丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关研究

丝裂原活化蛋白激酶信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一,参与介导细胞生长、发育、分裂、分化等多种生理反应过程。在哺乳动物细胞中存在5个MAPK亚族,分别是ERK1／2、JNK、p38、ERK3／4和ERK5。MAPK通常定位于细胞质中,受激活后移行进入细胞核,并产生相应的生理作用。     

酿酒酵母GPCR蛋白Ste2亚细胞定位信号探索

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)家族蛋白在细胞感受各种胞外信号过程中发挥重要作用。Ste2是酵母细胞中GPCR蛋白之一。大量文献报道了Ste2蛋白突变体对其功能和表达的影响,但关于Ste2亚细胞定位的研究相对较少。这项工作的目的在于确定Ste2亚细胞定位,探究Ste2不同跨膜域、胞内外环状结构域和N端、C端对其亚细胞定位的影响。构建了一系列结构域删除或替换突变体,通过荧光显微镜观察判断不同结构区域对Ste2亚细胞定位的影响,并通过与已知的细胞器标记蛋白共定位观察验证亚细胞定位判读结果。结果显示:野生型Ste2荧光信号出现在质膜和液泡内腔; C端缺失突变体荧光信号出现在质膜和内质网。在N端、C端、各环状结构域序列采用动物GPCR蛋白ORI7、OR17-40相应结构域替换的突变体中,C端替换导致液泡内腔信号消失,质膜信号强于野生型; N端和部分环状结构域替换不同程度减弱或消除了质膜定位,液泡腔内信号类似于野生型;部分突变体在胞内出现点状分布的荧光信号。由此推断:Ste2 N端,第一、第二胞外环状结构域和第三胞内环状结构域可能具有影响Ste2运输定位到质膜的功能;而C端则可能在Ste2离开细胞膜进入液泡的过程中发挥作用。初步确定了Ste2的不同结构区域对其定位的影响,为深入研究GPCR蛋白的亚细胞定位机制奠定基础。     

兰州大尾羊MAPK13基因cDNA克隆及生物信息学分析

克隆兰州大尾羊促分裂素原活化蛋白激酶MAPK13基因,并分析其序列及其编码蛋白的生物学特性,为研究绵羊MAPK13基因的功能和生产应用提供参考。根据绵羊MAPK13基因CDS序列设计特异引物,利用RACE和RT-PCR技术克隆获得兰州大尾羊MAPK13基因全长序列,并结合生物信息学方法分析其生物学特性。克隆获得兰州大尾羊MAPK13基因cDNA序列全长1 397 bp,其CDS区片段长1 102 bp,编码367个氨基酸。预测兰州大尾羊MAPK13蛋白分子量为42.29 kD,理论等电点为8.82,为非跨膜的疏水性蛋白,亚细胞定位主要在细胞质中,无信号肽,不属于分泌蛋白。预测其氨基酸序列有19个磷酸化位点,3个糖基化位点,3个磷酸化功能结构域,4个其他结构域,1个LCR片段,二级结构以α-螺旋为主。同源性分析显示兰州大尾羊MAPK13基因序列与已发布的绵羊MAPK13 mRNA序列(登录号:NM_001139455.1)相比,其第852位发生碱基转换(CA),导致编码蛋白第265位氨基酸发生碱基转换(ST),同时,第951位发生碱基转换(TG),但其所编码氨基酸不变。构建的基因进化树分析结果显示兰州大尾羊与牛亲缘关系最近。兰州大尾羊与其他物种MAPK13基因在结构上相似性较高,说明该基因具有高度的保守性,其序列包含的S_TKc结构域可将ATP的γ磷酰基转移到蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基上,导致一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化,为进一步研究MAPK13基因与成脂分化过程的相关性提供了参考。     

