四种类型启动子控制下空肠弯曲杆菌血红蛋白对大肠杆菌生长速度的影响

细菌血红蛋白可增加细胞在低氧条件下的氧气利用率,提高细胞的增长速率。为提高E. coli在现有发酵水平下的生物量,获得新型的基因工程底盘细胞,基于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)血红蛋白基因,比较分析了组成型和诱导型启动子对血红蛋白在E. coli基因工程菌中的表达状况及对E. coli生长的影响。首先合成了空肠弯曲杆菌血红蛋白基因chb,并让chb基因在诱导型启动子(P_T7和P_vgh)和组成型启动子(P2和P_spoI-Ⅱ)控制下表达;随后,测定了由四种类型启动子控制的血红蛋白工程菌在摇瓶和蓝盖瓶中的生长状况。结果表明四种重组菌可以表达出有活性的血红蛋白,并可显著提高大肠杆菌的生长;在发酵罐中的试验也表明四种工程菌同样对细胞生长具有出促进作用;进一步比较分析了菌体密度、细胞鲜重和CO差式光谱值间的相互关系,讨论了四种类型启动子控制的基因工程菌在诱导表达和生长调控等方面的特点,并为在微氧和好氧等不同发酵条件下选用基因工程底盘细胞提供了参考。     

双启动子促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中表达及发酵研究

为了促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中高效表达,采取在质粒pMA5自带的启动子P_(HpaⅡ)之后分别添加诱导型和组成型启动子,考察双启动子对酶表达的影响。选取2种诱导型启动子(P_(grac)、P_(gl-M1))和4种组成型启动子(P_(43)、P_(laps)、P_(HpaⅡ)、P_(amyQ))进行构建表达,其中组成型启动子P_(amyQ)与P_(HpaⅡ)构成的双启动子效果最好,有效地将胞外活性提高到31. 24U/ml,是单启动子PHpaⅡ的3. 4倍。在以上最优双启动子的基础上分别融合Sec途径和Tat途径的4种信号肽,但信号肽与双启动子共同作用并没有获得更高的酶活性。选用酶活最高的双启动子突变菌株Bacillus subtilis168/pW6(P_(HpaⅡ)-P_(amyQ))进行7. 5L发酵罐补料发酵产酶研究,LeuDH酶活达到217. 96U/ml,是摇瓶水平的6. 97倍,对工业上产亮氨酸脱氢酶有一定参考价值。     

胁迫诱导型启动子在植物抗逆基因工程中的应用

在抗逆基因工程中,大多采用的是组成型表达启动子,组成型表达启动子驱动外源抗逆基因表达虽然可以提高转基因植物的抗逆性,但会导致转基因植株生长迟缓或不育;而胁迫诱导型启动子则可提高转基因植物的抗逆性,不影响其正常生长发育,所以,胁迫诱导型启动子已逐渐用于植物抗逆基因工程。本文介绍不同胁迫诱导型启动子在植物抗逆基因工程中的应用。     

Aeromonas sp.XJ-6双加氧酶基因的克隆、表达及对酪氨酸的降解

目的:从Aeromonas sp.XJ-6中克隆双加氧酶基因,初步探索该酶的功能,为芳香烃化合物的生物降解提供基因资源。方法:PCR扩增双加氧酶基因dio6,并实现该基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中的诱导表达。产物经Ni-NTA柱纯化后,通过薄层层析(TLC)和HPLC检测双加氧酶dio6对Tyr的降解效果,再结合LC-MS检测降解产物,并分析其可能的降解途径。结果:Aeromonas sp.XJ-6双加氧酶基因dio6大小为1 194bp;通过金属鳌合亲和层析(MCAC)纯化后dio6表达产物的大小为44.9k Da。双加氧酶dio6对Tyr具有较强的降解作用。TLC和HPLC检测表明,在60μl酶量和30℃反应温度等条件下,Tyr降解较快;Mg~(2+)、Ca~(2+)略微抑制酶促反应,Mn~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Ca~(2+)促进底物降解,其中Mn~(2+)对双加氧酶影响最大。LC-MS分析表明,在双加氧酶dio6作用下,Tyr被降解为延胡索酸。结论:Aeromonas sp.XJ-6双加氧酶dio6是一种苯环开环酶,为芳香烃化合物的生物降解提供了良好的基因资源。     

