水葫芦胞质型谷氨酰胺合成酶EcGS1全长cDNA的克隆及序列分析

以水葫芦根部总RNA逆转录得到的cDNA为模板,参照其他植物的胞质型谷氨酰胺合成酶(GS1)氨基酸保守序列设计简并引物,进行PCR扩增,以得到的产物为基础,采用RACE技术获得水葫芦胞质型谷氨酰胺合成酶EcGS1全长cDNA。全长为1 434 bp,开放阅读框为1 071 bp,编码356个氨基酸,分子量为39.3 kD,等电点pI为5.52。序列相似性分析显示,该序列与其他植物的GS1氨基酸序列具有较高的相似性。通过亚细胞定位预测,确定EcGS1为胞质型谷氨酰胺合成酶。     

草莓MET1基因启动子克隆及瞬时表达分析

根据草莓MET1类DNA甲基转移酶基因(FaMET1)全长序列设计引物,通过PCR获得了该基因翻译起始位点上游669 bp的序列.生物信息学分析表明,该序列中存在启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box和多个胁迫诱导元件.进一步构建了FaMET1基因启动子驱动GUS的植物表达载体FMpro::GUS,通过农杆菌注射法转化草莓果实细胞,结果表明,该序列能够驱动GUS在草莓果实中瞬时表达,为进一步研究FaMET1的表达调控奠定了基础.     

苹果MAX1基因的克隆和表达及启动子分析

MAX1(MORE AXILLARY GROWTH1)是独脚金内酯(Strigolactones,SLs)合成途径中的关键基因,为了研究MAX1在苹果分枝调控中的功能,以苹果‘长富2号’(Malus domestica‘Nagafu 2’)腋芽为材料,采用PCR方法,克隆MdMAX1基因,进行生物信息学和表达水平分析;采用瞬时表达转化烟草,进行GUS染色,分析MdMAX1启动子活性。结果表明:(1)成功克隆得到苹果MAX1,其开放阅读框(ORF)1620 bp,编码539个氨基酸;系统进化和基序分析表明,MdMAX1和已知的A1型MAX1相似。(2)qRT-PCR分析表明,MAX1基因在‘长富2号’嫁接苗茎中高表达,并在腋芽本身有表达;RNA-seq分析表明,细胞分裂素(6-BA)处理苹果腋芽96 h后MAX1基因的表达水平显著降低。(3)成功克隆获得‘长富2号’MAX1启动子序列片段(1500 bp),顺式作用元件预测显示MdMAX1启动子序列中存在光响应元件,GUS活性分析表明光照处理能够减弱MAX1启动子的活性。该研究为进一步研究苹果MAX1参与SLs合成、调控苹果分枝的功能奠定了基础。     

水稻OsWTF1基因启动子的克隆与表达分析

目的：分析水稻OsWTF1基因启动子的功能及核心序列。方法：利用PCR技术从水稻日本晴基因组中克隆了转录因子WTF1编码区5上游大小为2049bp的调控区域,命名为OsWTF1,将它和长度为1631、608、474、415bp的5端缺失体分别与GUS基因融合构建表达载体,并用农杆菌介导法转化水稻。结果：GUS组织化学分析表明,OsWTF1、Os1631能够驱动GUS基因在根、茎、叶、叶鞘、花药、颖壳上的表达,Os608,Os474,Os415能驱动GUS在根、茎、花药、颖壳中表达,在叶鞘中未表达,而且在叶中的表达也很微弱。结论：OsWTF1启动子核心序列可能位于-1bp--415bp之间,在-608bp--1631bp之间可能存在与基因叶肉特异表达相关的重要元件。     

白桦BpJMJ18基因启动子克隆及表达分析

为探究BpJMJ18基因在植物生长发育过程中的功能，本研究利用PCR技术克隆白桦（Betula platyphylla）BpJMJ18基因的启动子，通过生物信息学分析发现，该启动子序列中除了包含TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外，还具有光响应元件和多种激素应答相关的元件；进而构建植物表达载体pBI101-BpJMJ18pro：：GUS，并用农杆菌介导的瞬时转化法侵染白桦，对转基因株系进行GUS染色分析，结果发现BpJMJ18基因启动子能够驱动GUS基因在白桦的主根、侧根、根尖、叶片的维管束和嫩茎中均检测到表达。上述结果说明白桦BpJMJ18启动子具有启动活性，可能影响植物的生长发育。     