羊草WRKY40的克隆及其转基因烟草抗病性分析

为了培育抗白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）以及恶苗病菌（Fusarium fujikuroi）等病菌的水稻品种,通过挖掘抗病基因选育抗病品种。利用RT-PCR方法从羊草（Leymus chinensis）叶片中克隆LcWRKY40基因（登录号：MN187915）,其CDS全长1 053 bp,编码350个氨基酸,分子质量为38.1 kDa。生物信息学分析结果表明：LcWRKY40一级结构包含WRKY结构域,并且存在锌指蛋白结构域以及核定位序列。系统进化树的构建及基序分析发现LcWRKY40和HvWRKY38亲缘关系接近。烟草（Nicotiana tabacum）亚细胞定位结果表明LcWRKY40蛋白定位于细胞核中,验证了软件预测。经qRT-PCR组织特异性表达分析表明LcWRKY40基因在羊草的根、茎、叶、叶鞘、稃和花药中都有表达,但表达量在叶中最高,稃中最低。利用水稻的白叶枯病菌、纹枯病菌、稻瘟病菌以及恶苗病菌对转基因LcWRKY40烟草植株与野...     

橡胶树红根病菌GPFTR1基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

高亲和性铁通透酶FTR1是参与铁元素由胞外转移到胞内过程的重要铁转运蛋白。为了解橡胶树红根病菌(Ganoderma pseudoferreum (Wakef.) V. Over. et Steinm)的高亲和性铁通透酶编码基因GPFTR1,通过同源克隆技术,从橡胶树红根病菌中克隆得到GPFTR1的基因序列,并对其编码的氨基酸序列进行蛋白理化性质分析、保守结构域及跨膜区分析和系统进化树分析,并构建植物表达载体pBIN-GPFTR1-GFP进行该蛋白的亚细胞定位分析。利用生长速率法测定己唑醇和青蒿琥酯对橡胶树红根病菌的抑制率,并在EC50条件下进行橡胶树红根病菌的GPFTR1基因表达分析。结果表明,该基因编码区全长1 191 bp,编码396个氨基酸,推测其分子量为43.23 kD,等电点为6.92,为疏水性蛋白,具有保守基团REXLE和7个跨膜结构域;系统进化树分析显示GPFTR1与紫芝(Ganoderma sinense J. D. Zhao, L. W. HsuX. Q. Zhang)同类基因(登录号PIL27756.1)的亲缘关系最近,氨基酸同源性为89%;亚细胞定位结果显示GPFTR1蛋白定位在细胞膜上;生长速率法测定己唑醇和青蒿琥酯EC50分别为0.192 mg/L、26.288 mg/L;实时荧光定量PCR技术检测到GPFTR1蛋白编码基因分别在红根病菌受己唑醇和青蒿琥酯胁迫处理6 h和4 h表达量最高。为进一步研究橡胶树红根病菌GPFTR1基因功能提供了理论参考,对橡胶树红根病的防治具有重要意义。     

水稻NACA基因家族的鉴定及NACA2功能研究

该研究从水稻中鉴定了5个编码NACA蛋白的基因,并对其理化性质、结构、定位及表达进行分析,并针对NACA2的亚细胞定位及其在抗旱过程中的生物学功能进行了初步研究。结果表明：(1) 5个水稻NACA蛋白的氨基酸序列中含有多个保守的基序,NACA1-NACA4均含有NAC结构域和UBA结构域,但NACA5序列较短且不含UBA结构域;不同植物NACA蛋白的氨基酸序列进化关系与物种之间的进化关系高度统一。(2)组织表达模式分析发现,NACA1、NACA2和NACA3在不同水稻组织中具有较高的表达水平,尤其是在生殖器官中,但NACA4和NACA5在不同组织中的表达水平均很低;NACA基因的表达受到甘露醇、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、氯化钠(NaCl)、水杨酸(SA)及低温胁迫的诱导,其中NACA2和NACA5的表达变化最明显。(3)亚细胞定位表明,NACA2蛋白定位于细胞核和细胞质中。(4)与野生型相比,过表达NACA2拟南芥株系的萎蔫程度较轻,颜色较绿,显著降低了叶片的失水速率,且复水速度明显更快,并显著增强了对干旱和渗透胁迫的抗性。研究表明,NACA2正调控植物对干旱胁迫的抗性,为进一...     

荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白在BHK-21细胞亚细胞定位的影响

【目的】探究荧光蛋白标签对马疱疹病毒I型(Equine herpes virus type 1,EHV-1)gD囊膜蛋白亚细胞定位的影响。【方法】以EHV-1基因组为模板利用PCR扩增gD全基因,分别克隆至pAcGFP1-C1和p Ds Red2-N1质粒,构建p Ac-GFP-gD(GFP-gD)和p Ds-gD-Red(gD-Red)重组质粒;将GFP基因插入gD基因信号肽序列之后并克隆至PVAX-1质粒,构建PVAX-S-GFP-gD’(S-GFP-gD’)重组质粒;将Flag标签序列与gD囊膜蛋白N端序列融合后并克隆至p VAX-1表达载体,构建p VAX-Flag-gD(Flag-gD)重组质粒。将4种不同重组真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,通过激光共聚焦显微镜对不同融合蛋白gD进行亚细胞定位。【结果】成功构建4种不同的融合蛋白gD真核表达载体;在BHK-21细胞单独表达时,不同融合蛋白gD绝大部分都定位于高尔基体,极少量定位于细胞核内。【结论】不同插入位点的荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白亚细胞定位无明显影响,这对今后研究其它蛋白亚细胞定位提供参考。     

Sema4C及其相互作用蛋白GIPC的亚细胞定位及荧光共定位研究

目的：观察脑信号蛋白Sema4C及其相互作用蛋白GIPC的亚细胞定位及两者的荧光共定位情况,为明确Sema4C和GIPC在亚细胞水平的相互作用提供佐证。方法：将Sema4C的基因编码区全长、胞外段和胞内段分别构建到pEGFPNl和pEGFPCI表达载体中,将GIPC编码区基因构建到pDsRed-C1表达载体中,分别转染HEK293细胞,观察亚细胞定位;将pEGFPNl-Sema4C和pDsRed-GIPC分别共转染HEl（293和COS7细胞,观察两者的荧光共定位情况。结果：酶切鉴定及测序结果表明重组载体构建正确,Sema4C蛋白全长和胞外段呈跨膜分布,而胞内段在全细胞中呈弥散样分布;GIPC在胞浆内呈斑块状聚集分布;pEGFPNl-Sema4C和pDsRed-GIPC存在荧光共定位区域。结论：Sema4C主要在胞膜和胞浆内表达,GIPC主要在胞浆内呈斑块样聚集分布;Sema4C和GIPC之间存在荧光共定位。     

滇龙胆8-羟香叶醇氧化还原酶基因的克隆与表达分析

滇龙胆主要药效成分为龙胆苦苷,而8-羟香叶醇氧化还原酶基因Gr8HGO是龙胆苦苷生物合成途径的结构基因。为了研究Gr8HGO基因的功能,该文克隆了滇龙胆Gr8HGO基因,并进行表达分析。结果表明:(1)共克隆到5个Gr8HGO基因,其GenBank登录号分别为KP722029.1 (Gr8HGO-1)、KP722030.1(Gr8HGO-2)、KP722031.1(Gr8HGO-3)、KP722032.1(Gr8HGO-4)、KP723852.1(Gr8HGO-5)。(2) Gr8HGO-1基因全长1 062 bp,编码353个氨基酸,其他4个基因全长1 131 bp,编码376个氨基酸;理化性质分析结果表明5个蛋白单体相对分子质量约40 kD,理论等电点在5.47～5.95之间,均为疏水稳定蛋白。(3)信号序列分析结果表明5个蛋白均不含信号肽、跨膜螺旋和叶绿体转运肽;亚细胞定位分析结果表明5个蛋白可能定位于细胞质;结构域预测结果表明除Gr8HGO-1蛋白仅包含乙醇脱氢酶N端结构域(IPR013154)和C端结构域(IPR013149)外,其他4个蛋白还包含聚酮合酶、烯酰还原酶结构域(...     

