冠突曲霉Fig基因敲除菌株的构建及表型分析

为了研究冠突曲霉(Aspergillus cristatus) Fig基因的功能,本研究采用同源重组的方法获得敲除株。并对敲除株进行功能验证。结果显示对Fig基因敲除株培养观察并与野生型菌株相比发现,在含有不同浓度NaCl的MYA培养基中,仍能产生成熟的子囊孢子和分生孢子,但分生孢子数量是野生型的1/4,子囊孢子数量是野生型的1/5,且敲除株菌落几乎没有渗出液,无皱褶,菌落表面干燥,色素产生量急剧下降,这些结果表明Fig基因对冠突曲霉产孢起正调控,本实验为冠突曲霉发育调控机制的研究提供了一定的技术基础。     

球孢白僵菌Bb_bm01菌株PacC基因突变体的构建及其毒力和孢子萌发率的测定

通过敲除球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株bm01的PacC基因,研究了PacC基因敲除对球孢白僵菌毒力和分生孢子萌发速率的影响。利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法转化Bb_bm01,通过同源重组敲除Bb_bm01的PacC基因,筛选ΔPacC基因敲除菌株,获得了遗传稳定的ΔPacC基因敲除菌株。通过毒力测定,对比了野生菌株和ΔPacC基因敲除菌株对家蚕和大蜡螟毒力的差异,发现ΔPacC基因敲除菌株对家蚕和大蜡螟毒力都减弱,差异具有统计学意义(p0.01),表明在Bb_bm01菌株中的PacC基因与它的致病性相关;另外,比较ΔPacC基因敲除菌株与野生型菌株Bb_bm01在SDB液体培养基中的孢子萌发率,发现ΔPacC基因敲除菌株孢子萌发明显减慢,表明PacC基因参与调控孢子萌发。     

温度和水活度对冠突散囊菌菌丝生长和产孢的影响

冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是茯砖茶发酵过程中的优势菌。通过调节甘油含量制备具有不同水活度(aw)的培养基,研究培养基水活度、培养温度以及不同温度和水活度组合对冠突散囊菌菌丝生长、分生孢子产生、萌发和菌落形态的影响。供试的冠突散囊菌菌株FZ-2、FZ-3和FZ-4在水活度为0.77～0.99的培养基中均能生长,最适培养基水活度为0.90～0.95。培养基水活度在0.77～0.95范围内有利于菌株FZ-2产生分生孢子,最适水活度为0.83;培养基水活度于0.83～0.95范围内有利于菌株FZ-4产孢;而菌株FZ-3适合产孢的培养基水活度为0.95。菌株FZ-2分生孢子萌发的最适水活度为0.87～0.95。菌株FZ-2适合的生长温度为28～37℃,温度38℃时菌体生长速度下降,至40～45℃时菌丝停止生长;菌株FZ-3和FZ-4最适生长温度均为28℃。在20～37℃条件下菌株FZ-2均能产生分生孢子,最适产孢温度为37℃;菌株FZ-3在28～37℃范围内产生分生孢子;菌株FZ-4在20～37℃内产生分生孢子,最适产孢温度为37℃。菌株FZ-2分生孢子可以在较宽的温度范围内(20～40℃)萌发,最适温度为25～33℃。研究结果表明不同水活度-温度组合对菌株FZ-2菌丝生长和菌落形态产生显著的影响,与温度作用相比,水活度的影响更为明显。本研究证明了冠突散囊菌适合在干燥的茶叶中生长和繁殖,为解释其在茯砖茶加工过程中的优势地位提供理论依据,研究结果也将促进茶叶发酵菌剂的开发利用和砖茶的标准化生产。     

一株产赭曲霉毒素A黑曲霉的筛选与鉴定

【目的】筛选出可产生赭曲霉毒素A (OTA)的霉菌菌株。【方法】利用CYA和YES培养基从实验室32个霉菌样品中筛选目的菌株。利用高效液相色谱-荧光检测法对OTA产生菌进行初筛,利用高效液相色谱-质谱联用对OTA初筛菌株进行复筛。通过菌落形态、菌丝及分生孢子形态、ITS DNA序列、β-Tubulin基因序列及Calmodulin基因序列分析等鉴定目的菌株。【结果】得到一株OTA产生菌株1062,该菌株能在25 °C条件下,在CYA、YES和CA培养基中很好生长。结合形态学、对培养基的要求以及上述3个基因序列的进化树分析,该菌株属于黑曲霉(Aspergillus niger)。【结论】菌株1062具有OTA产生能力,是一株黑曲霉。     

