基于涉案兽类12S rRNA基因的NCBI数据库序列可靠性分析

本研究以常用于动物种属鉴定的12S rRNA基因位点为研究对象,利用所测得的17种常见涉案兽类12S rRNA基因部分片段序列及NCBI数据库中下载的该物种DNA序列及其近缘物种DNA序列,构建系统进化树。根据进化树的聚类情况,判断NCBI数据库中的相关基因序列或物种名称的正确性,并对其中错误序列的登陆号进行标记,以防对后续涉案动物的准确鉴定造成影响。分别从17种常见涉案兽类(共26份样本)中提取线粒体DNA,并利用通用引物扩增线粒体DNA上的12S rRNA基因部分片段并进行测序分析。通过NCBI数据库的Blast比对功能,筛选出与本研究物种同源性由高到低的物种,并从NCBI基因数据库中下载此类近缘物种的12S rRNA基因序列共351条,利用MEGA7.0软件构建该物种及其近缘物种系统进化树。通过比对发现NCBI中登录号为KP202279等3个序列所对应物种拉丁名错误。登录号为AY184436等11个序列所对应物种拉丁名可能存在疑问。GenBank中某些物种拉丁名有同种异名现象。因此,NCBI数据库数据可靠性有待进一步验证,只能作为涉案物种鉴定的参考数据之一,可借助构建系统进化树等方法来确认其结果的准确性。     

利用12S rRNA、COI基因分子标记鉴定少棘巨蜈蚣干燥体

本研究旨在利用线粒体DNA上的12S rRNA基因、COI基因分子标记鉴定少棘巨蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch)干燥体。通过提取少棘巨蜈蚣干燥体样本DNA,PCR扩增线粒体DNA上的12S r RNA基因、COI基因片段,对PCR产物进行电泳检测及测序分析,测序结果在GenBank上进行BLAST搜索,同源性分析,并用MEGA7.0软件对所有实验样品及少棘巨蜈蚣的近缘物种进行遗传距离分析、构建邻接(NJ)树以验证序列比对结果。结果表明,从少棘巨蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch)干燥体中成功地提取到了基因组总DNA,并成功扩增出了用于动物种属鉴定的12S rRNA、COI基因片段。但所得蜈蚣样本12S rRNA基因片段序列与NCBI的GenBank中的物种的同源性无90%以上的。通过文献调研发现尚无蜈蚣12S rRNA基因片段的相关报道,将该序列作为新的基因序列注册到NCBI基因数据库中,该基因片段序列的GenBank登录号为JN558832.1。这说明利用线粒体DNA上的12S rRNA、COI基因DNA分子标记皆可准确鉴定动物种属。本研究得到的12S rRNA基因片段序列可作为后续准确鉴定少棘巨蜈蚣药材的分子标记参考。     

杨树木质素合成酶c3h基因的克隆及其序列分析

根据CYP98A3(GenBank登录号为AY064170)cDNA序列保守区设计引物,从正在分化的2年生‘欧美杨107’次生木质部提取的总RNA经RT-PCR扩增出一基因片段,然后与pMD20-T载体连接。重组质粒经限制性内切酶酶切、特异引物PCR扩增和测序鉴定。结果表明,扩增片段长度为994bp,其中包含一个长为495bp的开放阅读框,编码的氨基酸序列(登录号为CAP47423)与NCBI中AY064170的CYP98A3编码氨基酸序列的相似性为91%,初步断定其为CYP98A3家族中的一员,其cNDA序列GenBank登录号为AM920690。参照国内外已发表的部分植物的c3h基因序列,构建了c3h的遗传进化树,分析了不同植物c3h的遗传进化关系。     

陕西秦岭非法贸易动物(兽类)基因条码构建及分子鉴定

现今秦岭珍稀野生动物非法贸易频繁发生,野生动物仅通过外表难以准确鉴定。通过构建陕西省秦岭地区羚牛、林麝、斑羚、鬣羚、金丝猴、黑熊、小麂、毛冠鹿、果子狸、豹猫、野猪、大熊猫、黄鼬、鼬獾、獾15种兽类线粒体DNA Cytb基因条码,对3例来自秦岭森林公安收缴的无法鉴定的动物肌肉样品进行分子物种鉴定。利用Neighbor-joining法和非加权配对算数平方法,构建分子系统发生树,对比三种待鉴定样品样本和15种动物的Cytb序列的遗传距离和序列相似性。经分析,待鉴定样品A1与斑羚聚为一枝,序列相似性为99.4%遗传距离为0.006;待鉴定样品A2与鬣羚聚为一枝,序列相似性为98.8%遗传距离为0.012;待鉴定样品A3与黑熊聚为一枝,序列相似性最高为100%遗传距离为0.000。从而鉴定出三种物种分别为斑羚、鬣羚和黑熊。基因条码为物种鉴定和野生动物保护提供便利条件。     

