中华绒螯蟹水通道蛋白11基因克隆及表达分析

为研究水通道蛋白11基因(AQP11)在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)生长蜕壳过程中的功能作用,采用RACE技术克隆获得中华绒螯蟹水通道蛋白11基因cDNA全长序列.该序列总长为1 746bp,5'端和3'端非编码区分别为463 bp和476 bp,开放阅读框为807 bp,推测编码268个氨基酸,预测分子量29.46 kDa,理论等电点为5.38.生物学信息分析表明,AQP11含有4个跨膜区(第62～84,第159～181,第194～216,第231～250)和2个NPV单元,属于稳定蛋白;同源性和进化树分析表明,中华绒螯蟹AQP11氨基酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的同源性最高(82.0％),与凡纳滨对虾的聚为一支,与甲壳动物的亲缘关系最近.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的检测显示,AQP11基因在中华绒螯蟹各组织中均有表达,其中在肠道中表达量最高,其次是脑、肌肉和胸神经节,在肝胰腺、鳃和血中表达量最低.研究发现,AQP11基因在中华绒螯蟹肠道中的表达呈现,在蜕壳间期(C期)和蜕壳前期(D期)过程中表达量均较低,在蜕壳期(E期)表达量开始上升,蜕壳后期(AB期)表达量不变.AQP11基因在肌肉中的表达呈现,蜕壳间期(C期)表达量低,蜕壳前期(D期)表达量开始上升,蜕壳期(E期)达到峰值,随后到蜕壳后期(AB期)下降.研究结果表明,中华绒螯蟹AQP11基因在其蜕壳过程中发挥着重要的作用.     

中华绒螯蟹亲蟹的饥饿代谢研究

1998年 10～ 12月 ,对体重为 5 4 .5 9(± 2 .37) g的亲蟹在 2 0 (± 0 .5 )℃温度条件下进行饥饿实验 ,研究了饥饿对中华绒螯蟹亲蟹代谢的影响 .结果表明 ,经过 30d的饥饿处理 ,亲蟹的耗氧率降低为摄食状态的 5 0 .0 % ;CO2 排出率减小为摄食状态的 6 3.4 % ;NH3 N排泄率减小为 5 9.1% .耗氧率和CO2 排出率、NH3 N排泄率的变化差别较大 ,耗氧率的减小可分为 4个阶段 ,而CO2 排出率和NH3 N排泄率的减小仅可分 3个阶段 .与此同时 ,亲蟹的标准代谢水平同样受到饥饿的影响 ,饥饿 30d后 ,由 4 .4 5J·g-1·h-1减小为 2 .36J·g-1·h-1;在饥饿亲蟹的代谢中 ,脂肪消耗最多 ,其次是碳水化合物 .     

中华绒螯蟹遗传变异的RAPD分析

用31个可重复性好的随机引物对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的辽河、瓯江和长江种群进行了RAPD分析。121个扩增片段中有27个多态片段。遗传距离指数（D）表明中华绒螯蟹种内遗传变异较低(D=0.004～0.063)。3个种群中,辽河种群(D=0.018)和瓯江种群(D=0.025)遗传变异较高,而长江种群遗传变异较低(D=0.013);辽河种群和瓯江种群间遗传距离(D=0.023)小于它们与长江种群间的遗传距离(D值分别为0.028和0.032)。提示人类经济活动可能已使这2个种群发生了基因交流。     

中华绒螯蟹消化道组织学及扫描电镜研究

对中华绒螯蟹成蟹消化道各段进行了光镜组织学结构的观察;应用扫描电镜技术,观察了中华绒螯蟹消化道各段黏膜上皮表面超微结构特征。结果表明：除中肠及后盲囊外,整个消化道黏膜上皮表面均有较厚的分泌物层和较发达的纤毛层。纤毛形态结构各异;以食道和后肠分布最密,胃和肠球次之。消化道各段黏膜上皮细胞表面均形成大小不一、形态各异的多级皱褶和嵴。仅中肠表面具典型微绒毛结构。各消化道段黏膜上皮表面均未见杯状细胞,上皮下基膜发达,黏膜下层明显,消化腺分布其间。整个消化道壁的肌层均为横纹肌,且排列疏松,外膜多为浆膜。     