甘蔗ScMOC1基因启动子的克隆与瞬时表达分析

MOC1属于植物特有的GRAS家族蛋白基因,是调控植物腋芽形成发育的关键基因。启动子对基因转录效率起直接调控作用,其功能分析可以精确定位基因的表达部位、发育阶段和调控机制,克隆甘蔗腋芽形成发育关键基因ScMOC1的启动子序列,研究其功能对该基因表达调控机制具有重要意义。本研究以我国主栽甘蔗品种新台糖22号(ROC22)的基因组DNA为模板,通过基因组步移和巢式PCR技术克隆到ScMOC1起始密码子ATG上游1874 bp的启动子序列。PlantCARE在线分析预测表明,该序列包含多个真核生物启动子必需的核心元件TATA-box、CAAT-box以及与光响应、激素响应和分生组织表达等相关的顺式作用元件,推测ScMOC1启动子可通过激素诱导调控ScMOC1表达,且该启动子可能通过分生组织表达顺式调控元件CAT-box参与ScMOC1对甘蔗分蘖的调控。将获得的启动子序列替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达进行活性分析,结果表明:本研究克隆的启动子片段能驱动GUS基因在甘蔗嫩叶中瞬时表达。5′缺失分析表明该启动子的基础启动子序列在起始密码子ATG上游350～500 bp之间。该结果为后续ScMOC1的调控机制研究奠定了良好的基础。     

拟南芥AtNHX6基因启动子的克隆及表达分析

为了探明拟南芥内膜反向转运体AtNHX6基因的组织表达模式,从基因组中克隆了AtNHX6基因开放阅读框(ORF)上游侧翼调控区1 922bp序列,并成功构建AtNHX6基因启动子与GUS融合表达载体pCAM-BIA1381-proNHX6-GUS,通过农杆菌花序浸染法转化野生型拟南芥获得T3代纯合转基因拟南芥株系,经PCR检测扩增得到2 187bp目的条带。利用组织染色法鉴定转基因拟南芥的GUS表达模式发现,在子叶、下胚轴和花中GUS活性显著。在这些广泛表达的部位中,微管系统中的表达最为显著,真叶中只有局部检测到GUS表达;在根中GUS在根毛和侧根生长部位表达;在未成熟果荚中只有在果荚顶端和基部存在GUS活性,成熟果荚中只在果柄检测到GUS表达;在花中,雄蕊的花丝和花粉粒及雌蕊的柱头中检测到GUS表达。GUS染色分析结果表明,AtNHX6基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达,且AtNHX6基因主要在拟南芥的子叶、下胚轴、根、花、果荚中的微管系统、根毛和侧根生长部位以及花丝、花粉、柱头中表达。     

家蝇Denfensin-1基因的克隆、诱导表达及启动子活性分析

【目的】鉴定一种新的家蝇Musca domestica防御素基因, 并分析其功能。【方法】从家蝇转录组数据库中鉴定了1条新的防御素基因cDNA序列, 并将其命名为家蝇防御素1 (Md-defensin-1)基因Mdde-1。利用生物信息学网站、 软件预测其结构等信息。以实时荧光定量PCR技术研究该基因的表达模式, 并且利用基因步移技术获得了启动子序列, 同时采取细胞转染技术验证Mdde-1启动子活性。【结果】该序列包含一个276 bp的开放阅读框, 编码91个氨基酸残基。推导的氨基酸序列N端包括1个23个氨基酸残基的信号肽和1个28个氨基酸残基的前肽。成熟肽由40个氨基酸残基组成, 含有1个典型的CSαβ基序。实时荧光定量PCR结果显示, 家蝇2龄幼虫受金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (G+)刺激后Mdde-1表达明显上调, 而大肠杆菌Escherichia coli (G^-)刺激后表达下调;Mdde-1在家蝇幼虫受到热激时呈上调表达。为进一步研究其调控机制, 克隆了Mdde-1启动子, 并证明了该启动子具有活性。【结论】据此认为Mdde-1是一种新的家蝇防御素, 并且在免疫革兰氏阳性菌方面发挥重要作用; 同时我们首先证明了Mdde-1的启动子具有活性。本研究为进一步研究家蝇防御素的作用机制奠定了基础。     