植物MAPK信号转导组分的细胞定位与选择性剪接

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联途径在真核生物中是高度保守的,由MAPKs,MAPKKs,MAPKKKs组成,通过MAPKKK→MAPKK→MAPK逐级磷酸化传递细胞信号.已有大量研究表明,MAPK在植物响应生物与非生物胁迫,以及植物激素和细胞周期的信号转导中起重要作用.在植物响应各种逆境过程中激活的MAPK基因,细胞内的定位发生动态变化.选择性剪接是真核生物中调节基因表达的重要模式,能够影响蛋白的结合特性、胞内定位、酶的活性、蛋白的稳定性和翻译后的修饰.MAPK基因的选择性剪接能产生不同的转录异型并具有不同的亚细胞定位.本文综述这方面的研究进展.     

结核分枝杆菌Rv3194c蛋白的亚细胞定位

【目的】Rv3194c基因编码的是结核分枝杆菌的PDZ信号蛋白,本研究探讨该蛋白的亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础。【方法】从H37Rv基因组中扩增出编码只含有PDZ结构域的tRv3194c (Rv3194c 1–234 aa)的基因片段,在3′端加T2A和EGFP序列,一并插入真核表达载体构建出pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP。将构建好的质粒瞬时转染L929细胞,并共感染重组痘苗病毒vTF7-3,用间接免疫荧光、流式细胞分选以及Western blotting检测融合蛋白的表达以及亚细胞定位。【结果】成功构建出真核表达载体pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP,瞬时转染L929细胞后融合蛋白tRv3194c定位于线粒体膜上,且重组痘苗病毒vTF7-3的感染有助于靶蛋白表达水平的提高。【结论】Rv3194蛋白的PDZ结构域与线粒体外膜相关蛋白结合,为了解该蛋白在细胞内的致病机制提供重要线索。     

蓖麻RcACA基因家族鉴定及非生物胁迫下表达模式分析

自抑制Ca^(2+)-ATPase酶(auto-inhibited Ca2+-ATPase,ACA)作为Ca2+-ATPase的亚家族之一,在植物细胞内维持Ca2+浓度平衡发挥着重要的作用。为探究蓖麻(Ricinus communis)RcACA基因家族的功能及基因表达模式,文中采用生物信息学手段鉴定蓖麻RcACA基因家族成员,预测分析了其基础的理化性质、亚细胞位置、蛋白的二级和三级结构、保守域、保守基序、基因结构、染色体位置及共线关系、进化特征、启动子顺式作用元件,并通过蓖麻转录组数据中的表达量(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments,FPKM)分析RcACA基因在非生物胁迫下的表达模式。结果表明,在蓖麻中共鉴定到8个RcACA基因家族成员,均是酸性蛋白且定位在细胞质膜;所有蛋白的二级和三级结构中α-螺旋和不规则卷曲较多;RcACA基因被聚为3类,同一类别中基因的结构与保守基序相似;均有典型的4个结构域RcACA3–RcACA8,还有1个Ca^(2+)-ATPase N端自抑制结构域(N-terminal autoinhibitory domain);RcACA基因多位于染色体长臂,拥有2对共线关系。RcACA基因编码区上游拥有较多的光响应作用元件,激素诱导类作用元件较少。种间聚类显示ACA基因在物种间的进化是保守的。组织表达模式分析显示,RcACA基因拥有明显的组织表达特异性,且多数基因在雄花中表达量最高;非生物胁迫表达分析表明,RcACA2–RcACA8在高盐和干旱胁迫下均上调表达,RcACA1在低温胁迫的0–24 h上调表达,表明RcACA基因积极地响应非生物胁迫。上述结果为探究RcACA基因在蓖麻生长发育和逆境胁迫中的作用提供了理论参考。     