β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的整合诱导型表达

目的:实现β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的整合诱导型表达。方法:克隆猪肠道野生酵母菌JSY4的25S rDNA片段;并与YIP5经EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切连接,构建载体YIP5-rDNA。BamHⅠ与SalⅠ双酶切YIP5-rDNA,EcoRⅠ与SalⅠ双酶切pGEM-ManⅠ得到ManⅠ基因,BglⅡ与EcoRⅠ双酶切pPIC9K得到AOX1启动子,将三个片段连接,构建高拷贝整合诱导型表达载体YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ。提取DNA用SalⅠ单酶切线性化与pAX15按3∶1的比例共转化JSY4,在含300μg/mlG418的YEPD平板上筛选工程菌转化子,PCR方法鉴定。用2%甲醇诱导共转化工程菌以实现表达。结果:成功表达出β-甘露聚糖酶,其比活力为0.90IU/ml。而且传代10次后仍能检测到ManⅠ基因的表达产物β-甘露聚糖酶。结论:实现了β-甘露聚糖酶基因随共转化工程菌染色体稳定遗传及表达的目的。     

基于时间序列转录组筛选谷氨酸棒杆菌内源高效组成型启动子

启动子是重要的转录调控元件,广泛用于工业菌株的代谢工程改造。谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum是重要的氨基酸生产菌株,但已报道的组成型强启动子较少。对谷氨酸高产菌Corynebacterium glutamicum SL4发酵过程的10个时间点样品进行转录组测序,筛选在发酵过程中稳定转录并且转录水平最高的10个基因;分别克隆其启动子序列至红色荧光蛋白(RFP)报告系统,通过荧光强度表征启动子在SL4菌株中的强度,再在野生型C. glutamicum ATCC 13869和ATCC 13032中验证部分启动子的通用性;并采用LacZ蛋白进一步评价强启动子的表达效果。结果显示,成功筛选到3个可以通用的组成型启动子P_(cysK)、P_(gapA)和P_(fumC)。其中P_(cysK)的表达强度最高,与诱导型强启动子P_(tac)对比,在SL4和13869菌株中均达到其2倍(RFP)和4倍(LacZ)以上;在ATCC 13032菌株中,P_(cysK)的表达强度为P_(tac)的0.3-0.4倍。Pcys K首次被报道为强启动子,可用于谷氨酸棒杆菌强化合成途径的代谢工程改造。     

苯酚降解工程菌Bacillus subtilis dqly-2的构建

目的:构建苯酚降解工程菌Bacillus Subtilis dqly-2.方法:选取2株苯酚降解菌,分别为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa zllf4和枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis BHf3-4,体外扩增Pseudomonas aeruginosa zllf4的邻苯二酚2,3双加氧酶基因(SYJ),并将此基因转入Bacillus Subtilis BHf3-4中,构建基因工程菌,并对野生菌和工程菌降解能力进行比较.结果:作用96h后,工程菌苯酚降解率为96.18％,显著高于野生菌的84.78％.结论:成功构建高效苯酚降解基因工程菌.     

用GAP启动子在毕节酵母中组成型表达人血管抑制素

为探索用GAP启动子(PGAP)取代AOX1启动子(PAOX1),在毕节酵母(P．pastortis)中组成型表达外源蛋白的可能性,应用PCR方法从P．pastoris染色体中扩增了GAP启动子,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K。将人血管抑制素(AS)基因重组于pGAP9K的多克隆位点,获得含As基因的重组质粒pGAP9K-AS。转化P．pastorisGSll5,对获得的高拷贝转化子P．pastorisGSll5(pGAP9K-AS)进行组成型表达,同时以诱导型转化子P．pastoris GSll5(pPIC9K-AS)作为对照。SDS-PAGE结果显示：组成型转化子于培养4d后AS的表达水平已达到高峰,分泌量为58mg／L;而诱导型转化子诱导4d后表达的AS仅是组成型表达的70％,诱导6d后达到高峰,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时(4d)的86％。CAM分析和抗癌实验结果显示：P．pastortis GS115(pGA．P9K-S)和P．pastoris GS115(pPIC9K-AS)表达的AS均具有抑制血管生成和C57BL／6J实验小鼠的B16黑色素瘤的生长,其平均瘤重抑制率分别达到90．61％和90．54％。以上结果表明,以GAP启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点,PGAP可以取代PAOX1在P．pastoris中表达AS及其他外源蛋白。     

