第三代测序技术的主要特点及其在病毒基因组研究中的应用

随着基因测序技术的创新和应用,新的高通量测序技术不断涌现,以Pacific Biosciences(PacBio)公司的单分子实时测序(single molecule real time sequencing)为代表的第三代测序(third generation sequencing,TGS)技术开始逐渐应用于基因组研究,包括大型基因组拼装、基因结构变异和表观遗传研究等方面。本文主要对TGS技术的原理、特点和应用,特别是在病毒研究中的应用进行介绍,并与第二代测序(next generation sequencing,NGS)技术进行比较,为基因组测序技术的选择及其临床应用提供一定参考。     

单分子实时测序技术在环境微生物研究中的应用

1975年,第一个cDNA的基因组——噬菌体фX174基因组的测序完成,标志着测序时代的开始。1996年以来人类基因组计划的发起极大地推动了测序技术的应用和发展,第二代测序技术也被称为高通量测序技术。而单分子DNA测序技术是最近10年内发展起来的新一代的测序技术,称为第三代测序技术,其中包括单分子实时测序(Single molecule real time sequencing,SMRT)、真正单分子测序和单分子纳米孔测序等技术。SMRT测序技术有超长读长、测序周期短、不需要模板扩增和直接检测表观修饰位点等特点,为研究人员提供了新的选择。本文综述了SMRT测序技术的基本原理、性能以及它在微生物16S rRNA基因、微生物全基因组以及微生物宏基因组测序等方面的应用,并分析了SMRT测序技术在环境微生物应用中的优势以及存在的问题。     

基因结构变异检测方法综述

在人类基因组中结构变异(SVs),拷贝数变化(CNVs),单核苷酸多态性(SNP)是非常普遍的,而且和人类健康与疾病密切相关,因此检测这些结构变异对于人类生命健康非常重要。基于第二代基因测序平台,目前已经有很多结构变异检测算法,这些算法主要分为五大类:微阵列方法、读对方法、读深方法、分裂读取方法、序列组装方法。本文系统地阐述了这五类方法的基本原理、优缺点以及使用范围,并简要介绍了每一种方法的经典检测算法及应用范围、检测性能等,并对未来检测算法的研究提出了展望。     

二代测序技术在烟草中的应用进展

二代测序技术由于通量高、读长适中、错误率较低及成本低等优点而备受广大科研人员的青睐。本文从7种烟草属植物的基因组测序、宏基因组测序、转录组测序及烟草病毒的检测与鉴定等4个方面对二代测序技术在烟草中的应用进展进行了详细的综述,并在此基础上对二代测序技术及三代测序技术在烟草行业中的应用前景进行了展望,以期为相关领域研究者提供新的思路。     

古DNA单链测序文库的建立与检测北大核心CSCD

2005年问世的第二代测序技术在古DNA领域的应用,突破了第一代测序技术在绝灭或死亡生物全基因组获取手段上的局限。借助古基因组信息,研究者能够从更为系统的实时分子证据角度,解读诸如人类起源、大型绝灭哺乳动物迁移演化、动植物家养驯化以及早期人类社会生活模式等古生物学、遗传学与演化生物学问题。引入第二代测序技术之后,传统的古DNA研究方法及流程得以改变,剔除了原有的实验流程中耗时的分子克隆步骤,引入了与第二代测序技术紧密相关的古DNA单链测序文库构建环节。古DNA单链测序文库的构建,是将古DNA双链模板变性成单链后,通过向单链古DNA两端添加人工DNA片段,将古DNA分子转变成能被测序仪识别的文库分子。针对古DNA分子微量、高度片段化以及普遍存在碱基损伤的特点,古DNA单链测序文库,能够高效获取古DNA材料中的遗传信息。本文系统介绍古DNA单链测序文库建立流程,以及对文库质量进行检测的方法,为研究者运用第二代测序技术测定绝灭或死亡生物全基因组提供方法借鉴。     

