基于CRISPR-Cas9技术构建橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统

[背景]CRISPR-Cas9基因组编辑技术为病原真菌的基因敲除、敲入及定点编辑提供了新的思路。[目的]建立适用于橡胶树胶孢炭疽菌的CRISPR-Cas9基因敲除系统。[方法]通过大肠杆菌原核表达系统合成含有细胞核定位信号的Cas9蛋白;以URA5为靶标基因,预测该基因中Cas9的切割位点,并在体外转录合成相应的SgRNA;体外构建Cas9-SgRNA复合体,并将该复合体转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体;通过表型筛选及测序鉴定,筛选URA5的敲除突变体菌株。[结果]体外表达的Cas9蛋白与SgRNA能够形成复合体,并在体外对目标基因URA5的DNA序列进行切割;Cas9-SgRNA复合体能够成功转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体,并完成对URA5的敲除;敲除突变株表现出尿嘧啶缺陷表现型。[结论]建立了适用于橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统。     

大肠杆菌双质粒CRISPR-Cas9系统的优化及应用

近年来,CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因编辑系统已经成功应用于多种微生物中.由于CRISPR-Cas9系统仅受PAM(protospacer adjacent motif)位点NGG的限制,因此理论上CRIS...     

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除H9c2细胞Tudor-SN 基因对细胞周期的阻滞及增殖的抑制

基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的CRISPR-Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease）基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,实现对大鼠心肌H9c2细胞Tudor-SN（tudor staphylococcal nuclease）基因的敲除,并观察其对H9c2细胞周期及增殖的影响。选择PX462质粒为载体,利用软件设计能特异性识别H9c2细胞Tudor-SN 基因第2个外显子的上下游sgRNA（single-guided RNA）,构建1对重组质粒。随后,将这对质粒共同转入H9c2 细胞中,再挑选阳性单克隆细胞进行培养。Western 印迹鉴定其敲除效果,并用敲除成功的细胞株通过流式细胞术及CCK-8（cell counting kit 8）实验进行细胞周期和增殖的检测。Western 印迹结果显示,在阳性细胞中,Tudor-SN 蛋白不表达,成功实现了对Tudor-SN基因的敲除。流式结果显示,Tudor-SN基因敲除（KO）细胞发生了G1期阻滞。G1期细胞占比由H9c2 野生型（WT）细胞的54.28%±0.21% 升高到KO细胞的61.96%±0.40%（*P< 0.05）。CCK-8实验结果显示,KO细胞的增殖速率减慢。生长第6 d的A值由WT细胞的2.82±0.03降低到KO细胞1.85±0.19（*P< 0.05）。本实验成功构建了H9c2 细胞Tudor-SN 基因敲除细胞株,并检测到Tudor-SN 基因敲除对细胞周期的阻滞及增殖的抑制,为研究Tudor-SN基因对心肌细胞功能的调控提供了便利的工具及研究的基础。     

利用CRISPR-Cas9技术构建敲除VDH的产香兰素拟无枝酸菌

[目的] 建立适用于拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）的CRISPR-Cas9基因编辑系统,敲除其编码香兰素脱氢酶基因（VDH）,减少发酵副产物香草酸。[方法] 以VDH为靶标基因,将pKCcas9dO质粒上的tipA、j23119启动子分别替换为pRLE6质粒Km^r启动子、链霉菌中常用的强启动子permE*,同时将sgRNA替换为能识别靶基因香兰素脱氢酶的特异性sgRNA,获得质粒pKCKmCas9VDH。然后将其与靶基因的上下游同源臂连接,获得敲除质粒pLYZYP01。将pLYZYP01质粒电转进Amycolatopsis sp.感受态细胞,筛选获得VDH的敲除突变体菌株。[结果] 利用上述方法,成功获得VDH敲除菌株Amycolatopsis sp.ΔVDH。[结论] 建立了适用于拟无枝酸菌CCTCC M 2011265的基因敲除系统,成功敲除VDH基因,在添加12 g/L底物阿魏酸的情况下,香兰素产量达到9.19 g/L,摩尔转化率由88.6%提高到97.7%。     