棘白霉素脱酰酶基因工程菌的构建及应用研究

目的:以Streptomyces lividans TK24为表达宿主,构建高效表达棘白霉素脱酰酶(Ech DA)的基因工程菌。方法:从Actinoplanesutahensis NRRL 12052中获取Ech DA的基因片段,连接到链霉菌表达载体p NW-S1,采用诱导型启动子Plac与组成型启动子Perm E*和PSau3A,依次构建基因工程菌株ZNW-S11、ZNW-S12和ZNW-S13。通过分析启动子对Ech DA分泌表达的影响,确定工程菌的表达能力,随后完善发酵放大的工艺过程,将工程菌株发酵放大到300 L发酵罐水平。结果:成功实现了Ech DA在S.lividans TK24中的诱导分泌表达;在摇瓶水平,Ech DA的酶活可达到125U/L,在24h内可实现对15g/L米卡芬净前体FR901379的完全转化;在300L发酵罐水平,Ech DA的酶活可达到80U/L,可用于10g/LFR901379的完全转化。当前,国内在工业生产中仍使用原始菌A.utahensis来表达Ech DA,而开发的Ech DA基因工程菌,与之相比在生产效率上有了大幅度提升,有助于改良当前棘白霉素类抗生素的生产工艺。     

共表达SHMT和TPase载体的构建及双酶法合成L-色氨酸

利用重组大肠杆菌表达丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)和色氨酸酶(TPase),并利用双酶法合成L-色氨酸。采用PCR从大肠杆菌K12基因组中扩增上述两种酶的基因,利用pET-28a载体,构建单表达重组质粒pET-SHMT、pET-TPase和共表达重组质粒pET-ST。将上述3种重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。SDS-PAGE结果表明,单表达基因工程菌BL21(DE3)/pET-SHMT和BL21(DE3)/pET-TPase分别在47kDa(SHMT)和50kDa(TPase)处有蛋白表达带;共表达基因工程菌BL21(DE3)/pET-ST在上述两处均有蛋白表达带。与宿主菌相比,单表达SHMT基因工程菌产酶活性提高了6.4倍;单表达TPase基因工程菌产酶活性提高了8.4倍;共表达SHMT和TPase基因工程菌产酶活性分别提高了6.1和6.9倍。利用工程菌所产酶进行双菌双酶法和单菌双酶法合成L-色氨酸。两菌双酶合成L-色氨酸的累积量达到41.5g/L,甘氨酸转化率为83.3%,吲哚转化率为92.5%;单菌双酶合成L-色氨酸的累积量达到28.9g/L,甘氨酸转化率为82.7%,吲哚转化率为82.9%。     

高等植物胁迫诱导型启动子的研究进展

逆境胁迫严重影响植物生长发育,降低作物产量。目前在植物抗逆基因工程中,大多使用组成型启动子驱动目的基因表达,组成型启动子的表达虽然能提高转基因植株的抗逆性,但持续过量地表达转化的外源基因有时会阻碍植物的生长且降低其产量。因此,诱导型启动子的研究具有重要的应用价值。该文对近年来植物在逆境胁迫处理下,一些诱导型启动子的种类和功能,可能具有的顺式作用元件,反式作用因子及其研究方法进行了综述。     