基因芯片与高通量DNA测序技术前景分析

基因芯片与第二代DNA测序是两种重要的高通量基因组学研究技术,对于揭示基因组的结构与功能已经并正在发挥重要的推动作用．基因芯片技术建立了10多年,技术日渐成熟,在功能基因组、系统生物学、药物基因组的研究中已经得到了广泛的应用．2003年,454公司首先建立了高通量的第二代测序技术,其他公司相继推出了Solexa和Solid测序技术．虽然第二代测序技术建立的时间不长,但发展非常快,已经应用于基因组,包括测序和表观基因组学以及功能基因组学研究的许多方面．本文简要综述了基因芯片和第二代测序技术及其应用进展,并分析了这两种高通量基因组学技术的前景．     

第三代测序技术及其应用

第二代测序技术发展到一定阶段以后其缺陷逐渐显现,而第三代测序技术的出现在一定程度上弥补了第二代测序技术在应用方面的缺点.就目前正在发展的5种第三代高通量测序技术的原理进行了阐述,并比较了这几种测序技术的优缺点,最后对三代测序技术在基因组测序,甲基化研究,RNA测序以及医学方面的应用作了简单介绍.     

第三代测序技术的研究进展与临床应用

Sanger测序法,又称第一代测序技术,作为测序金标准推动了人类基因组“工作框架图”的绘制,但通量低、成本高的缺点限制了其进一步大规模应用。第二代测序技术,又称下一代测序技术,因其通量高、成本低等优点使得基因测序在基础研究与临床诊疗中得到广泛应用,但短读长一直是其不可回避的技术短板。第三代测序技术的出现,因其具有长读长优势,为基因序列上复杂重复区域解析与高质量基因组组装提供了新的技术手段。近年来,第三代测序技术进一步发展与完善,同时在肿瘤、免疫、生殖等相关领域逐步体现出临床应用价值。本文将综述第三代测序技术的研究进展与临床应用。     

纳米孔基因测序技术在DNA甲基化修饰检测中的应用研究进展

DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰类型之一,其中哺乳动物基因组中最常见的5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)甲基化修饰参与了许多重要的生命活动,其含量的异常与疾病,尤其是癌症的发生发展密切相关。当前检测5mC修饰最常用的方法是基于亚硫酸氢盐转化的第二代基因测序技术,该方法虽然转化效率高且测定准确,但仍然存在不足之处,包括DNA分子降解、处理过程繁杂、测序读长较短、检测特异性不高等。近些年发展起来的纳米孔基因测序技术凭借其能对DNA修饰直接进行检测,且具有读长长、通量高、速度快等特点,在DNA表观遗传修饰检测方面展现了良好优势。本文对DNA的5mC修饰的形成及其经典的检测方法进行了简要介绍,并重点介绍了纳米孔基因测序技术在DNA的5mC修饰检测中的应用研究进展。     

牛全基因组高通量测序技术研究进展

现代科技迅速发展的今天,无疑是分子生物学的世界。基因组测序是对生物的遗传结构进行分析的一种技术。作为一项尤为重要的生物技术。在近几年来得到了迅猛的发展以及应用,并取得了跨越性的进展,在很多领域取得了革命性的成就。无论是在人类疾病的防治,还是在畜牧遗传育种发面都发挥着重要的作用。本综述主要介绍了第一代测序技术、第二代测序技术以及第三代测序技术的原理,并对三者的优缺点进行了比较说明,还分别阐述了全基因组高通量技术在肉牛的起源、遗传育种与优良性状的选育和奶牛的疾病防治、生产性能的提高等方面的研究进展,对当下的高通量测序技术存在的问题进行了讨论,并对其未来进行了展望。     

Applications of sequencing technology in clinical microbial infection

Infectious diseases are a type of disease caused by pathogenic microorganisms. Although the discovery of antibiotics changed the treatment of infectious diseases and reduced the mortality of bacterial infections, resistant bacterial strains have emerged. Anti‐infective therapy based on aetiological evidence is the gold standard for clinical treatment, but the time lag and low positive culture rate of traditional methods of pathogen diagnosis leads to relative difficulty in obtaining the evidence of pathogens. Compared with traditional methods of pathogenic diagnosis, next‐generation and third‐generation sequencing technologies have many advantages in the detection of pathogenic microorganisms. In this review, we mainly introduce recent progress in research on pathogenic diagnostic technology and the applications of sequencing technology in the diagnosis of pathogenic microorganisms. This review provides new insights into the application of sequencing technology in the clinical diagnosis of microorganisms.     