DNA条形码技术对重大潜在入侵害虫大洋臀纹粉蚧的鉴定有效性研究

【目的】粉蚧是一类重要的世界性检疫性害虫,对果蔬产业以及水果的进出口贸易造成了巨大威胁。通常,口岸截获的粉蚧多为若虫或残体,加之隐存种的存在和较小的近缘种间差异,严重影响了基于形态学特征的粉蚧类害虫识别鉴定的准确性和及时性。本研究旨在明确DNA条形码技术对重大潜在入侵害虫大洋臀纹粉蚧Planococcus minor(Maskell)的鉴定有效性。【方法】以旅检截获的36头大洋臀纹粉蚧为对象、其近缘种柑橘臀纹粉蚧Pl.citri(Risso)为参照,以线粒体COI基因5'端和3'端序列以及核糖体28S r DNA D2-D3区段序列为分子标记进行比对分析,以K-2-P模型计算种内种间遗传距离,以最大似然法(maximum likelihood,ML)构建进化树并进行系统发育分析,同时利用Species Identifier物种识别软件评价3种基因片段对大洋臀纹粉蚧的鉴定效果。【结果】当分别以COI基因5'端和3'端序列为分子标记时,截获大洋臀纹粉蚧的碱基序列与NCBI中大洋臀纹粉蚧的序列一致性分别为100%和99%~100%,而与近缘种柑橘臀纹粉蚧COI基因5'端和3'端的核苷酸序列一致性分别为97%~98%和96%~98%;且大洋臀纹粉蚧和柑橘臀纹粉蚧分别存在5个和11个稳定的物种特异性识别位点;系统发育分析显示,截获的大洋臀纹粉蚧均与数据库中的大洋臀纹粉蚧聚为一支。当以28S r DNA D2-D3区段序列为分子标记时,臀纹粉蚧属各物种间高度保守,无法区分大洋臀纹粉蚧与其近缘种柑橘臀纹粉蚧;种间遗传距离仅为0.004。此外,物种识别软件评价结果显示,基于COI基因5'端和3'端序列的鉴定结果完全正确,而基于28S r DNA D2-D3区段序列的鉴定结果却存在45.2%~61.9%的模糊鉴定。【结论】基于COI基因5'端和3'端的DNA条形码技术完全可用于大洋臀纹粉蚧的快速准确鉴定及检测,对有效阻截其入侵和进一步扩散蔓延意义重大。     

苦荞中查尔酮合成酶全长基因的克隆及其序列分析

选用乌克兰伊琳娜苦荞为试验材料,以从叶片中提取的RNA为模板,应用RACE技术结合CODEHOP引物设计方法成功克隆出苦荞中查尔酮合成酶cDNA序列后,将其序列电子合并其全长后设计基因全长特异性引物.以DNA为模板进行PCR扩增出基因序列.通过生物信息学分析表明,该基因金长为1 906 bp,具有一个463 bp的内含子序列,编码区长度为1188 bp,编码395个氨基酸.Blastn序列比对发现本试验所获得的CHS基因序列与相近物种Rheum palmatum(登录号:DQ205352.1)的CHS基因同源性达86％.将得到的序列命名为RaCHS并提交GenBank,登录号为HQ434624.应用Clustalxl.81和MEGA4软件构建系统进化树,并进行了同源性分析.     

大豆BAC克隆基因注释

根据来源于大豆BAC克隆库中的基因组序列,与其比对的基因或蛋白质序列可以从一些数据库中搜索,如GenBank序列数据库、EMBL数据库、PDB数据库等,然后利用NCBI的Entrz程序在数据库中搜索大豆基因类似物,获取其登录号及核苷酸序列,以及这些基因编码的氨基酸序列,通过GENSCAN等软件分析,得出的是与拟南芥等物种序列比对的结果,根据GENSCAN的预测结果,可以初步得知序列长度、基因数目及具有编码某种功能蛋白的基因存在的可能性,进而对预测出的氨基酸或核苷酸序列利用数据库NCBI中的BLAST进行序列的相似性搜索及比对分析,寻找其保守区域。最后对其功能基因进行注释。     