酿酒酵母SNF4基因的克隆及生物信息学分析

SNF4基因编码的Snf4p具有调节Snf1复合体的蛋白激酶活性功能,根据已知的SNF4基因序列设计引物扩增获得S.cerevisiae YS2的SNF4基因完整序列。序列分析表明,SNF4基因的开放阅读框为969bp,编码322个氨基酸残基。应用生物信息方法预测其理化性质、疏水性、信号肽、亚细胞定位、活性位点及其高级结构。结果表明:Snf4p为具有一定亲水性的非跨膜胞内稳定酸性蛋白,功能结构域为CBS_pair superfamily结构域,二级结构主要由a-螺旋组成,空间结构是由4个CBS结构域构成两个CBS对围绕形成的二聚体。Snf4p的第一个CBS对区域的β片层结构是Snf1p、Sip2p的β发夹结构结合作用区。     

Ect4/SARM基因研究进展

Ect4/SARM是进化上高度保守、具有多个结构域的蛋白质,其同源基因广泛存在于从节肢动物至脊椎动物的进化谱系中。Ect4/SARM具有三种特殊的结构域,分别称为SAM、ARM与TIR,三者都与蛋白-蛋白的相互作用相关又具有各自的功能。研究表明,Ect4/SARM主要在免疫系统、细胞凋亡及神经系统中起作用,与组织发育、免疫、凋亡以及代谢调控相关。在不同的物种、不同的组织中,Ect4/SARM显示出不同的亚细胞定位和功能,因此Ect4/SARM可能具有物种特异性及组织特异性,其具体的亚细胞定位和功能有待于进一步研究。     

巴西橡胶树HbMKK4基因的克隆及表达分析

采用RACE技术,从橡胶树‘热研7-33-97’中克隆了1个促分裂原活化蛋白激酶的激酶(MKK)基因HbMKK4。该基因全长cDNA序列1 580bp,编码框1 059bp,编码352个氨基酸,含有S_TKc结构域,其编码蛋白的分子量为38.83kD,理论等电点为9.36。实时荧光定量PCR结果显示,HbMKK4在橡胶树的根、树皮、胶乳及叶片中均有表达。割胶、茉莉酸甲酯和乙烯利均能上调胶乳中HbMKK4基因的表达,基因相对表达量分别在割胶后2h、茉莉酸甲酯处理8h和乙烯利处理4h后达到最高。研究结果推测HbMKK4可能通过MAPK信号途径参与茉莉酸信号途径的响应,可能在天然橡胶生物合成调控中起关键作用。     

胰岛素受体底物PH结构域相互作用蛋白结构和功能研究进展

PHIP是一种与胰腺β细胞中胰岛素受体底物（IRS）的PH结构域相互作用的蛋白。根据小鼠PHIP（mPHIP）mRNA翻译的不同起始位点,除全长的PHIP1外,mPHIP基因还编码其他3种不同变异体。在胰岛素诱导的信号途径中,主要分布于细胞核的PHIP1和IRS-1的PH结构域相互作用,介导IRS蛋白酪氨酸的磷酸化。IRS-2和PHIP1的共表达能诱导IRS在细胞膜上的定位,促进葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）向细胞质膜的转移。PHIP1的表达能提高β-细胞内细胞周期蛋白D2的表达,促进β细胞的生长。PHIP1的表达活化蛋白激酶B（PKB）,活化的PKB能明显抑制β细胞的凋亡。PHIP与胰岛素信号传导途径中其他信号分子的相互作用机制尚不明确。     

DH结构域缺失对SGEF在293T细胞中定位的影响

目的:通过构建带EGFP标签的SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体pEGFP-C1-SGEF-△DH并使其在293T细胞表达,观察DH结构域缺失后SGEF在293T细胞中的定位。方法:利用重叠PCR技术在pcDNA3.1-SGEF质粒上扩增缺失DH结构域的SGEF基因,然后将PCR产物亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1上,对阳性克隆进行双酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染293T细胞,并用Western印迹和细胞免疫荧光技术对重组质粒pEGFP-C1-SGEF-△DH在293T细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-C1-SGEF-△DH真核表达质粒构建成功,转染实验发现该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核内。结论:构建了带EGFP标签的人SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞核,为进一步研究SGEF基因DH结构域的细胞生物学功能提供了一个重要的工具。     