FgβNAC基因对禾谷镰刀菌生长发育及致病性的影响

以裂殖酵母NAC蛋白β亚基为对象在禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)基因组数据库中进行搜索,发现了同源蛋白基因FGSG 08675并命名为FgβNAC.通过基因敲除技术对禾谷镰刀菌FgNAC基因进行敲除和回补,分别获得了敲除菌株fgβnac和回补菌株fgβnac::FgβNAC,并分别对野生型菌株、敲除菌株和回补菌株进行了表型和致病性研究.结果表明,与野生型菌株PH-1相比,敲除菌株fgβnac在固体马铃薯培养基(PDA)上生长速率明显减慢,约为野生型菌株的一半,气生菌丝致密短小;同样在液体PD培养液中培养3d的敲除突变株的菌丝干重仅为野生型的56％.另外,敲除突变株的分生孢子产量相比野生型菌株下降了78.5％.进一步采用麦穗离体接种法对其致病性进行了检测,发现FgβNAC基因的缺失引起致病力显著地下降,仅局限于接种部位及邻近的小颖,而无法侵入维管束组织引起穗枯症状.     

尖孢镰刀菌亚麻专化型Folprp4基因参与调控菌丝生长和分生孢子发生

目的: 通过对尖孢镰刀菌中Folprp4基因的鉴定,揭示其在尖孢镰刀菌中的功能及致病相关性。方法: 基于同源重组原理,根据测定出的Folprp4基因序列,应用Split-Marker重组技术构建含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒。将基因缺失盒经PEG介导转化到野生型原生质体中,在含有潮霉素B的TCC培养基上筛选转化子,通过PCR正负筛查获得Folprp4基因缺失突变株(ΔFolprp4)。构建含有Folprp4基因的载体pZDH1,并将其转化到敲除突变体中进行互补测验。结果: 与野生型(hm)和异位插入突变体(ecFolprp4)相比,敲除突变体菌丝生长受到严重阻碍,当野生型和异位插入突变体长满整个平板时,敲除突变体菌落呈小点状。敲除突变体的另一个显著变化是ΔFolprp4的分生孢子产量显著下降。侵染实验表明,ΔFolprp4对亚麻幼苗的毒力显著降低。互补实验表明,该互补载体的回复子(Folprp4-C)在菌落形态、生长速率、分生孢子产量和毒力方面均恢复到了野生型菌株。结论: Folprp4基因与尖孢镰刀菌的菌丝生长、分生孢子发生和致病性有关。     

谢瓦氏曲霉间型变种esdC基因的功能分析

为了研究谢瓦氏曲霉间型变种esd C基因的功能,构建该基因的敲除载体,通过农杆菌介导转化及筛选获得敲除突变体,并对突变体的形态进行了初步分析。生物学特性显示:△esd C突变子的子囊结构与野生型相似,子囊孢子均为球形或近球形,无性发育也与野生型无显著差异。但是,在MYA培养基上培养14d后,△esd C突变体菌落的渗出液相对野生型较少,且无皱褶,菌落表面干燥。这些结果表明esd C基因的缺失对孢子结构的影响不显著,为谢瓦氏曲霉间型变种有性调控机制的研究奠定了技术基础。     

黄曲霉分生孢子色素合成基因pks1的鉴定及其对生长发育和侵染性的影响

【目的】分生孢子色素是真菌细胞壁的重要成分,对真菌的生长发育极为重要,并有助于真菌抵御各种环境胁迫。本研究鉴定了黄曲霉分生孢子色素合成基因,并研究了分生孢子色素对黄曲霉生长发育及其对抗紫外照射和侵染能力的影响。【方法】通过已知真菌孢子色素合成基因蛋白序列同源比对确定了黄曲霉分生孢子色素合成基因及其所在的基因簇,利用同源重组策略对目标基因进行敲除,获得了该色素合成基因缺失的突变菌株,并研究该基因敲除后对表型、产孢、菌核形成、黄曲霉毒素产生、抗紫外照射和侵染性等影响。【结果】与野生型菌株相比,黄曲霉pks1基因缺失菌株的分生孢子颜色变为白色,生长速度、孢子产量、菌核形成和黄曲霉毒素B_1的产生均没有显著性变化,但该基因的缺失导致孢子对紫外线照射的抵御能力明显减弱,降低了黄曲霉对玉米和花生种子的侵染能力。【结论】pks1(AFLA_006170)基因是黄曲霉分生孢子色素合成的关键基因,影响黄曲霉分生孢子对紫外线照射等不利环境因子的抵抗能力和对粮食种子的侵染能力。     

