前导肽切割位点对Ⅱ类羊毛硫细菌素切割酶活性的影响

【背景】Ⅱ类羊毛硫细菌素大多是由革兰氏阳性菌的核糖体合成并经过翻译后修饰产生的小肽,其生物合成的最后一步是由转运蛋白LanTN端的肽酶结构域对前导肽进行切割,释放出有活性的羊毛硫细菌素,但目前关于该类羊毛硫细菌素前导肽的切割机制尚不清楚。【目的】考察前导肽切割位点对不同链球菌来源的肽酶结构域BovT150和SboT150酶切活性的影响。【方法】运用不依赖连接酶的定点突变技术构建前导肽切割位点突变的前体蛋白表达载体,在大肠杆菌(Escherichia coli)中分别表达纯化野生型前体(Bov Am和Sbo Am)、突变型前体及对应的切割酶(Bov T150和Sbo T150),构建体外酶切体系,利用HPLC、抑菌活性分析和MALDI-TOF MS检测前导肽的切除情况。【结果】BovT150不仅能够切割Bov Am的GG和GA位点,也能切割Sbo Am的GG和GA位点,并且对切割位点为Gly的前体切割活性较高;Sbo T150仅能切割Sbo Am的GG和GA位点,而对切割位点为Ala的活性较高。【结论】II类羊毛硫细菌素前导肽切割位点氨基酸残基的改变不同程度地影响切割酶的切割效率。     

棒状链霉菌中隐性羊毛硫肽CLA 124的半体外生物合成

摘要:【目的】利用半体外生物合成方法获得棒状链霉菌中的隐性羊毛硫肽,为放线菌中羊毛硫肽资源的挖掘提供借鉴。【方法】利用nisin修饰系统,在大肠杆菌(Escherichia coli)中对隐性羊毛硫肽的核心肽进行体内修饰。修饰后产物经亲和层析和高效液相色谱(HPLC)纯化后,体外酶切反应切除前导肽,利用MALDITOFMS检测核心肽的脱水情况,并结合二级质谱解析其成环结构。【结果】获得了新的羊毛硫肽CLA 124,其核心肽脱去了4分子水,并形成2个硫醚键和一个二硫键。【结论】半体外生物合成方法可用于放线菌来源隐性羊毛硫肽的资源挖掘。     

放线菌来源的羊毛硫肽研究进展

羊毛硫肽(lanthipeptide)是一类由核糖体合成并经翻译后修饰的含羊毛硫氨酸或β-甲基羊毛硫氨酸的多肽。近年来,放线菌来源的羊毛硫肽因其突出的抗菌活性和罕见的生物活性而备受关注。本文重点对放线菌来源的不同类型的羊毛硫肽的结构特征及其特性进行了综述,讨论了生物或化学方法修饰天然羊毛硫肽和基因组挖掘发现结构新颖的羊毛硫肽在开发符合实际应用需求的放线菌来源的羊毛硫肽中的应用,并对放线菌来源的羊毛硫肽的应用潜力进行了总结和展望。     

羊毛硫肽类化合物(Lanthipeptide)生物合成新进展

羊毛硫肽化合物(Lanthipeptides)是由核糖体合成并经过翻译后修饰得到的一大类肽类天然产物。这类化合物广泛的产生于不同种类的细菌,具有丰富的结构和生物活性多样性,为活性药物研究和开发提供重要的来源。本文综述了近几年来羊毛硫肽化合物生物合成进展,从其合成酶结构,进化机制,区域和立体选择性控制等方面进行了简要的讨论,展示了羊毛硫肽类化合物生物合成中特殊而迷人的酶学机制。     

Nisin生物合成有关基因的遗传分析

乳链菌肽（ｎｉｓｉｎ）是某些乳酸乳球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）产生的细菌素,是目前发现的各种细菌素中最重要的一种。因其具有较大经济价值而研究最为深入。有关它的理化性质及其应用已有文献报道［１,３］。细菌素这类抗菌物质都是多肽或蛋白质,有分子量小,且结构复杂的特点。Ｋｌｅａｎｈａｍｍｅｒ等［４］依据细菌素的分子量大小,热稳定性及修饰氨基酸等因素,把乳酸菌产生的抗菌蛋白质分为三类：（１）热稳定的小肽（２）热敏感的大蛋白质（３）修饰性多肽。它们的生物合成方式有核糖体合成和非核糖体合成两种。ｎｉｓｉｎ属于修饰性多肽细菌素,羊毛硫细菌素（Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）的一种,由核糖体合成。对它的研究已从初期的理化性质深入到分子遗传学水平。本文重点介绍ｎｉｓｉｎ的生物合成有关基因的遗传分析     