应用长PCR扩增蝗虫线粒体全基因组

介绍了用两对长PCR引物扩增蝗虫(Acridoidea)线粒体全基因组的方法。从NCBI的核酸数据库下载得到36种已测昆虫线粒体全基因组,选取cytochromeb(Cytb)c、ytochrome oxidase subunitⅡ(COⅡ)、cytochrome oxidase subunitⅠ(COⅠ)基因的保守区域设计两对引物。其中引物LP03和LP04从COⅠ向Cytb扩增;引物LPCytb和LPCOⅡ从Cytb向COⅡ扩增,两对引物扩增的片段之间有大约1 kb的重叠。应用这两对引物成功扩增出10种蝗虫的线粒体基因组。考虑到在设计引物过程中所选序列在其他昆虫中的保守性,它们应能在大部分昆虫线粒体基因组扩增中发挥作用。     

线粒体COⅠ基因在观赏鱼中物种鉴定与分类应用

观赏鱼种类繁多,形态各异,市场上多是以商品名命名,在物种鉴定分类上存在一定的难度。本研究基于线粒体COⅠ基因,探讨其在观赏鱼中物种鉴定与分类应用的可行性。通过PCR扩增,获取18种观赏鱼249个个体的COⅠ基因序列。基于Kimura双参数模型,利用MEGA软件计算18种观赏鱼种间和种内遗传距离,并构建系统进化树。结果显示,观赏鱼类的种间遗传距离明显大于种内遗传距离,线粒体COⅠ基因序列可以用于物种鉴定。在系统进化树中,系统进化关系跟传统分类方法所得数据一致性高。研究表明,观赏鱼线粒体COⅠ基因序列,在物种鉴定与进化分类上具有一定的应用价值。     

根据12S rRNA和Cyt b基因部分序列鉴定药用猴骨样品

利用线粒体12S rRNA基因和cyt b基因部分序列,通过DNA序列比对的方法,对毫州市药品监督管理局送检的三件猴骨样品（BZ01、BZ02和BZ03）进行了分子鉴定。结果表明,BZ01号样品为藏酋猴（Macaca thibetana）,BZ02和BZ03号样品为猕猴（Macaca mulatta）,通过本文的研究,作者还提出,在利用DNA序列比对法进行近缘物种的鉴定时,不同种群间的DNA序列变异,可能对结果造成一定的影响。     

太湖新银鱼m tDNA COII和Cytb基因的克隆与序列分析

设计了5对特异性引物,扩增、拼接并测定出太湖新银鱼线粒体tRNAAsp-COII-tRNALys和tRNAGlu-Cytb-tRNAThr两段基因序列片段。基因定位和序列分析发现,太湖新银鱼线粒体COII基因全序列长度为691 bp,序列AT含量为52.80%,编码230个氨基酸;线粒体Cytb基因序列全长为1141 bp,AT含量为48.90%,它编码380个氨基酸。分别位于线粒体COII和Cytb基因两翼的4个tRNA基因(tRNAAsp、tRNALys、tRNAGlu和tRNAThr)同时被测定出来。将太湖新银鱼与有明银鱼、小齿日本银鱼的同源序列进行比对分析,并基于线粒体COII Cytb基因合并数据的核苷酸和氨基酸两种序列形式,以黑斑蛙为外群,对10种鱼类进行分子系统树的构建,结果一致表明:小齿日本银鱼与有明银鱼的亲缘关系近于太湖新银鱼;鲱科与鲑科的亲缘关系近于银鱼科鱼类;此外在本研究硬骨鱼类的4个科中,白鲟科作为原始而古老的类群,是在系统进化的过程中首先分化出来的一支。     

DNA条形码在紫斑谷螟幼虫鉴定中的应用

紫斑谷螟Pyralis farinalis是常见的仓库害虫之一,它的识别和鉴定主要依靠传统的形态学鉴定方法,但对于残缺的虫体或幼虫,形态学鉴定方法则无法识别。本研究运用DNA条形码技术对送检的残缺幼虫进行鉴定。以提取到的样品基因组为模板,利用通用引物扩增其线粒体COI基因,所得基因序列与Gen Bank数据库中下载的螟蛾属5个种的14条序列进行序列比对,发现未知样品序列与紫斑谷螟的序列相似性最高,达到99.8%,遗传距离最小,为0.002-0.003。以玉米螟作为外群,采用K2P模型,以邻接法构建系统进化树,结果样品与紫斑谷螟聚为一枝。上述结果表明,残缺幼虫为紫斑谷螟的幼虫,这一结果为有效进行害虫防治提供依据。     