棉花微管结合蛋白基因GhCLASP1的克隆与表达分析

CLASP蛋白(CLASPs)是一种能够特异地与微管结合,参与调节微管结构与功能的微管结合蛋白(MAPs),在植物细胞形成、细胞伸长等方面起着关键作用。该研究利用电子克隆结合RT-PCR技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中克隆获得1个CLASP基因,命名为GhCLASP1(NCBI登录号为KP742966)。序列分析显示,GhCLASP1属于CLASP基因家族,开放阅读框长度为4 188bp,编码含1 395个氨基酸残基的蛋白;GhCLASP1蛋白含有1个HEAT重复结构域和2个CLASP-N端结构域。进化分析表明,GhCLASP1与可可树(Theobroma cacao)CLASP蛋白的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,GhCLASP1在棉花的根、茎、叶、花及纤维发育的不同时期均有表达,且GhCLASP1基因表达量最大值出现在纤维发育次生壁加厚期(开花后27d),推测GhCLASP1基因可能对棉花纤维次生壁的形成起着重要的作用。利用本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达系统对GhCLASP1基因编码的蛋白进行亚细胞定位结果显示,GhCLASP1蛋白定位在细胞膜上。上述结果为进一步研究CLASP基因在棉花中的功能奠定了基础。     

抗病毒固有免疫分子TRIM22 C端SPRY结构域对其转录、翻译及亚细胞定位的影响

本文旨在探讨TRIM22 C端SRPY结构域对其转录、翻译及亚细胞定位的影响。以野生型TRIM22真核表达质粒为模板,扩增出C端SPRY结构域缺失的TRIM22基因片段,并将其克隆入真核表达质粒pcDNA3.1。将野生型和突变型TRIM22真核表达载体分别转染高分化人肝癌细胞株HepG2。通过反转录-聚合酶链反应检测其mRNA表达水平,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测其蛋白表达水平,并通过间接免疫荧光法检测其亚细胞内定位。结果成功构建了C端SPRY结构域缺失的TRIM22真核表达质粒。转染HepG2细胞后,TRIM22 SPRY结构域缺失突变体在转录和翻译水平上均与野生型TRIM22无明显差异,但TRIM22 SPRY结构域缺失突变体完全丧失了核定位能力,这为进一步研究SPRY结构域在TRIM22抗病毒过程中所发挥的作用及机制提供了有益的启示。     

小立碗藓GPX家族的功能分化与催化特性研究

谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)在植物抵抗氧化胁迫中发挥重要作用。该研究从小立碗藓(Physcomitrella patens)基因组中挖掘到3个GPX基因,分别命名为PpGPX1、PpGPX2和PpGPX3。其中PpGPX1和PpGPX3只含有1个外显子,而PpGPX2含有6个外显子。表达模式分析发现PpGPX1和PpGPX2在检测的所有条件下均表达,而PpGPX3在检测的所有条件下均不表达。蛋白亚细胞定位分析发现,PpGPX1蛋白定位在细胞质,而PpGPX2蛋白定位在叶绿体。在大肠杆菌中表达并纯化了PpGPX1和PpGPX2蛋白,酶学性质分析发现,PpGPX1和PpGPX2蛋白均只能利用Trx电子供体系统,而不能利用GSH电子供体系统;PpGPX2蛋白对过氧化物底物的催化活性和催化效率均高于PpGPX1。基因结构、表达模式、亚细胞定位和蛋白酶学性质的差异预示小立碗藓GPX基因家族成员发生了功能分化,将PpGPX2蛋白的Pro158、Phe167和Phe172氨基酸残基均突变为Ala,发现突变体蛋白对底物催化活性降低,说明这3个氨基酸位点对PpGPX2蛋白具有重要催化活性。