中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹两地理亚种的线粒体DNA序列变异

根据线粒体16SrDNA的PCR／RFLP鉴定和对Cyt b基因全序列的分析对中国大陆7水系绒螯蟹地理种群的遗传分化进行探讨。结果表明：中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹两亚种在17条Cyt b全序列上以40个固定的碱基变异位点相区别。前者分布在瓯江及其以北的水系;后者主要分布在瓯江及其以南的水系。发现了4种在鸭绿江以南的北方水系中生活的合浦亚种单元型,对这些单元型的形成提出了3种可能的解释[动物学报51（5）：862—866,2005]。     

中华绒螯蟹同工酶的研究

中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)(Milne,Edwards)俗称河蟹,是我国重要的经济蟹类,有关河蟹同工酶的研究迄今为止国内外尚无报道,为了弥补这一空白,作者对中华绒鳌蟹的醋酶(EST)、谷氨酸草酞乙酸转氨酶(GOT)、苹果酸脱氢酶(MDH)三种同工酶进行了电泳分析,研究了同工酶的组织特异性并探讨其基因表达特点,以期为中华绒鳌蟹的种群遗传结构分析,品种的定向选育等提供生物化学指标.       

中华绒螯蟹组蛋白H3基因保守序列的克隆、表达及抗体制备

为了研究组蛋白H3在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)精子发生中的动态特征,采用PCR技术扩增中华绒螯蟹H3基因编码区的DNA片段,将其重组至含有6个His标签序列的原核表达质粒pET-30a(+)上,转化入大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)感受态细胞中,以0.2 mmol/L的异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生pET-30a-H3重组蛋白。SDS-PAGE表明,重组菌成功表达出了分子量约为21 ku的目标蛋白质,融合蛋白以上清和包涵体的形式存在。采用镍柱亲和层析的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备兔抗血清。Western blot结果表明,制备的多克隆抗体具有较好的特异性。至此,成功地克隆了中华绒螯蟹H3编码区基因并制备了多克隆抗体,为进一步研究其在精子发生中的动态特征提供了基础。     

不同水温对中华绒螯蟹胚胎发育的影响

本文研讨了各种人控恒温和自然水温对中华绒螯蟹胚胎发育周期,各发育阶段以及卵裂同步率等的影响,在水温9．6±3．6度到23度之间,中华绒螯蟹的胚胎均能发育;最适发育水温为18－23度,29度以上,胚胎不能发育,变温对胚胎发育有益,胚胎在卵裂阶段对水温特别敏感,水温越高,卵裂虽然越快,但卵裂期同步率越低;胚胎处在自然水温中,经过低温,卵裂期同步率最高。     

中华绒螯蟹的受精生物学（二）

（续１９９８年第１２期第８页）２．２精子入卵卵不仅只许与同种精子结合,并且每枚卵基本上只准与１个精子结合,也就是说,受精除对精卵质量检测外,还必须数量调控。表面附有精子的蟹卵从输卵管下段,通过生殖孔,排出雌蟹体外。这些附在卵上的精子就在卵膜某些物质,...     

不同发育时期中华绒螯蟹血淋巴渗透压的分析

中华绒螯蟹血淋巴渗透压随不同的生长阶段而异;不论是在淡水中,还是在不同盐浓度的海水中,都具有保持血淋巴高渗调节控制的能力。青春期前,6—9月份,血淋巴渗透压自390mOsm/Kg H_2O升至560mOsm/Kg H_2O;青春期后,9—12月份,自555mOsm/Kg H_2O升至656mOsm/Kg H_2O,但12月到翌年3月份却明显下降。雌蟹从淡水移入海水后的血淋巴渗透压调升速度,青春期后是青春期前的三倍左右。     

中华绒螯蟹卵黄形成的研究

中华绒螯蟹的卵黄形成也受各种相关内分泌激素的调控,卵黄的来源虽然是双重的,一方面在蟹卵内由内质网和高尔基体生产卵黄原,然后卵黄原再融合成为卵黄体。另一方面,蟹卵以胞吞方式直接从血淋巴中接纳卵黄原,同时又通过指状小道由卵泡细胞间接接纳卵黄原。肝胰腺可能会产生卵黄原,这些卵黄原随即进入血淋巴内,再直接或间接被蟹卵接纳。     