利用基于CRISPR-Cas9 的基因编辑技术对miR-29a在GT1-7 细胞中进 行基因敲除

目的:本文利用CRISPR-Cas9技术在GT1-7细胞中对miR-29a基因进行基因编辑,用于构建miR-29a基因敲除GT1-7细胞模型。方法:通过构建Cas9稳转的GT1-7细胞株并转染sgRNA质粒用于在靶向miR-29a基因区域引发突变。然后构建EGFP与sgRNA共表达质粒并转染Cas9稳转GT1-7细胞,利用流式细胞仪富集表达绿色荧光蛋白的阳性细胞和分选阳性单克隆细胞。最后利用实时荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR)对富集细胞和单克隆细胞进行miR-29a表达量检测。结果:T7E1检测结果显示CRISPR-Cas9系统有效地在miR-29a基因区域引发了突变。荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,富集后阳性细胞miR-29a的表达量整体下降了50%左右(P0.05)。此外,通过流式筛选获得了一个纯合miR-29a基因敲除细胞克隆,与对照组相比,其miR-29a的表达量下降了75%左右(P0.05)。结论:本文建立了一种有效编辑GT1-7细胞基因的方法,并采用该方法构建了miR-29a稳定敲除细胞模型。     

CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的研究进展

CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins)系统为细菌与古生菌中抵御外源病毒或质粒DNA入侵的获得性免疫系统。该系统在crRNA的指导下,使核酸酶Cas识别并降解外源DNA。其中,Ⅱ型CRISPR-Cas系统最为简单,仅包括一个核酸酶Cas9与tracrRNA：crRNA二聚体便可完成其生物功能。基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术的核心为将tracrRNA:crRNA设计为引导RNA,在引导RNA的指导下Cas9定位于特定DNA序列上,进行DNA双链切割,实现基因组的定向编辑。CRISPR-Cas9系统以设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势成为新一代基因组编辑技术,为基因组定向改造调控与应用等带来突破性革命。从CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的发展与应用等方面综述其最新研究进展,并着重介绍该技术的关键影响因素,为相关研究者提供参考。     

利用CRISPR-Cas9敲除Tyr基因制作白化C57BL/6N小鼠

目的 为了获得白化的C57BL/6N小鼠,扩大其在皮肤移植和胚胎干细胞方面研究中的应用。方法 通过体外设计合成Cas9 mRNA和系列sgRNA(single guide RNAs),注射到小鼠的受精卵内,破坏合成C57BL/6N小鼠黑色素生成必须的酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因序列的第1和第2外显子,产生基因突变,获得F0代白化的C57BL/6N小鼠,然后经过重复回交和自交,形成白化C57BL/6N小鼠近交系。结果 经过注射两对sgRNA,成功的获得了F0代的白化小鼠,在Tyr基因的第1和第2外显子中均发生了缺失突变,小鼠可以将突变基因传递给后代,并在其后代中产生了纯合的白色C57BL/6N小鼠,最后对白化小鼠突变类型进行了分析。结论 通过CRISPR-Cas9技术破坏了小鼠Tyr基因,成功地建立了白化C57BL/6N小鼠近交系,为将来的嵌合体制作、组织移植提供了新的研究工具。     

CRISPR-Cas9功能基因筛选技术在肝癌研究中的应用

肝癌是全球第四大致死肿瘤,对人类健康构成重大威胁。进展期肝癌缺乏有效靶点,以及目前标准疗法治疗效果有待进一步提高,是肝癌研究领域亟待解决的关键科学问题之一。CRISPR-Cas9功能基因筛选技术促进了肝癌生物学研究的发展,借助该技术,研究者发现了诸多参与肿瘤发生发展的靶基因。此外,无偏倚的CRISPR-Cas9功能基因筛选为探索耐药驱动机制和确定潜在治疗新靶点提供了基础。该文将系统阐述CRISPR-Cas9高通量功能基因筛选技术在肝癌研究领域取得的进展和突破,这些研究将有助于加深人们对肝癌的理解及开辟新的潜在治疗方案。     