筛选脱氮假单胞菌启动子提高维生素B_(12)产量

维生素B_(12)(VB_(12)/钴胺素)具有多种生理学功能,广泛应用于制药、食品等行业。脱氮假单胞菌是维生素B_(12)常用工业菌株之一。通过筛选高表达启动子来过表达VB_(12)合成途径基因,能有效提高菌株的VB_(12)生产能力。通过对脱氮假单胞菌中某些编码热激蛋白和分子伴侣基因前含启动子在内的非编码序列用启动子在线预测软件进行分析,选取P_(ibpA)、P_(cbpA)、P_(dnaJ)、P_(htpG)、P_(dnak)、P_(grpE)的非编码区与编码绿色荧光蛋白的GFP报告基因相连,通过酶标仪检测GFP的荧光信号值,对编码热激蛋白和分子伴侣基因前的非编码区所含有的启动子的表达强度进行评估,以获得高表达的启动子对VB_(12)合成途径的基因进行过表达。结果表明,含有启动子P_(dnak)的非编码区,其表达的GFP荧光值最高。进而构建强启动子P_(dnak)与维生素B_(12)合成途径基因cobA的过表达重组菌,发酵数据表明,与对照菌株相比重组菌株维生素B_(12)产量提高21.5 mg/L。筛选高表达启动子用于维生素B_(12)合成途径关键基因的表达,是一种有效的提高维生素B_(12)产量的方法。     

VHb在产L-苯丙氨酸工程菌中的表达及其抗贫氧效率

人工设计合成密码子优化的VHb基因及其天然的低氧启动子序列,并进行融合T7终止子克隆至L-Phe的高表达质粒中,构建高产L-phe的抗贫氧高密度发酵基因工程菌。高密度发酵过程中的低氧情况可诱导VHb基因的表达,含VHb的工程菌较对照工程菌发酵结果显示:菌株的稳定期延长约4h,提高菌株的产酸周期,L-phe产量提高约14%。     

Vitreoscilla Hemoglobin (VHb) Gene Expression and Function in Genetically Engineered Bacteria for Production of Phenylalanine

人工设计合成密码子优化的 VHb 基因及其天然的低氧启动子序列,并进行融合 T7 终止子克隆至 L-Phe 的高表达质粒中,构建高产 L-phe 的抗贫氧高密度发酵基因工程菌.高密度发酵过程中的低氧情况可诱导 VHb 基因的表达,含VHb 的工程菌较对照工程菌发酵结果显示:菌株的稳定期延长约4h,提高菌株的产酸周期,L-phe 产量提高约14％.     

植物逆境相关启动子及功能

启动子是调控基因表达的重要顺式元件, 在植物基因表达调控过程中起着重要作用。目前植物抗逆基因工程中, 人们大多使用组成型表达启动子驱动目的基因的表达。组成型表达启动子虽然能提高转基因植株的抗逆性, 但是其持续过量地表达转化的外源基因会阻碍植物的生长且减少其产量。因此, 只在胁迫条件下才会驱动外源基因表达的诱导型启动子的研究显得尤其重要, 已成为目前研究的热点。文章综述了受非生物逆境和生物逆境胁迫诱导的植物基因启动子的种类和功能, 并展望了植物逆境诱导启动子的研究方向和前景。     

mCherry红色荧光标记乳酸菌的融合表达系统构建及应用

为开发新型荧光蛋白标记乳酸菌以填补国内研究空白,利用pSIP载体,构建了以红色荧光蛋白mCherry为标记,并以乳酸菌胆盐水解酶基因bsh为报告基因的乳酸菌融合表达系统。在4种不同启动子(P_(sppA)、P_(ldhL)、P_(32)和P_(slpA))调节下,相继实现了融合基因的诱导型和组成型表达,表达的融合重组蛋白mCherry-BSH同时检测出红色荧光活性和胆盐水解酶BSH活性。mCherry红色荧光标记的乳酸菌融合表达系统的成功构建不仅为研究乳酸菌在生物体内的分布、定植及存活情况从而揭示其益生功能的作用机理提供有利条件,也为更多活性蛋白在乳酸菌宿主中的表达、细胞定位、功能鉴定的研究奠定基础。     