粉被虫草无性型单孢子株间和单孢子株内的营养亲和性

在含5％氨酸钾的KMM和KPS培养基上,粉被虫草无性型以3种途径产生不利用硝酸盐的突变株（nit突变株）。（1）由菌落基质菌丝形成的快速生长气生菌丝角变;（2）菌落表面快速生长的气生菌丝;（3）菌落基质菌丝缓慢生长形成的基质菌丝角变。来自18个单孢子株的94个nit突变株中,64.8％的突变株是稳定的。配对试验结果表明:在全部19个配对中,单孢子株内配对率为57.9％,单孢子株间配对率为42.1％。在全部nit突变株中,Cp-14c3突变株与其它突变株间的配对率最高（18.2％）。单孢子株间配对率高的孢子株是Cp-14Cp-7,Cp-5和Cp-6,将来自Cp-14同一单孢子株的Cpe-14C3分别与Cp-14cl和Cp-14c4nit突变株配对后发现,它们形成的浓密生长配接线的颜色是不相同的,前者橙色,后者白色。统计结果发现,所试全部的单泡子株可分成11个营养亲和群（VCGs）,那些含有易与其它菌株配对的nit突变株的单孢子株,如Cp-1,Cg-4,Cp-5,Cp-6,Cp-7,Cp-13,和Cp-14等皆在同一营养亲和群内。用Hochest33258荧光染色观察发现,野生型菌株的菌丝和分生孢子单核,nit突变株的少量分生孢子中可见双核,互补配对形成的浓密菌丝丛中的分生孢子则常见双核。     

冠突散囊菌nsdD基因超表达菌株的构建及表型分析

为了研究冠突散囊菌nsdD基因的功能,本研究将冠突散囊菌nsdD的cDNA置于强启动子三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA下游及色氨酸合成酶C基因终止子TtrpC上游构建nsdD基因超表达载体PURT5750,采用根癌农杆菌介导方法将表达质粒PURT5750转化到冠突散囊菌进行功能验证。结果显示向基因组随机插入外源质粒DNA,随机挑选11个nsd D基因超表达转化子,对nsdD基因超表达转化子菌株培养观察并与野生型菌株相比发现,在5%和17%NaCl培养基中菌落差异不显著,而且仍能产生成熟的有性孢子。本实验为冠突散囊菌有性发育调控机制的研究提供了技术基础。     

烟曲霉FADB基因参与菌株耐药的潜在机理

FAD结合的氧化还原酶编码基因FADB (GenBank ID:Afu4g14630)的编码产物在烟曲霉中为一种与FAD结合的氧化还原酶,可能参与真菌的呼吸。为了探究其具体功能,本研究通过克隆烟曲霉FADB基因,构建烟曲霉FADB基因的敲除株,了解该基因对烟曲霉药物敏感性、渗透压、氧化压力物质敏感性的作用机理。采用高通量基因替换方法构建出FADB基因的敲除盒,筛选出符合的烟曲霉FADB敲除株ΔFADB。观察该突变株与野生株AF293对药物敏感性、氧化压力、渗透压物质敏感性的变化。利用E-test法检测ΔFADB对3种唑类药物(泊沙康唑、伊曲康唑、伏立康唑)的敏感性,结果证实ΔFADB对泊沙康唑的敏感性明显提高。在渗透压和氧化压力的培养试验中,与野生株AF293相比较,ΔFADB对氧化剂D-山梨醇和甲萘醌更敏感。加入泊沙康唑后,ΔFADB比野生株AF293产生的活性氧更多。说明烟曲霉FADB基因参与泊沙康唑抗烟曲霉机制并起到一定作用,该基因诱导的氧化应激反应可能是抗真菌药物杀伤真菌的作用机制之一,本研究为烟曲霉唑类耐药机制的研究提供了新的理论基础。     

rpoS基因在肠杆菌CGMCC 5087响应环境胁迫中的功能

[背景]苯乙醇(2-Phenylethanol,2-PE)是一种具有玫瑰香气味的高级香料添加剂,被广泛应用于香水、化妆品、食品和医药等领域.目前,利用工程菌合成苯乙醇有很好的应用前景.我们分离到一株肠杆菌(Enterobactersp.)CGMCC 5087,其可以通过苯丙酮酸途径合成2-PE.然而该菌的生长受到不同环...     