基于CRISPR-Cas9技术的基因治疗研究进展

CRISPR-Cas9系统是细菌在与噬菌体抗争的进化过程中产生的一种抵御外源DNA入侵的机制,能有效识别并剪切外源DNA。基于其识别切除外源DNA的原理,CRISPR-Cas9系统被开发成为新一代基因编辑工具。与ES打靶、ZFN、TALEN等技术途径相比,CRISPR-Cas9系统操作简便、效率高、成本低,有着极其广阔的应用前景。本文整理了近年内有关CRISPR-Cas9系统的最新文献报道,对该系统工作原理以及针对基因治疗的研究进展进行综述。     

应用CRISPR-Cas9技术构建NFIB敲除的膀胱癌细胞株及其转录组学分析

为了探究NFIB(nuclear factor I/B)基因在膀胱癌中的生物学功能,该研究应用CRISPR-Cas9技术构建NFIB敲除的膀胱癌细胞株,然后通过转录组学技术分析对照细胞NFIB-NC与NFIB敲除细胞株NFIB-KO-I和NFIB-KO-II之间的差异表达基因,同时对其进行KEGG富集分析,并通过Western blot和qRT-PCR技术对转录组学结果进行验证。结果显示,与对照细胞NFIB-NC相比,NFIB敲除细胞株NFIB-KO-I中有134个差异表达基因,其中上调基因62个,下调基因72个;NFIB-KO-II中有131个差异表达基因,表达上调和下调的基因分别为50个和81个。KEGG分析结果显示,差异表达基因与PI3K-AKT信号通路密切相关,Western blot结果证实敲除NFIB基因后,膀胱癌细胞中的p-AKT水平显著上调。qRT-PCR结果表明,敲除NFIB后,ITGA4基因表达水平上调,TNC和ANGPT4基因表达水平下调。该研究初步揭示了NFIB基因在膀胱癌细胞中调控的分子信号通路,也为后续研究NFIB基因介导膀胱癌发生发展的分子机制提供了依据。     

利用CRISPR-Cas9技术失活黑曲霉中果胶酶基因及突变株性能评价*

我国果胶酶制剂使用广泛但专一性不高,高效、专一的果胶酶制剂在市场上仍然匮乏。利用基因工程技术改造果胶酶生产菌株——黑曲霉来生产单一成分的果胶酶成为解决果胶酶应用需求的一种有效方案。构建一种高效的CRISPR-Cas9基因编辑技术,可为构建高产单一性果胶酶的黑曲霉底盘菌株提供有效的基因编辑工具。首先敲除产果胶酶黑曲霉基因组上的pyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株AnΔpyrG,并在AnΔpyrG菌株的pyrG基因位点定点整合Cas9基因表达盒和pyrG基因表达盒,构建组成型表达Cas9基因的黑曲霉菌株AnCas9,再构建含有gpdA启动子、锤头结构核酶、HDV核酶的稳定性表达sgRNA的pLM2-sgRNA质粒,建立CRISPR-Cas9基因编辑体系。利用该技术失活AnCas9菌株中的2个聚半乳糖醛酸酶基因4978020和4983861来检测构建的CRISPR-Cas9基因编辑效率并检测4978020基因功能缺失菌株的表型变化和产酶变化,结果表明果胶酶基因编辑效率大于50%,AnΔ4978020的表型和果胶酶酶活性与出发菌株均无明显变化。在黑曲霉中成功构建了高效的Cas9基因编辑技术,4978020基因功能缺失也不影响菌株表型,为构建高产单一性果胶酶黑曲霉底盘菌株奠定基础。     

利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系

蛋白激酶D1 (protein kinase D1, PKD1;也称作PRKD1)是蛋白激酶家族成员之一,该家族由3种结构相关的应激激活酶组成,可调节机体多种生物学功能,主要涉及细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节、心脏收缩、血管生成和癌症等,其中PRKD1与心脏肥大、收缩和缺血再灌注损伤的底物磷酸化有关。相关研究报道,先天性心脏病患者存在PRKD1基因突变,但其在心脏中的特异性功能和分子机制并未阐明。为了便于后期研究PRKD1基因在人类早期心脏发育的作用机制,本文拟利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系。首先,通过生物信息学网站筛选出两个最佳的基因敲除靶位点,合成相应靶位点的单链向导RNA (single guide RNA,sg RNA)和引物;然后,将两个靶位点的sg RNA进行体外转录,并将其与Cas9蛋白混合后共同注射到斑马鱼的1-细胞期;最后,对基因敲除后的F0、F1、F2及F3代斑马鱼的胚胎和成鱼进行有效性鉴定及表型观察。结果显示,靶位点附近出现了不同程度的碱基缺失;成功构建了F1代能够稳定遗传的prkd1基因敲除的3个亚系;与野生型相比, F3代纯合子...     