兰州鲇线粒体Cytb基因的克隆与序列分析

为克隆兰州鲇（Silurus lanzhouensis）线粒体Cytb基因全序列,根据欧洲鲇（Silurus glanis）线粒体基因全序列设计特异引物进行兰州鲇线粒体Cytb基因的PCR扩增,得到1138 bp兰州鲇线粒体Cytb基因序列。对兰州鲇和其他13种鱼的线粒体Cytb基因核苷酸和氨基酸序列之间进行同源性比较,结果显示具有较高的同源性,核苷酸同源性介于61.38%-91.12%,氨基酸同源性介于76.62%-95.52%。对兰州鲇、欧洲鲇、大口鲇（Silurus meridionalis）、鲇（Silurus asotus）、越南鲇（Silurus cochinchinensis）的Cytb基因之间进行碱基替代分析,结果显示兰州鲇Cytb基因与鲇之间替换率最低,值为8.87%,转换/颠换值为3.21;与越南鲇之间替换率最高,值为14.41%,转换/颠换值为1.83。对本文克隆的兰州鲇Cytb基因与王庆容等测定的兰州鲇线粒体Cytb序列进行序列差异分析,结果显示两者之间替换率为11.16%,存在127个变异位点,转换/颠换比为4.08,遗传距离为0.1230。由NJ法基于兰州鲇和其他13种鱼的Cytb基因序列构建的系统进化树,结果显示与传统的分类地位基本吻合。       

DNA 12S rRNA基因序列测定在野生动物毛发样本鉴定中的应用

目的利用mtDNA 12S rRNA基因序列测定法对西藏自治区森林公安局送检的三件毛发物证进行种属鉴定,并探讨该方法在无毛囊毛发样本鉴定中的应用价值。方法用酚/氯仿法从毛发样本中提取出基因组总DNA,再用一通用引物通过PCR技术扩增mtDNA上12S rRNA基因的部分片段并进行序列测定。测序结果在GenBank上进行BLAST搜索,再利用DNAMAN软件进行同源性分析。结果1号样和3号样扩增产物序列与藏原羚的线粒体DNA的12S rRNA基因序列的部分片段的同源性均高达99%;2号样的序列与盘羊的线粒体DNA的12S rRNA基因序列的部分片段的同源性高达98%。结论1号和3号样为藏原羚,2号样为盘羊。本研究所用方法在野生动物案件的样本鉴定中有极高的应用价值。     

松江鲈鱼Cytb基因序列分析及种质鉴定

采用PCR方法扩增四尾松江鲈鱼线粒体细胞色素b(mitochondrial cytochrome b,Cytb)基因序列,全序列长度为1 141 bp,并建立了松江鲈鱼的实时定量PCR检测方法对该物种进行种质鉴定。分析Cytb基因序列基本特征显示,Cytb基因在第3位密码子表现出明显的反G偏倚,显示出脊椎动物Cytb基因的共同特性。第2位密码子嘧啶的含量远高于嘌呤的含量,有5个位点发生转换,0个位点发生颠换。选取杜父鱼科(Cottidae)的10种鱼类,与松江鲈鱼进行序列分析,构建发育系统树并分析遗传距离,与鲈鱼的亲缘关系最远。以松江鲈鱼Cytb基因序列为靶基因,利用PRIMER EXPRESS2.0软件设计引物和Taqman探针,建立检测松江鲈鱼的定量PCR方法,特异性强,灵敏度高,检测限为3.20×102拷贝/反应。     

珠江流域常见鱼类及大型底栖动物DNA条形码空缺分析

条形码数据库是开展基于DNA的生物监测关键先决条件。为在珠江流域有效开展基于DNA的生物监测,迫切需要了解物种DNA条形码的覆盖或空缺状况。整理了珠江流域常见鱼类和大型底栖动物的物种清单,从National Center and Biotechnology Information (NCBI)数据库中检索了物种清单的DNA条形码序列,分析了常见鱼类(包括线粒体组和12s rRNA基因)和大型底栖动物(包括线粒体组、COI和18s rRNA基因)的DNA条形码覆盖范围和空缺程度。数据分析表明：(1)珠江流域共记录了常见鱼类221种,隶属于2纲18目51科和137属;常见大型底栖动物105种/属,隶属于6纲14目53科。(2)共检索到常见鱼类线粒体组序列913条和12s rRNA基因序列962条,分别占总物种的81.45%和57.92%;有12.67%的物种没有线粒体组和12s rRNA基因序列,若将条形码阈值设置为至少包含5个参考序列,则空缺度上升至52.94%;(3)共检索到常见大型底栖动物线粒体组65条序列、COI基因26,988条序列和18s rRNA基因175条序列,分别占总种/...     