中华绒螯蟹IAG基因的克隆及生物信息学分析

采用RACE-PCR技术,获得中华绒螯蟹胰岛素样促雄激素腺基因(Es-IAG)全长cDNA序列,并利用相关生物信息学软件对该基因及其蛋白质的结构、理化特性进行生物信息学分析。结果发现,Es-IAG基因序列全长1 392 bp,编码151个氨基酸,Es-IAG多肽的相对分子量为16.61 kD,理论等电点pI为5.08,前体多肽中存在分泌型信号肽,存在两个糖基化位点和16个磷酸化位点,存在两个典型的R**R蛋白酶酶切位点,未发现跨膜结构域。Es-IAG为分泌性蛋白,蛋白需要通过结合细胞膜上的受体而发挥性别调控等作用。对22个近缘物种的IAG基因序列系统进化分析显示,中华绒螯蟹与蓝蟹、拟穴青蟹的亲缘关系较近。为深入研究Es-IAG基因及其蛋白的结构和功能提供了相关依据。     

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因全长cDNA克隆和重组表达

根据实验室分离自中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的一种蜕皮抑制激素(Molting-inhibiting hormone,MIH)N端氨基酸测序结果设计简并引物,采用RACE方法,首次从中华绒螯蟹眼柄中克隆到蜕皮抑制激素基因全长cDNA(Es-MIH,GenBank登录号:DQ341280),该基因全长为1457 bp,开放阅读框为330 bp,编码110个氨基酸(含有35个氨基酸的信号肽);其成熟肽包含C7-C44、C24-C40和C27-C53三个二硫键,有典型的CHH家族结构域。该cDNA编码的氨基酸序列与地蟹(Gecarcinus lateralis)MIH同源性最高,达到了85%。Northern杂交和半定量RT-PCR显示蜕皮间期成体蟹仅在眼柄中有MIH基因表达,提示该基因的表达具有一定组织特异性。利用pCR T7/NT TOPO TA系统重组表达MIH成熟肽,纯化的重组蛋白得率为0.3 g/L,纯化产物经质谱鉴定为中华绒螯蟹MIH。研究解决了CHH家族神经肽在机体中的表达量少,直接纯化较难的问题,为深入研究MIH的作用机制和在生产上控制中华绒螯蟹蜕皮和生长奠定了基础。     

中华绒螯蟹的受精生物学（一）

中华绒螯蟹的精子无尾部,不能运动;其成熟卵为初级卵母细胞,无受精孔,精子可在卵的任何部位穿入卵内,精子入卵主要借顶体反应。虽多精着卵,但仅数精入卵,且单精受精。     

中华绒螯蟹染色体的研究

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis H.Milne Edwards)属甲壳纲(Crustacea)、软甲亚纲(Malacostraca)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae),俗称河蟹,是我国重要的经济蟹类,其形态解剖、生态习性及生理等方面的研究已有报道(Panning,1939;Koch,1952;堵南山,1954,1957,1958;Bauchau,1960;Leersnyder,1966,1967;Dbainaut et al.,1976;Chevigue,1976;Leeranyder et al.,1977,1978;Pequenx et al.,1982;Chapelle et al.,1982;谈奇坤等,1984.),但至今未见有关细胞遗传学方     

不同阶段中华绒螯蟹肝胰腺的脂类及脂肪酸组成

研究了不同发育阶段中华绒螯蟹肝胰腺脂类及脂肪酸组成。结果表明：在卵巢快速发育阶段,肝胰腺数显著下降总脂的含量也略有降低,致使肝胰腺脂类的绝对量有显著的降低。未成熟和成熟中华绒螯的肝胰腺总分别为３４．３７％和２８．１３％。     

中华绒螯蟹血细胞原代培养条件的优化

比较了几种常见血细胞培养基(L-15、2×L-15、3×L-15、M199和RMPI-1640)对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)血细胞原代培养中细胞形态以及存活率的影响,以及在筛选获得的最佳培养基中添加不同比例胎牛血清(FBS)(0%、5%、10%和15%),进一步观察了血清对中华绒螯蟹血细胞培养效果的比较。结果表明,3×L-15培养基培养效果较好,所培养的细胞形态相对完整,数量较多,培养至96 h时血细胞存活率仍大于60%;而其他4种培养基效果较差,培养12 h存活率均低于50%,且细胞形态结构变化明显。以3×L-15培养基为基础,添加不同比例胎牛血清后发现,对细胞存活有显著影响,存活率明显降低。因此,不添加血清的3×L-15培养基对中华绒螯蟹血细胞的生长较为适宜。     

中华绒螯蟹精荚分级分离及其蛋白组分分析

对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)精荚进行分级分离,获得的精液、精荚基质和精子等不同组分,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法,对其可溶性蛋白成分进行比较分析。结果显示,中华绒螯蟹精荚的各个组分均含有其特定的蛋白谱带。经糖蛋白特异染色发现,精液中含3种糖蛋白,精荚基质中含2种糖蛋白。