基于T7表达系统的洋葱伯克霍尔德菌G63脂肪酶同源高效表达

为实现对洋葱伯克霍尔脂肪酶的可控高效表达, 将目前被广泛使用的T7重组蛋白高效表达系统移植到洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)G63中进行脂肪酶同源表达。首先采用PCR从大肠杆菌BL21(DE3)中得到T7 RNA 聚合酶基因(T7 RNAP)并将其克隆到致死质粒pJQ200SK上, 然后在T7 RNAP 前后各加入500 bp用于同源重组的片段, 再通过三亲本杂交把T7 RNAP整合到B. cepacia基因组上, 使T7 RNAP受到脂肪酶基因(lipA)启动子调控。接着把lipA和它的伴侣基因lipB单独或全部克隆到载体pUCPCM和pBBR22b上, 构建出pBBR22blipAB、pBBR22blipA、pUCPCMlipAB、pUCPCMlipA、pUCPCMΔlipAlipB、pUCPCMΔlipA、pUCPCMΔlipB七种表达质粒, 通过电转化将上述表达质粒转化到含T7 RNAP的B. cepacia宿主菌中, 最终得到一系列脂肪酶基因工程菌。通过摇瓶诱导发酵发现含表达质粒pUCPCMlipAB的工程菌脂肪酶酶活最高, 达到607 U/mg, 与野生菌相比酶活力提高2.8倍, 并且除含pUCPCMΔlipB的工程菌外, 其它工程菌的脂肪酶酶活均有不同程度提高。野生菌与工程菌pUCPCMlipAB的发酵液经硫酸铵沉淀, Sephadex G-75凝胶过滤纯化后, 比酶活分别为29 984 U/mg和30 875 U/mg。以上结果表明, 构建的基于T7表达系统的B. cepacia脂肪酶基因工程能有效提高脂肪酶的表达量, 同时说明分泌信号PelB和增强转录的核糖体接合位点对脂肪酶的表达有促进作用。     

大肠杆菌染色体上严谨型启动子的构建

【背景】启动子的渗漏表达是代谢工程和合成生物学较为关注的问题,探索严谨型启动子使之能像开关一样控制基因的表达有助于解决这一问题。【目的】为避免在质粒上研究启动子带来的弊端,本研究将在染色体上对严谨型启动子进行构建和评价。【方法】基于4种调控元件四环素tetO、乳糖lacO、阿拉伯糖araC和鼠李糖rhaR的序列,以及2种来源的启动子PL和Plac序列,设计和组合构建了6个启动子PtetO2、PtetO3、PlacO2、PlacO3、PlacO+ara和PlacO+rha。应用CRISPR/Cas9系统将这6个启动子序列整合到大肠杆菌ATCC 8739染色体上,利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的表达,分析这6个启动子的相对表达强度和严谨型控制情况。【结果】GFP表达分析显示,启动子PlacO+rha为最佳严谨型启动子,在无诱导剂时表达为0.02,有诱导剂时最大表达强度为lac Z基因启动子的12倍,相对控制范围为600倍。【结论】研究结果将为代谢工程和合成生物学中的精确调控基因表达奠定良好的应用基础。     

启动子对枯草芽孢杆菌表达环糊精葡萄糖基转移酶的影响

以质粒pHY300PLK为骨架构建Bacillus stearothermophilus来源的α/β-环糊精葡萄糖基转移酶(α/β-CGTase)在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达系统的表达质粒。为了提高α/β-CGTase的表达量,考察了9个单启动子(P_(amyQ), P_(amyQ)', Papr E, Pgsi B, Phpa Ⅱ, Pnpr E, Psrf, Pxyl, Pxyl')对α/β-CGTase表达量的影响,摇瓶发酵表明最优单启动子为P_(amyQ)',α/β-CGTase表达量为6.52 U/mL,其次为Phpa Ⅱ和Pnpr E,分别对应酶活5.80 U/mL和5.73 U/mL。用P_(amyQ)'与P_(amyQ)'、Phpa Ⅱ、Pnpr E两两组合,构建双启动子P_(amyQ)'-P_(amyQ)'、Phpa Ⅱ-P_(amyQ)'、Pnpr E-P_(amyQ)',摇瓶发酵表明最优双启动子为Phpa Ⅱ-P_(amyQ)',α/β-CGTase表达量为11.15 U/mL,是用单启动子PamyQ'表达时的1.7倍。测定Phpa Ⅱ-P_(amyQ)'、P_(amyQ)'-P_(amyQ)'、P_(amyQ)'-P_(amyQ)'、P_(amyQ)'、Pgsi B、Phpa Ⅱ为启动子时,α/β-CGTase m RNA转录水平,结果表明α/β-CGTase表达量随m RNA转录水平的提高而提高。使用含有启动子Phpa Ⅱ-P_(amyQ)'的表达质粒进行3 L罐发酵,培养96 h时,α/β-CGTase酶活达到最高110.4 U/mL。