青霉素酰化酶基因的克隆与表达Ⅱ 质粒pPAl的限制性酶切图及青霉素酰化酶基因的定位

前文报道重组质粒pPAl中9．1kb的EcoRI片段上带青霉酰化酶基因。用16种限制性内切酶消化pPAl,其中ApaI,KpnI,SacI,SacI,SmaI及XhoI等六种内切酶在pPAl上无切口; BamHI,ClaI,Sph I,BglI为单切口;Sal为双切口,AvaI,HindI及PvuI为三切口,EcoRV为五切口。经交叉双酶解法测定各片段的大小,作出质粒pPAl的限制性酶切图。在包含青霉素酰化酶基因的9．1kbEcoRI片段上,BglI有一个切口,AvaI,HindI 及PvuI都有两个切口,而EcoRV有四个切口,SalI,BamHI,ClaIKSphI不切9．1kb的EeoR I片段。HindI切9．1kb EcoR I片段为A(3．5kb),B(2．7kb)及C(2,9kb)等三个片段。经Hind I部分水解后连接,转化大肠杆菌HB101得到一系列带不同Hind 1片段的质粒的转化子,青霉素酰化酶活性测定证明其基因位于Hin d II—A片段上。合成青霉素酰化酶仍需苯乙酸诱导,并被葡萄糖阻遏,Hind I—B片段的存在能增加青霉素酰化酶基因的表达,而c片段无显著影响。     

蛋白质胶内酶切技术研究进展

胶内酶切是蛋白质组研究中衔接电泳分离和质谱鉴定的重要环节,对最终的蛋白质定性和定量分析结果有显著的影响。该技术自1992年初步建立以来,一直处于不断完善中,出现了种类繁多的改进方案。为了更有效地利用胶内酶切技术,从凝胶脱色、杂质去除、蛋白酶切、肽段提取4个方面归纳整理了近年来蛋白质胶内酶切技术的主要研究进展。     

CRISPR-Cas9基因编辑技术对细胞内源蛋白进行荧光标记的实验操作

CRISPR-Cas9是目前广泛应用的基因编辑技术,可对目的基因进行高效精准编辑,快速实现目的基因的敲除或敲入。Cas9蛋白在sgRNA引导下对靶序列进行剪切并造成DNA双链断裂,在与剪切位点两端同源的DNA模板序列存在时,可通过同源重组修复方式引入外源序列,实现荧光蛋白或其他标签在基因组上的精准敲入,进而实现对内源蛋白进行荧光标签的融合标记。通过基因编辑技术对内源目的蛋白进行标记,可避免由于过表达造成蛋白质定位、动力学或功能等的潜在影响,可显著提升细胞成像实验的稳定性和可重复性。本文重点介绍了利用CRISPR-Cas9基因编辑系统对目的蛋白进行荧光蛋白或自标记蛋白标签标记的方法与操作流程,为构建内源蛋白荧光标记的哺乳动物细胞系提供参考。     

基于CRISPR-Cas9系统的HSV-1基因治疗载体的快速构建北大核心CSCD

基因改造的1型单纯疱疹病毒(HSV-1)载体在肿瘤溶瘤病毒治疗及基因转导中具有广泛的应用前景。本研究报道一种基于CRISPR-Cas9系统的高效快速的重组HSV-1载体构建方法。首先,双顺反表达靶点g DNA和Cas9核酸酶的基因编辑质粒与同源重组模板质粒共转染Vero细胞后,用亲本株感染细胞;然后,Cas9对胞内病毒基因组定点切割,诱导外源基因同源重组,修复至病毒基因组指定位点。通过PCR、Western印迹、免疫荧光等方法证明,相比于传统自发同源重组的构建方法,该方法能显著提升病毒重组率(4.1%vs 1.1%)。同时,本研究建立了一种新的单克隆病毒纯化方案,简化了阳性病毒筛选步骤。本研究结果提供了一种高效快速的重组HSV-1构建方法,这对于HSV-1相关基因治疗及其病理机制研究将具有重要意义。     

