化功能研究奠定了基础。     

黄秋葵查尔酮合成酶基因AeCHS的克隆与表达分析

采用同源序列克隆和RT-PCR技术,首次克隆得到黄秋葵查尔酮合成酶基因(CHS)cDNA全长序列。序列分析表明,该序列全长1175 bp,包括一个1170 bp的完整ORF,编码389个氨基酸,命名为AeCHS。生物信息学分析表明,本研究所获得的AeCHS氨基酸序列与同科植物黄蜀葵和陆地棉的同源性较高,分别达99.23%和97.44%,AeCHS推断的氨基酸序列含有CHS蛋白的标签序列GFGPG以及4个保守活性位点Cys164、Phe215、His303、Asn336。实时荧光定量PCR分析黄秋葵果实、花、叶片不同发育时期AeCHS基因的表达量,结果表明AeCHS基因在上述植物材料中表现出不同的表达模式:花>果实>叶片,具体到不同植物组织,AeCHS基因在生长6 d的果实、盛开的花朵以及植株顶端第4片叶子中的表达量较高。     

斑地锦RT-qPCR内参基因的筛选

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的前提条件之一是具有合适的内参基因。为筛选斑地锦(Euphorbia maculata)合适的RT-qPCR内参基因,该文利用同源克隆法克隆斑地锦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等基因片段,RT-qPCR检测7个候选内参基因在斑地锦不同生长期根、茎、叶和果实中的表达情况,并用geNorm、NormFinder和BestKeeper等生物学软件对各候选基因表达稳定性进行评价。结果表明:(1)克隆的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP基因片段为729、808、753、422、233、656、313 bp,分别编码242、269、250、140、77、218、103个氨基酸,与其他植物相应氨基酸序列的最高同源性均在85%以上。(2)综合3个分析软件分析内参基因表达稳定性得出,表达稳定性排名为UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act。因此,可以选取UBQ作为斑地锦RT-qPCR分析的内参基因,用于不同生长期基因组织特异性表达研究。     

宁夏枸杞苯丙氨酸解氨酶基因的cDNA克隆及其表达分析

为探讨宁夏枸杞(Lycium barbarum)苯丙氨酸解氨酶基因(LbPAL)的表达特征,采用PCR法克隆了宁夏枸杞LbPAL基因的cDNA,并用实时定量PCR法分析了其表达特征。结果表明:宁夏枸杞的LbPAL基因的全长cDNA为2321 bp,包含2163 bp、编码720个氨基酸的开放阅读框;LbPAL与茄科其他物种的PAL氨基酸序列及三维结构具有较高保守性;与茄科物种的PAL聚类在同一个分支中。LbPAL在叶、花瓣、S1期果实的表达量较高,而在根及S2~S5期果实的表达水平较低。在NaCl胁迫处理下,LbPAL在根和茎中的表达量均有下调的趋势;而在叶片中,LbPAL表达量先急剧增加而后急剧下降并趋于稳定。这为解析宁夏枸杞中类黄酮化合物的生物合成调节及生理功能提供了参考。     

一种作用于花青素和甜菊醇的甜菊糖基转移酶的基因克隆和功能分析

本文对一种新的甜菊糖基转移酶进行了基因克隆和功能分析。获得的基因cDNA全长1419bp,编码473个氨基酸,蛋白质分子量约53.2K Da。与常见的糖基转移酶基因比较,相似性达44%以上,且具有糖基转移酶的保守序列。体外异源表达获得的融合蛋白,具有在花青素类和甜菊醇等糖基受体上转糖基的酶活性。在对一系列不同底物的酶活性进行比较后,推测这种糖基转移酶在体内参与了甜菊糖苷的合成。结果表明,具有广泛的底物活性的类黄酮类糖基转移酶,在甜菊体内不仅对类黄酮转糖基,而且在生成水溶性甜菊糖苷的过程中也扮演重要的角色。     