白桦BpSPL2基因启动子的克隆及表达分析

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物特有的转录因子,研究表明其在参与发育阶段转变、花和果实发育等方面起着重要作用。利用PCR技术从白桦基因组DNA中扩增获得BpSPL2基因上游1 960 bp启动子序列,使用PLACE和Plant CARE在线软件分析序列,发现BpSPL2基因启动子序列中含有与开花、非生物胁迫及激素响应等相关的顺式作用元件,暗示其在植物的生长发育和胁迫应答中起重要作用。进而构建了BpSPL2基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,并利用农杆菌介导将其瞬时转化至白桦和拟南芥,通过GUS组织化学染色检测BpSPL2基因启动子的组织表达特性,结果表明BpSPL2基因启动子具有启动子活性,能够驱动GUS基因在白桦和拟南芥中表达;而其表达活性在白桦的叶片、芽及根部中较强,在拟南芥的花药、雌蕊和叶片较强,为进一步研究白桦BpSPL2基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

葫芦藓LEAFY基因和启动子的克隆及表达分析

本研究以孢子植葫芦藓为试验材料,采用Tail-PCR与RT-PCR相结合的方法克隆得到葫芦藓LFY基因(FhLFY)的完整片段,该基因DNA全长为2 527bp,包含4个外显子和3个内含子序列,有1个1 050 bp的完整开放阅读框,编码349个氨基酸.通过Tail-PCR技术克隆得到905 bp的FhLFY基因启动子...     

猪sall4b基因的克隆及表达分析

sall4基因是sall基因家族的一个成员,在胚胎发育、器官形成和干细胞多能性的维持以及重建中都起到重要作用,有sall4a和sall4b两种剪切突变体类型。目前猪的sall4基因序列尚未获得。鉴于其在多能性细胞调控中的作用,对猪的sall4基因进行了克隆测序,并对其在各组织及胚胎中的表达进行了初步研究。通过5和3 RACE克隆得到猪sall4基因cDNA全长序列(2 372 bp),序列分析证明此基因编码的蛋白结构更接近于小鼠和人Sall4B亚型,同源性可达70%～80%,而与其他物种的Sall4A相比则缺少一段含锌指结构域的片段,同源性降至30%～55%。Real-time PCR证明猪sall4b基因广泛表达于猪的各种器官,其中除卵巢组织呈高量表达之外,脾、肺、心和睾丸表达量也相对较高;在早期胚胎发育过程中除4-细胞阶段相对表达量较低,其他阶段呈高量表达。免疫荧光跟踪Sall4在猪早期胚胎中的表达情况发现Sall4在着床前胚胎中全程表达并定位于细胞核中,在囊胚阶段基因表达趋向于定位在内细胞团中。表达分析证明sall4b基因与多能性紧密相关,预示着猪sall4b基因将可能作为新的重编程因子用于诱导猪多能干细胞的体系中。     

甘草GuPIP1基因启动子的克隆及序列分析

从甘草叶中提取总DNA,并用染色体步行技术克隆甘草GuPIP1基因5′端上游调控区序列（GenBank accession No．EU262597）。采用生物信息学方法进行序列分析表明,该序列具有典型的启动子结构,具干旱和ABA激素调控序列等顺式作用元件。     

水稻谷蛋白基因GluC启动子的克隆及表达分析

水稻谷蛋白仅在水稻种子胚乳中表达,其启动子是分离胚乳特异性表达启动子的理想材料。本研究克隆了GluC基因启动子pGluC,生物信息学分析表明pGluC内部含有胚乳特异性表达所需要的Skn-1 motif和ACGT-box元件。将pGluC启动子和7个5'端缺失启动子片段构建到pGPTV-GUS载体上,转化水稻愈伤组织,进行组织化学染色和GUS酶活分析。结果表明：全长及截短的-1 911、-1 611、-1 311 bp启动子均能驱动GUS基因在水稻种子胚乳中高效稳定表达。-999、-451、-203、-102 bp启动子失去了胚乳表达特异性,在根、茎或者叶中也检测到GUS表达。该结果为实现外源目的基因在水稻胚乳中特异高效表达提供了理论依据。     

甘蓝型油菜BnGOLS1基因启动子的克隆、序列分析及瞬时表达

以甘蓝型油菜‘德油五号’基因组DNA为模板,通过反向PCR扩增得到肌醇半乳糖苷合成酶基因（BnGOLS1）启动子片段,长度为827bp。PLACE和PlantCARE启动子预测工具分析表明：序列中含有TATA-Box、CAAT-Box等基本转录元件,以及ABRE、DRE、HSE、w-Box等顺式作用元件。将克隆得到的BnGOLS1启动子取代pBI121中的CaMV35S启动子,构建BnGOLS1启动子控制报告基因的GUS表达载体pBI-GS-GUS,通过农杆菌介导的方法在油菜组织中进行瞬时表达。GUS染色结果表明BnGOLS1启动子可以驱动GUS基因在油菜组织中的表达。     