细胞质雄性不育高粱叶绿体 ndh D 基因的序列变异

片段SAAU－02 700特异地扩增自7种具可育细胞质的高粱材料的总DNA,含有叶绿体psa C(88bp)和ndh D(192bp)基因的部分序列。该片段与Eco Ri HindⅢ酶切的总DNA,线粒体DNA和叶绿体DNA杂交,在总DNA中获得了0.74kb的杂交带,而在叶绿体中获得0.74kb和0．45kb两条杂交带。与线粒体DNA无杂交;与经Hae Ⅲ酶切的总DNA杂交,在不育系中获得4．9kb的杂交带,而保持系的杂交带为4．45kb。参考GenBank中高粱的近缘物种玉米叶绿体基因组的序列,构建了ndh D基因区的酶切位点图谱,借此分析得出高粱不育系的叶绿体ndh D基因序列已发生改变。这种变异与高粱细胞质雄性不育反生的关系正在探讨中。     

太湖新银鱼mtDNA COⅡ和Cytb基因的克隆与序列分析

设计了5对特异性引物,扩增、拼接并测定出太湖新银鱼线粒体tRNA^Asp-COⅡ—tRNAL^ys和tRNA^Glu-cytb—tRNA^Thr两段基因序列片段。基因定位和序列分析发现,太湖新银鱼线粒体COⅡ基因全序列长度为691bp。序列AT含量为52．80％,编码230个氨基酸;线粒体Cytb基因序列全长为1141bp,AT含量为48．90％,它编码380个氨基酸。分别位于线粒体COⅡ和Cytb基因两翼的4个tRNA基因（tRNA^Asp、tRNA^Lys、tRNA^Gls和tRNA^Thr）同时被测定出来。将太湖新银鱼与有明银鱼、小齿日本银鱼的同源序列进行比对分析,并基于线粒体COⅡ＋Cytb基因合并数据的核苷酸和氨基酸两种序列形式,以黑斑蛙为外群,对10种鱼类进行分子系统树的构建,结果一致表明：小齿日本银鱼与有明银鱼的亲缘关系近于太湖新银鱼;鲱科与鲑科的亲缘关系近于银鱼科鱼类;此外在本研究硬骨鱼类的4个科中,自鲟科作为原始而古老的类群,是在系统进化的过程中首先分化出来的一支。     

坡柳(Dodonaea viscosa L.)丛枝植原体新病原的分子鉴定

从四川攀枝花芒果园中表现为丛枝、小叶和黄花等症状的坡柳植株发病样品中,利用植原体16S rDNA基因的通用引物R16m F2/R16m R1和R16F2n/R16R2,对发病植株总DNA进行巢式PCR检测,同时设计植原体抗原膜蛋白基因(AntMP)的保守引物AntMP-F/AntMP-R进行PCR验证。结果显示,坡柳样品巢式PCR的第一轮、第二轮DNA条带大小分别为1 400 bp和1 200 bp左右,经NCBI序列相似性比较均为植原体16S rDNA序列,Gen Bank登录号为KT957205和KT957206;PCR结果显示抗原膜蛋白基因大小约600 bp,与目标基因大小一致。将测得的16S rDNA基因序列与Gen Bank数据库中登录的16SrⅠ~ⅩⅤ组植原体16S rDNA序列进行同源性比对,构建系统进化树,结果显示四川坡柳丛枝植原体(DOVI-SC)属于16SrⅠ组(即翠菊黄花组),与已报道的5个16SrⅠ组(AY101386,AY566302,AY389822,L33760和KP662119)同属一个组。利用植原体亚组分类鉴定软件iPhy Classfier对获得的2条植原体16S rDNA序列进行虚拟RFLP分析,结果显示KT957205,KT957206与16SrⅠ-B亚组洋葱黄化植原体(NC-005303)相似度分为1.0、0.97,归属于16SrⅠ-B亚组。本研究对引起四川坡柳丛枝的植原体病原进行检测,为坡柳植原体病害的早期诊断、快速检测以及预防措施制定提供科学线索。     

新型冠状病毒进化与变异

本文分析了新型冠状病毒(SARS-CoV-2,新冠病毒)的进化来源及刺突蛋白(spike protein,S)基因的突变情况.从GenBank数据库中下载相关病毒全基因组序列及S基因序列,运用DNAMAN9.0、MEGAX等生物信息学软件,进行多序列比对,构建系统进化树,并统计S基因位点突变情况.分析结果提示,新冠病毒...