GP73及其糖基化修饰对肝癌细胞HepG2炎症相关分子信号通路的影响

目的:通过构建高尔基体膜蛋白73(GP73)氨基酸序列109、144位糖基化位点双突变真核表达质粒,研究GP73及其糖基化修饰对肝癌细胞炎症相关分子信号通路的影响。方法:根据GP73的DNA序列,设计合成2对针对GP73氨基酸序列109、144位糖基化位点突变的PCR引物,以本实验室构建的野生型质粒pc DNA3-Flag-GP73为模板,构建GP73的109、144位糖基化位点双突变质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM);用脂质体将此双突变质粒转染293T细胞,用糖蛋白染色和免疫印迹检测该质粒在细胞中的表达情况,用双萤光素酶报告基因实验检测GP73及其糖基化修饰对Hep G2细胞中NF-κB转录激活的影响。结果:糖蛋白染色和免疫印迹结果证实构建的双突变质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM)能够表达GP73双糖基化位点突变的蛋白,且糖基化位点的突变使GP73的糖基化修饰完全缺失;双萤光素酶报告基因实验结果表明,野生型GP73能够激活Hep G2细胞中NF-κB的转录活性,而双糖基化位点突变会使GP73失去此激活作用。结论:构建了GP73双糖基化位点突变的真核表达质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM)。GP73参与激活肝癌细胞炎症信号通路,糖基化修饰对于GP73发挥此作用是必不可少的。     

羊毛硫细菌素及其应用

由基因编码、在核糖体上合成的抗菌多肽广泛分布于自然界中。人、动物、昆虫、植物和微生物都可以产生。这些抗菌多肽在食品防腐保鲜以及在药物治疗和医治肿瘤、癌症方面的潜力引起人们极大的关注［１］。近１０年来,原核生物和真核生物产生的抗菌多肽成为人们研究的热点,并取得飞速进展［１－４］。本文将主要介绍革兰氏阳性细菌产生的羊毛硫细菌素的结构、性质、生物合成,作用机制及应用。１什么叫羊毛硫细菌素由细菌基因编码、在核糖体上合成的抗菌多肽叫作细菌素。它是由某些细菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌生物活性的多肽…     

人线粒体tRNA修饰碱基与遗传性脑肌病

人的多种遗传疾病与线粒体tRNA基因突变有关,这些突变导致疾病发生的分子机理是当前研究的热点.通过研究线粒体tRNA分子上的碱基修饰情况,人们发现了一类特殊的带有牛磺酸衍生物基团的修饰,这类修饰主要位于线粒体tRNALys和线粒体tRNALeu(UUR)反密码子第一位摆动(wobble)位点的碱基上.最近的研究表明,位于这两种线粒体tRNA基因上的多种突变与遗传性脑肌病相关,包括A8344G,A3243G,T3271C等等,它们可以导致tRNA上相应摆动位点的碱基修饰缺失.无论是在体外培养的带有相应突变的细胞内,还是在来源于脑肌病病人的组织中,科学家都发现了相同的线粒体tRNA碱基修饰缺陷.通过分子手术证实,此类碱基修饰对于维持这两种tRNA的反密码子与mRNA上相应密码子的相互识别至关重要,缺失了这种修饰的tRNA将无法识别一些对应的密码子.通过进一步的实验,人们还鉴定出负责催化此类碱基修饰的酶.这些研究不但揭示了线粒体遗传性脑肌病相关突变的致病机理,也将为研究基因治疗提供可能的新手段.     

羊毛硫抗生素研究进展

羊毛硫抗生素(lantibiotics)是一类独特的肽抗生素,具有广泛的化学结构多样性,含有罕见的羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸。羊毛硫抗生素前体肽需经过复杂的翻译后修饰、转运、引导肽切除等加工后才能形成具有活性的抗生素,其独特的作用方式,也是人们一直关注的焦点。对羊毛硫抗生素的结构特点、分类、生物合成、发挥生物活性时的作用方式等进行了综述。     