一种作用于花青素和甜菊醇的甜菊糖基转移酶的基因克隆和功能分析

本文对一种新的甜菊糖基转移酶进行了基因克隆和功能分析。获得的基因cDNA全长1419bp,编码473个氨基酸,蛋白质分子量约53．2KDa。与常见的糖基转移酶基因比较,相似性达44％以上,工具有糖基转移酶的保守序列。体外异源表达获得的融合蛋白,具有在花青素类和甜菊醇等糖基受体上转糖基的酶活性。在对一系列不同底物的酶活性进行比较后,推测这种糖基转移酶在体内参与了甜菊糖苷的合成。结果表明,具有广泛的底物活性的类黄酮类糖基转移酶,在甜菊体内不仅对类黄酮转糖基,而且在生成水溶性甜菊糖苷的过程中也扮演重要的角色。     

Accumulation of Flavonoid Glycosides and UFGT Gene Expression in Mulberry Leaves (Morus alba L.) before and after Frost

In order to determine the molecular mechanism underlying the influence of frost on chemical changes in mulberry leaves, the UFGT activity, expression level, and accumulation of flavonoid glycosides in mulberry leaves (Morus alba L.) were studied. The expression of UFGT gene was investigated by quantitative real‐time PCR (qRT‐PCR) and the UFGT activity, accumulation of flavonoid glycosides was studied by high performance liquid chromatography. Then, the correlation between the expression level of UFGT, the UFGT activity, and the flavonoid glycosides accumulation with temperature was explored. The accumulation of isoquercitrin and astragalin is significantly positively correlated with UFGT gene expression and UFGT activity. On the contrary, the average temperature was significantly negatively correlated with the level of UFGT gene expression and UFGT activity. The results show that after frost, low temperature can induce the expression of UFGT gene in mulberry leaves, resulting in the accumulation of flavonoid glycosides.     

蒺藜苜蓿糖基转移酶基因SMALL AND EMERALD1的克隆和功能研究

类黄酮代谢对于植物生长发育和植物-环境互作至关重要,其中糖基转移酶介导的糖基化修饰在类黄酮代谢中发挥着重要作用。为了研究蒺藜苜蓿中糖基转移酶的生物学功能,通过定向筛选蒺藜苜蓿Tnt1逆转座子插入突变体库,获得了一类植株矮小、叶片深绿的突变体small and emerald1 (se1)。通过基因表型连锁性分析成功克隆了SE1基因,该基因编码1个糖基转移酶,与拟南芥中调控类黄酮生物合成的AtUGT84A1氨基酸同源性为52.8%。对野生型和se1突变体叶片的类黄酮含量进行测定发现类黄酮总量在se1突变体中显著降低(P<0.01)。进一步研究发现在se1突变体中类黄酮合成途径关键基因CHS、F3H和F3’H表达水平下降。亚细胞定位显示SE1可能在细胞质和细胞核中发挥生物学功能。研究表明糖基转移酶基因SE1可能参与蒺藜苜蓿类黄酮合成代谢调控,进而影响其生长发育。此外,研究还发现SE1基因对于叶绿素合成可能具有负向调控作用。     

草莓FaWRKY70克隆与表达模式分析

【目的】深入解析WRKY70同源基因在草莓响应胁迫过程中的作用,为草莓分子育种提供新的基因资源。【方法】采用同源克隆法从草莓果实及叶片中克隆得到草莓WRKY70基因,利用生物信息学分析方法分析该基因理化性质、蛋白质结构、进化关系等,并结合qRT-PCR数据分析其表达模式。【结果】FaWRKY70基因全长为1 020 bp,编码339个氨基酸;比对得到的同源基因中,FaWRKY70与苹果、牡丹等同科物种氨基酸序列相似度较高,且同源基因大多与植物对生物和非生物胁迫的响应相关,暗示FaWRKY70可能参与草莓抵御胁迫的过程;FaWRKY70在草莓的花、果实、叶片、根、茎中均有表达,在花中表达量最高,果实中最低;在水杨酸处理后,FaWRKY70基因能够快速响应,表达量在3 h后达最高,随后逐渐降低。使用茉莉酸甲酯处理时FaWRKY70基因受诱导响应程度较小,整体呈现下调趋势。【结论】FaWRKY70能通过不同响应方式参与草莓生命活动及激素信号转导过程。