甘蔗茎杆特异表达基因启动子的克隆及初步分析

甘蔗茎秆是利用转基因方法生产重组药用蛋白或有价值的化合物的理想器官,构建能在甘蔗茎秆中高水平表达异源蛋白质的表达载体是非常有意义的。而一个高效表达的载体,启动子则是其最重要元件之一,因此,茎秆特异性启动子的获得是甘蔗作为生物反应器的前提。利用染色体步移法克隆到甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a 5′端上游的一段长1968bp的序列（ Ppst2a ）,经序列测定及软件分析表明,该序列具有典型的启动子结构。此序列置换植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV 35S启动子,构建植物表达载体,命名为pCAMBIA1900,该启动子下游为gus基因。利用基因枪法转化甘蔗的茎和叶,对gus基因的瞬时表达进行测定,结果表明所获得的己糖转运蛋白基因启动子只在甘蔗茎中驱动gus基因瞬时表达,该启动子具有茎秆特异性。     

烟草花药特异表达基因启动子的克隆及序列分析

通过PC,R扩增,从烟草(Nicotiana tabacum cv.NC89)中克隆了花药绒毡层中特异表达基因的启动于,序列分析表明,该启动子含1303个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为99．4％。     

团头鲂黏蛋白基因Muc5b克隆及表达分析

摘要：黏液（mucus）在鱼体防御外界病原侵袭、信息传递、调节渗透压等方面具有重要作用。黏蛋白（mucin）作为黏液的基础骨架组分,与其相关的研究正受到广泛的关注。在本研究中,作者克隆获得团头鲂（Megalobrama amblycephala）Muc5b mRNA 的部分序列3895 bp,并通过qRT-PCR分析了Muc5b在团头鲂不同组织的表达分布及其在捕捞应激后在鳃和表皮中的表达变化。序列分析结果显示,团头鲂Muc5b与鲤等脊椎动物的Muc5b有较高的同源性,其N端含有黏液蛋白特异性结构域：三个VWD区域,三个C8区域,二个TIL区。组织表达分析结果表明,Muc5b在鳃和表皮表达量相对较高,在脑、脾、肾中表达水平较低,在肝、肠道几乎不表达。捕捞应激后1 h时鳃中Muc5b显著降低（P < 0.05）,24 h时恢复初始水平;表皮中4 h时Muc5b显著上升（P < 0.05）,24 h时恢复到初始水平。     

茉莉花JsPAL基因及其启动子克隆与表达分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)为茉莉花(Jasminum sambac)花香物质苯丙烷类合成的限速酶。为了解茉莉花花香形成的分子机理,以双瓣茉莉花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法,克隆获得茉莉花苯丙氨酸解氨酶基因的全长cDNA(GenBank:KM406501.1),命名为JsPAL,其全长cDNA为2 220 bp,开放阅读框(ORF)为2 140 bp,编码712个氨基酸,含有lyase_I_like超家族蛋白保守域、活性位点及多肽结合位点。采用染色体步移技术,获得该基因的启动子序列。JsPAL基因上游调控序列为1 201 bp,其含有开花相关元件(CCAATBOX1)、PAL相关元件(BOXLCOREDCPAL、PALBOXPPC、PALBOXLPC、TATABOXOSPAL)以及花特异苯丙烷类相关元件(MYBPLANT)等与花香形成相关的重要顺式作用元件。实时荧光定量PCR检测结果表明,在不同组织和花瓣发育过程中,JsPAL基因在茉莉花的花蕾、花瓣中表达量较高,并且在花瓣开放过程中的22:00前表达量较高,而后呈下调趋势。     

napin基因启动子克隆及进化分析

napin是一个重要的种子贮藏蛋白,它以组织特异性方式表达形成。以甘蓝型油菜为材料,克隆了napin基因启动子,测序结果表明,该启动子全长1 135bp,含有启动子特有的TATA-box等调控元件。系统进化分析显示,拟南芥、萝卜、白菜型油菜和甘蓝型油菜napin基因启动子之间既具有较高的同源性,又存在一定的差别。通过进化分析,指导我们在油菜脂肪酸改良过程中,采用不同的启动子在脂肪酸改良方面可能起到不同的效果。