SGTA基因及其蛋白的生物信息学分析

[目的]对SGTA基因及其蛋白的结构和特征进行生物信息学分析,为研究SGTA与肿瘤形成和发展的相关性提供理论基础。[方法]运用生物信息学数据库和软件对SGTA基因的结构、单核苷酸多态性位点(SNP)、SGTA基因与其他基因的相互作用网络、SGTA蛋白的理化性质、二级结构、蛋白结构域、蛋白翻译后修饰、蛋白质之间相互作用网络进行分析。[结果]人SGTA基因有5种可变剪接产物,编码区存在78个SNP位点,其中错义突变31个,无义突变1个。人SGTA蛋白由313个氨基酸组成,是稳定性不高的亲水蛋白,α-螺旋是其主要二级结构元件,属于TRP超家族,预测有3个磷酸化激酶修饰位点和数个潜在泛素化修饰位点。与SGTA存在相互作用的基因和蛋白多数与维持体内蛋白质稳定的分子伴侣功能相关。[结论]SGTA基因及其蛋白的生物信息学分析为进一步实验研究其在肿瘤形成和发展中的地位及调控机制奠定了基础。     

人副流感病毒3型HN糖蛋白N-糖链的功能研究

为了研究人副流感病毒3型(hPIV3)HN糖蛋白N-糖链的功能,采用基因定点突变技术构建糖基化位点突变体,然后检测各突变株的蛋白电泳速率、细胞表面表达量、受体结合活性、神经氨酸酶活性和促细胞融合活性。HN分子的G1、G2、G3和G4 4个糖基化位点分别和联合突变后发现G1、G2和G4及其联合突变株(G12、G14、G24和G124)电泳速率加快,而G3突变株电泳速率没有变化。各突变株的表达效率,神经氨酸酶活性与野毒株相比差别无统计学意义(P>0.05),但受体结合活性和促细胞融合活性均有不同程度的降低(P<0.05)。G1、G2和G4位点突变后受体结合活性分别为突变前的83.94%、76.45%和55.32%,而促细胞融合活性降为突变前的80.84%、77.83%和64.16%。联合突变株G12、G14、G24和G124血吸附活性进一步降低,为突变前的33.07%、20.67%、19.96%和15.11%,促细胞融合活性进一步降低为突变前的46.36%、12.04%、13.43%和4.05%。结果表明:hPIV3HN糖蛋白的糖链对HN糖蛋白的受体结合活性和促细胞融合活性有重要影响,推断糖链的丢失可能会引起HN糖蛋白头部结构(受体结合活性位点所在区域)或者方向的改变或者无法与宿主细胞膜表面的凝集素受体(一种与N-糖链结合的受体)结合,进而导致受体结合活性和促细胞融合活性的降低。     

Salmonella enteric硫修饰蛋白DptC半胱氨酸定点突变对Dnd表型的影响

[目的]Salmonella enterica serovar Cerro 87是具有硫修饰现象即Dnd表型的细菌之一,其硫修饰受dptBCDE基因簇控制,将dptBCDE克隆、转化Escherichia coli DH10B后,可赋予后者Dnd表型,而当其中dptC缺失后,Dnd表型随之丧失.本文探索S.enterica serovar Cerro 87硫修饰基因dptC在硫修饰发生过程中的作用.[方法]将DptC中6个半胱氨酸(Cys)在DNA水平上逐个定点突变,转化携带dptBCDE及其衍生系列的质粒至E.coli DH10B,检测相应受体菌Dnd表型.[结果]在DptC的6个Cys中,除C39外,其余5个突变均可导致Dnd表型丧失,说明DptC中C146、C262、C273、C280和C283均与硫修饰有关.生物信息学分析表明,这5个Cys在硫修饰细菌科属间高度保守,佐证了S.enteric DptC中这5个Cys与硫修饰有关的结论.[结论]S.enteric DptC中C146、C262、C273、C280和C283任何一个的突变,都会导致受体菌Dnd表型丧失.该结果为进一步探索DNA硫修饰的发生机制提供了线索.     

低能N~+注入介导的沙漠寡营养细菌的nifH基因突变研究

在低能N+注入沙漠寡营养细菌DOB150菌株获得重组突变菌株DOB981的基础上,本研究应用生物信息学方法从DOB全基因组De novo数据中获得了nif H基因信息,分析结果表明重组突变菌株DOB981的2个拷贝nif H基因中分别有39个和5个碱基位点发生了突变。通过分析nifH基因的蛋白质二级结构,获得了蛋白质的结构域、功能位点、跨膜区域和卷曲螺旋等基本信息,为进一步理解低能离子注入介导的功能基因突变提供了分子证据。     

羊毛硫肽的高通量工程改造方法新进展

羊毛硫肽(lanthipeptide)是由核糖体合成并经翻译后修饰产生的肽类天然产物,具有丰富的分子结构和多样的生物活性.新型羊毛硫肽是活性药物的重要来源,可以通过基因组挖掘和工程改造获得.羊毛硫肽前体肽由基因编码,同时其合成酶具有较高的底物杂泛性.基于这些特征,可以对羊毛硫肽的生物合成过程开展高通量工程改造,从而快速...     