Sequencing technologies and genome sequencing

The high-throughput - next generation sequencing (HT-NGS) technologies are currently the hottest topic in the field of human and animals genomics researches, which can produce over 100 times more data compared to the most sophisticated capillary sequencers based on the Sanger method. With the ongoing developments of high throughput sequencing machines and advancement of modern bioinformatics tools at unprecedented pace, the target goal of sequencing individual genomes of living organism at a cost of $1,000 each is seemed to be realistically feasible in the near future. In the relatively short time frame since 2005, the HT-NGS technologies are revolutionizing the human and animal genome researches by analysis of chromatin immunoprecipitation coupled to DNA microarray (ChIP-chip) or sequencing (ChIP-seq), RNA sequencing (RNA-seq), whole genome genotyping, genome wide structural variation, de novo assembling and re-assembling of genome, mutation detection and carrier screening, detection of inherited disorders and complex human diseases, DNA library preparation, paired ends and genomic captures, sequencing of mitochondrial genome and personal genomics. In this review, we addressed the important features of HT-NGS like, first generation DNA sequencers, birth of HT-NGS, second generation HT-NGS platforms, third generation HT-NGS platforms: including single molecule Heliscope™, SMRT™ and RNAP sequencers, Nanopore, Archon Genomics X PRIZE foundation, comparison of second and third HT-NGS platforms, applications, advances and future perspectives of sequencing technologies on human and animal genome research.     

基于第二代测序技术的基因资源挖掘

转录组研究一直是生命科学研究的一个重要方向,在第二代测序技术问世以前,已经产生了一些行之有效的转录组研究方法,但这些方法存在一定的局限性。第二代测序技术的出现不仅使转录组研究很快进入了高速发展期,同时也为遗传资源的挖掘提供了一套全新的技术平台。本文简要介绍了第二代测序技术的化学原理和特性,重点阐述了利用第二代测序技术进行转录组测序,从而在此基础上挖掘遗传资源的研究。     

PacBio-LITS: a large-insert targeted sequencing method for characterization of human disease-associated chromosomal structural variations

Background

Generation of long (>5 Kb) DNA sequencing reads provides an approach for interrogation of complex regions in the human genome. Currently, large-insert whole genome sequencing (WGS) technologies from Pacific Biosciences (PacBio) enable analysis of chromosomal structural variations (SVs), but the cost to achieve the required sequence coverage across the entire human genome is high.

Results

We developed a method (termed PacBio-LITS) that combines oligonucleotide-based DNA target-capture enrichment technologies with PacBio large-insert library preparation to facilitate SV studies at specific chromosomal regions. PacBio-LITS provides deep sequence coverage at the specified sites at substantially reduced cost compared with PacBio WGS. The efficacy of PacBio-LITS is illustrated by delineating the breakpoint junctions of low copy repeat (LCR)-associated complex structural rearrangements on chr17p11.2 in patients diagnosed with Potocki–Lupski syndrome (PTLS; MIM#610883). We successfully identified previously determined breakpoint junctions in three PTLS cases, and also were able to discover novel junctions in repetitive sequences, including LCR-mediated breakpoints. The new information has enabled us to propose mechanisms for formation of these structural variants.

Conclusions

The new method leverages the cost efficiency of targeted capture-sequencing as well as the mappability and scaffolding capabilities of long sequencing reads generated by the PacBio platform. It is therefore suitable for studying complex SVs, especially those involving LCRs, inversions, and the generation of chimeric Alu elements at the breakpoints. Other genomic research applications, such as haplotype phasing and small insertion and deletion validation could also benefit from this technology.

Electronic supplementary material

The online version of this article (doi:10.1186/s12864-015-1370-2) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

高通量测序技术及其应用

高通量测序技术是DNA测序发展历程的一个里程碑,它为现代生命科学研究提供了前所未有的机遇。详细介绍了以454、Solexa和SOLiD为代表的第二代高通量测序技术,以HeliScope TIRM和Pacific Biosciences SMRT为代表的单分子测序技术,以及最近Life Science公司推出的Ion Personal Genome Machine (PGM)测序技术等高通量测序技术的最新进展。在此基础上,阐述了高通量测序技术在基因组测序、转录组测序、基因表达调控、转录因子结合位点的检测以及甲基化等研究领域的应用。最后,讨论了高通量测序技术在成本和后续数据分析等方面存在的问题及其未来的发展前景。