RS-1提高CRISPR-Cas9系统介导的人乳铁蛋白基因敲入效率

尝试利用CRISPR-Cas9系统敲除山羊基因组中β-乳球蛋白(BLG)基因,以实现在BLG基因座敲入人乳铁蛋白(h LF)基因,并进一步探讨了不同浓度RAD51蛋白激活剂(RS-1)对同源重组效率的影响。首先针对山羊BLG的第一外显子设计并构建了sg RNA和Cas9共表达载体p Cas9-sg BLG,将该载体转染至山羊耳成纤维细胞,利用PCR和T7EN1法验证了其基因组编辑活性;然后进一步构建了BLG基因打靶载体p BHA-h LF-NIE(包含NEO/EGFP);将该打靶载体与p Cas9-sg BLG载体共转染至山羊耳成纤维细胞,分别用0、5、10和20μmol/L RS-1处理细胞,分析了绿色荧光蛋白的表达效率;同时用800μg/m L G418对不同浓度RS-1处理后的细胞进行筛选,挑取EGFP阳性细胞克隆,进一步通过PCR和测序鉴定h LF定点敲入的阳性细胞克隆。结果显示:设计的sg RNA编辑山羊BLG位点的效率为25%-31%;报告基因的表达效率提示RS-1可以促进基因敲入效率的提高,其效率与RS-1浓度呈正相关,20μmol/L RS-1处理组的效率是对照组的3.5倍;利用G418筛选h LF敲入阳性细胞克隆后,当RS-1浓度为0-10μmol/L时,h LF敲入效率随着RS-1浓度增加而升高,在10μmol/L时阳性克隆率最高为32.61%,然而在20μmol/L时敲入阳性克隆率下降至22.22%,且衰老细胞克隆增多。以上结果表明,利用CRISPR-Cas9系统可以实现在山羊耳成纤维细胞中敲除BLG基因和敲入h LF基因,且适宜浓度的RS-1可以显著提升基因敲入效率,本试验为高效利用CRISPR-Cas9系统获得基因敲入的细胞提供了参考依据。     

应用CRISPR/Cas9技术构建YOD1基因敲除小鼠

目的:应用CRISPR/Cas9技术构建去泛素化酶YOD1基因敲除小鼠。方法:针对YOD1基因设计单链向导RNA(sg RNA)识别序列,构建sg RNA质粒,与Cas9质粒体外转录、纯化后注射入受精卵,通过PCR和测序验证得到F0代阳性小鼠。配繁两代后,取同窝对照的野生型(WT)和敲除(KO)小鼠的主要组织器官研磨,使用免疫印迹(WB)技术检测各组织YOD1蛋白的表达,确证YOD1敲除小鼠模型是否成功建立。统计YOD1杂合子(HET)自交存活后代各基因型比例,分析是否有胚胎致死表型。解剖小鼠分析主要组织器官的表型,进一步利用H.E.染色分析KO小鼠是否存在自发的病理改变。通过血糖耐受实验(GTT)分析KO小鼠的血糖调控能力。结果:基因组测序和WB检测结果显示KO小鼠中YOD1被明显敲除,YOD1敲除小鼠模型成功建立。YOD1杂合子自交后代各基因型比例符合孟德尔定律,提示KO小鼠非胚胎致死。YOD1敲除小鼠肝脏显著小于WT小鼠。GTT结果表明敲除YOD1不影响小鼠的血糖稳态。结论:应用CRISPR/Cas9技术成功构建YOD1基因敲除小鼠。KO小鼠正常出生,无任何胚胎发育缺陷。与WT小鼠相比,KO小鼠肝脏显著减小,但无显著的自发病理变化,KO小鼠血糖控制亦无显著差异。     

构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒

旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。