乳链菌肽的特殊结构与功能

乳链菌肽的特殊结构与功能庄绪亮马桂荣（山东大学微生物技术国家重点实验室,济南２５０１００）关键词乳链菌肽细菌素羊毛硫氨酸乳链菌肽（ｎｉｓｉｎ）是目前研究最多的一种细菌素,它由某些乳酸链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ－ｃｕｓｌａｃｔｉｓ）所产生,含有３４个...     

Ⅳ型限制酶ScoMcrA中SRA结构域介导的二聚体化对硫结合结构域功能的影响机制

【背景】部分细菌的DNA骨架会发生磷硫酰化修饰,硫结合结构域(Sulfur Binding Domain,SBD)可以特异性识别这种生理修饰。与绝大多数SBD-HNH双结构域核酸酶不同,ScoMcrA的SBD和HNH结构域中间插入了一个特异性识别5-甲基胞嘧啶(5m C)修饰DNA的SET and RING-Associated(SRA)结构域。晶体结构显示,单独的SBD是单体,而SBD-SRA是双体。【目的】探究ScoMcrA中SRA结构域的存在对SBD识别硫修饰DNA的影响及影响方式。【方法】凝胶迁移实验(Electrophoresis Mobility Shift Assay,EMSA)比较SBD、SBD-SRA对硫修饰DNA结合力的差异;对参与SBD-SRA二聚体化的关键氨基酸残基突变,并检测点突变对SBD-SRA蛋白二聚体化及结合硫修饰DNA的影响。【结果】相较于SBD结构域,SBD-SRA双结构域对磷硫酰化修饰DNA的结合能力明显增强。对SBD-SRA双体互作界面进行单点突变基本不影响其对硫修饰DNA的结合,当二聚体化界面连续的L261LGET265突变成A261AAAA265时,突变体对硫修饰DNA的结合力下降到与SBD相似的水平。【结论】根据EMSA实验结果可以初步判断,SRA结构域介导的SBD-SRA双体化能增强SBD对硫修饰DNA的结合力;L261LGET265是SRA结构域上影响SBD对硫修饰DNA结合力的关键氨基酸位点。     

微小毛霉凝乳酶基因定点突变及其酶学性质

微小毛霉凝乳酶具有很高的凝乳酶活力,是牛凝乳酶的潜在替代品,但由于微小毛霉凝乳酶蛋白水解活力过高,不利于干酪生产应用,所以本研究探索利用定点突变技术对微小毛霉凝乳酶基因进行分子改造,降低其蛋白水解活力及热稳性,提高凝乳活力。结果表明,凝乳酶肽链第186位由甘氨酸(Gly)突变为天冬氨酸(Asp)(即G186D)后,突变子凝乳活力显著提高,热稳定性有所降低;13位点由谷氨酸(Glu)分别突变为天冬氨酸(Asp)和谷氨酰胺(Gln)(即E13D,E13Q)后,突变子蛋白水解活力明显降低,同时凝乳活力稍有降低;第101位点由甘氨酸(Ala)突变为苏氨酸(Thr)(即A101T),突变子凝乳活力稍有提高,水解活力及热稳定性没有明显变化。此外,双重突变子,即101位点和186位点同时突变的突变子(即A101T/G186D)表现型与186单位点突变相一致,凝乳活力显著提高,热稳定性显著降低;186位点和13位点同时突变的突变子G186D/E13D和G186D/E13Q与13位点单点突变相比,凝乳活力有所提高,水解活力显著降低。     