我国首例Paraconiothyrium cyclothyrioides感染致眼内炎的相关研究

目的报道我国首例由Paraconiothyrium cyclothyrioides引起的真菌性眼内炎,并分析其生物学特征、感染途径及治疗方法。方法通过形态学鉴定、生长温度试验、ITS测序等方法对我院1株眼外伤患者左眼前房沉积物中培养分离到的丝状真菌进行鉴定。结果该丝状真菌在PDA平板上在25℃生长快速,可见灰橄榄色周边有白色绒毛状菌落,表面皱褶,35℃生长缓慢,可见黄豆大小白色凸起菌落;25℃及35℃培养后镜下可见大量结节状菌丝,未见分生孢子,属于不产孢株;ITS测序结果为Paraconiothyrium cyclothyrioides。结论本病例是国内首次报导的由Paraconiothyrium cyclothyrioides引起的真菌性眼内炎。     

产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因（CgGPD）功能分析

【目的】从高产甘油生产菌株产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）基因组中克隆了NAD+依赖3-磷酸甘油脱氢酶编码基因（CgGPD）,但是该基因及其上游调控序列具体的功能还是未知的。本文研究了CgGPD基因及其上游调控序列的功能。【方法】本文以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）及其渗透压敏感型突变株为宿主,构建3种不同的酵母表达载体导入酵母细胞,研究了不同酵母转化子在渗透压胁迫条件下CgGPD基因表达对细胞的耐高渗透压胁迫应答及其细胞的甘油合成能力的影响。【结果】实验结果表明无论是以来源于S. cerevisiae 的TPI启动子还是来源于CgGPD基因的启动子,过量表达CgGPD基因的转化子均能够显著加速葡萄糖消耗速度和提高甘油合成能力,在gpd1/gpd2突变株中表达CgGPD基因能够消除细胞对外界高渗透压的敏感性,同时转化子胞内甘油大量积累。【结论】CgGPD基因在野生型酵母S. cerevisiae W303-1A表达显著提高细胞的甘油合成能力,在gpd/1gpd2突变株中能够互补GPD1基因的功能,CgGPD基因表达受渗透压诱导 调控。     

Aspergillus fumigatus adhesion factors in dormant conidia revealed through comparative phenotypic and transcriptomic analyses

Aspergillus fumigatus is an important fungal pathogen of humans. Inhaled conidia of A. fumigatus adhere to pulmonary epithelial cells, causing opportunistic infection. However, little is known about the molecular mechanism of the adherence of resting conidia. Fungal molecules adhesive to host cells are presumed to be displayed on the conidial surface during conidial formation as a result of changes in gene expression. Therefore, we exhaustively searched for adhesion molecules by comparing the phenotypes and the gene expression profiles of A. fumigatus strains that have conidia showing either high or low adherence to human pulmonary A549 cells. Morphological observation suggested that strains that produce conidia of reduced size, hydrophobicity, or number show decreased adherence to A549 cells. K‐means cluster analyses of gene expression revealed 31 genes that were differentially expressed in the high‐adherence strains during conidial formation. We knocked out three of these genes and showed that the conidia of AFUA_4G01030 (encoding a hypothetical protein) and AFUA_4G08805 (encoding a haemolysin‐like protein) knockout strains had significantly reduced adherence to host cells. Furthermore, the conidia of these knockout strains had lower hydrophobicity and fewer surface spikes compared to the control strain. We suggest that the selectively expressed gene products, including those we identified experimentally, have composite synergistic roles in the adhesion of conidia to pulmonary epithelial cells.     

Proteomic analysis of responses to osmotic stress in laboratory and sake-brewing strains of Saccharomyces cerevisiae

The difference in responses to osmotic stress between the laboratory and sake-brewing strains of Saccharomyces cerevisiae at the translational level was compared by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Proteins, whose production was significantly changed by the osmotic stress, were identified by peptide mass fingerprinting. In the laboratory strain, translation of Hor2p, the protein responsible for glycerol biosynthesis, and Ald6p, related to acetate biosynthesis, was induced under high osmotic pressure conditions. In addition, production of proteins related to translation and stress response was also changed under this condition. On the other hand, in the sake-brewing strain, translation of Hor2p, Hsp26p, and some stress-related proteins was upregulated. The change in the production of enzymes related to glycolysis and ethanol formation was small; however, the production of enzymes related to glycerol formation increased in both strains. These results suggest that enhancement of glycerol formation due to enhancement of the translation of proteins, such as Hor2p, is required for growth of S. cerevisiae under high osmotic pressure condition. This is the first report on the analysis of responses of a sake-brewing strain to high osmotic pressure stress based on proteomics.     