大肠杆菌机械敏感性离子通道MscS失活特性分析

[目的]细菌机械敏感性离子通道MscS能够在细菌周围环境渗透压急剧降低时,打开并释放胞内内容物,平衡内外渗透压差,使细菌存活。鉴于其广泛分布在各种细菌中,而在哺乳动物中未发现其同源体,MscS被认为是一种新型抗生素靶点。MscS一个独特的开放特征是具有失活特性,即在持续的机械刺激条件下,MscS从开放状态进入一种非离子通透的失活状态,从而避免因通道持续开放引起大量内容物流失导致细菌死亡。该研究的目的是鉴定影响MscS失活的关键氨基酸,为靶向MscS的药物设计提供思路。[方法]采用分子克隆方法制备MscS Cyto-helix(P166−I170)半胱氨酸突变体,利用巯基化合物MTSET⁺结合半胱氨酸从而对其侧链基团进行修饰,并通过低渗刺激实验,检测表达MscS半胱氨酸突变体的大肠杆菌分别在无或有MTSET⁺处理下,低渗刺激诱发通道开放后的存活率筛选显著影响通道功能的突变体。利用电生理膜片钳方法检测突变体在MTSET⁺处理前后通道失活特性的变化,结合定点突变手段进一步探讨失活机制。[结果]MTSET⁺处理导致表达半胱氨酸突变体G168C-MscS的大肠杆菌在低渗刺激后存活率极大降低;G168C- MscS在结合MTSET⁺后失去失活特性,保持持续开放,是导致细菌胞内内容物大量流失并死亡的重要原因;酪氨酸突变G168Y-MscS、亮氨酸突变G168L-MscS和赖氨酸突变G168K-MscS的失活特性与野生型WT-MscS一致,而天冬氨酸突变G168D、缬氨酸突变G168V和异亮氨酸突变G168I的失活速率显著降低,尤其是G168I-MscS失去失活特性,表明MscS 168位点是影响通道失活的关键位点,并且通道失活特性与该位点氨基酸侧链基团的大小及电荷性质相关。[结论]G168位点甘氨酸是影响MscS通道失活的关键氨基酸。     

前导肽二级结构对bovicin HJ50修饰和加工的影响

[目的]阐明羊毛硫细菌素bovicin HJ50前导肽的二级结构对原肽修饰和加工的影响规律.[方法]采用半体外生物合成系统构建boviein HJ50前导肽突变体,然后利用MALDI-TOF质谱鉴定成熟肽的修饰情况.同时,结合HPLC和抑菌活性分析其对成熟肽加工效率的影响.[结果]我们构建了6个bovicin HJ50前导肽二级结构相关的突变体(F-16A,V-15E,E-14L,E-8P,L-7D,L-4K).F-16A,V-15E,L-4K几乎不影响修饰和加工;E-14L和E-8P的修饰则发生了变化;另发现L-7D导致加工过程受到强烈抑制.[结论]Bovicin HJ50前导序列中保守的螺旋结构区对修饰酶BovM和蛋白酶BovT150活性都有不同程度影响,其二级结构的维持对bovicin HJ50的修饰和加工具有重要作用.     

IV型限制酶ScoMcrA中SRA结构域介导的二聚体化对硫结合结构域功能的影响机制

[背景] 部分细菌的DNA骨架会发生磷硫酰化修饰,硫结合结构域（Sulfur Binding Domain,SBD）可以特异性识别这种生理修饰。与绝大多数SBD-HNH双结构域核酸酶不同,ScoMcrA的SBD和HNH结构域中间插入了一个特异性识别5-甲基胞嘧啶（5mC）修饰DNA的SET and RING-Associated （SRA）结构域。晶体结构显示,单独的SBD是单体,而SBD-SRA是双体。[目的] 探究ScoMcrA中SRA结构域的存在对SBD识别硫修饰DNA的影响及影响方式。[方法] 凝胶迁移实验（Electrophoresis Mobility Shift Assay,EMSA）比较SBD、SBD-SRA对硫修饰DNA结合力的差异;对参与SBD-SRA二聚体化的关键氨基酸残基突变,并检测点突变对SBD-SRA蛋白二聚体化及结合硫修饰DNA的影响。[结果] 相较于SBD结构域,SBD-SRA双结构域对磷硫酰化修饰DNA的结合能力明显增强。对SBD-SRA双体互作界面进行单点突变基本不影响其对硫修饰DNA的结合,当二聚体化界面连续的L₂₆₁LGET₂₆₅突变成A₂₆₁AAAA₂₆₅时,突变体对硫修饰DNA的结合力下降到与SBD相似的水平。[结论] 根据EMSA实验结果可以初步判断,SRA结构域介导的SBD-SRA双体化能增强SBD对硫修饰DNA的结合力;L₂₆₁LGET₂₆₅是SRA结构域上影响SBD对硫修饰DNA结合力的关键氨基酸位点。