人参(Panax ginseng)根系分泌物成分对人参致病菌的化感效应

采用室内培养结合生物学测定的试验方法,研究了不同浓度人参(Panax ginseng)根系分泌物成分苯甲酸、邻苯二甲酸二异丁酯、十六酸和2,2-二(4-羟苯基)丙烷对人参立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、黑斑菌(Alternaria panax)、疫病菌(Phytophthora cactorum)、菌核菌(Sclerotinia schinseng)、锈腐菌(Cylindrocarpon destructans)和绿色木霉菌(Trichoderma viride)菌落生长及孢子萌发的化感效应.结果显示,不同浓度人参根系分泌物成分对人参致病菌及绿色木霉菌的化感效应存在显著差异.苯甲酸浓度与人参立枯丝核菌、菌核菌和锈腐菌菌落生长以及人参黑斑菌、锈腐菌孢子萌发呈负相关,与人参黑斑菌、绿色木霉菌菌落生长呈正相关;对人参疫病菌菌落生长的化感效应表现为低浓度和高浓度抑制,中浓度促进.邻苯二甲酸二异丁酯浓度与人参立枯丝核菌、黑斑菌、菌核菌和绿色木霉菌菌落生长以及人参黑斑菌孢子萌发呈负相关;对人参锈腐菌菌落生长和孢子萌发表现为低浓度和高浓度抑制,中浓度促进;对人参疫病菌菌落生长表现为低浓度和中浓度抑制,高浓度促进.2,2-二(4-羟苯基)丙烷浓度与人参立枯丝核菌、黑斑菌、疫病菌、绿色木霉菌菌落生长以及人参黑斑菌、锈腐菌孢子萌发呈负相关;对人参菌核菌、锈腐菌菌落生长表现中浓度促进,高浓度抑制.十六酸浓度与人参锈腐菌、疫病菌和绿色木霉菌菌落生长呈正相关,与人参锈腐菌孢子萌发呈负相关,对黑斑菌孢子萌发表现为中浓度抑制.4种根系分泌物的等量混合物浓度与人参致病菌及拮抗木霉菌菌落生长速率呈负相关.     

Involvement of the reserve material poly-beta-hydroxybutyrate in Azospirillum brasilense stress endurance and root colonization

When grown under suboptimal conditions, rhizobacteria of the genus Azospirillum produce high levels of poly-beta-hydroxybutyrate (PHB). Azospirillum brasilense strain Sp7 and a phbC (PHB synthase) mutant strain in which PHB production is impaired were evaluated for metabolic versatility, for the ability to endure various stress conditions, for survival in soil inoculants, and for the potential to promote plant growth. The carbon source utilization data were similar for the wild-type and mutant strains, but the generation time of the wild-type strain was shorter than that of the mutant strain with all carbon sources tested. The ability of the wild type to endure UV irradiation, heat, osmotic pressure, osmotic shock, and desiccation and to grow in the presence of hydrogen peroxide was greater than that of the mutant strain. The motility and cell aggregation of the mutant strain were greater than the motility and cell aggregation of the wild type. However, the wild type exhibited greater chemotactic responses towards attractants than the mutant strain exhibited. The wild-type strain exhibited better survival than the mutant strain in carrier materials used for soil inoculants, but no difference in the ability to promote plant growth was detected between the strains. In soil, the two strains colonized roots to the same extent. It appears that synthesis and utilization of PHB as a carbon and energy source by A. brasilense under stress conditions favor establishment of this bacterium and its survival in competitive environments. However, in A. brasilense, PHB production does not seem to provide an advantage in root colonization under the conditions tested.     

利用抑制性差减杂交技术鉴定谢瓦氏曲霉间型变种产孢相关的基因

谢瓦氏曲霉间型变种Aspergillus chevalieri var.intermedius俗称"金花菌",是茯砖茶发酵中的优势菌种,该菌在不同的渗透压胁迫下产生不同类型的孢子。采用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),以低渗条件下产生的子囊孢子和高渗条件下产生的分生孢子为材料分别与营养菌丝体构建两个正反向文库。每个库随机挑选400个阳性克隆进行测序。然后将所得到的基因片段在GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对,筛选出的差异表达的基因涉及蛋白质代谢、细胞代谢、转录调控等多个方面,其中可能参与有性产孢调控的基因有13条,可能参与无性产孢调控的基因有10条。