鲤鱼肥胖基因的分子克隆及在大肠杆菌中的表达

为了研究鲤鱼肥胖基因的结构特点和体外表达产物的生物学活性 ,利用RT PCR技术从鲤鱼肠系膜脂肪组织中扩增出鲤鱼肥胖基因的cDNA编码序列 ,分析表明该cDNA序列由 4 38个核苷酸组成 ,编码 14 6个氨基酸组成的多肽 ,鲤鱼肥胖基因与人、猪、鼠的相比 ,核苷酸同源性分别为 :84 %、 86 %、 95 % ;氨基酸的同源性分别为 84 %、 82 %、 96 %。构建了原核表达载体 pET 2 8a li,利用IPTG在大肠杆菌中进行了诱导表达 ,并对表达产物进行了初步纯化和生物活性检测 ,结果表明 ,鲤鱼肥胖基因在大肠杆菌中进行了高效特异性融合表达 ,融合蛋白质分子量约为 2 0kD ,经薄层扫描分析 ,目的蛋白占菌体总蛋白的 2 0 3%。表达产物经过纯化和复性能够明显抑制小鼠的摄食和生长 ,说明表达产物Leptin具有明显的生物学活性     

鲤鱼肥胖基因的分子克隆及在大肠杆茵中的表达

为了研究鲤鱼肥胖基因的结构特点和体外表达产物的生物学活性,利用RT-PCR技术从鲤鱼肠系膜脂肪组织中扩增出鲤鱼肥胖基因的cDNA编码序列,分析表明该cDNA序列由438个核苷酸组成,编码146个氨基酸组成的多肽,鲤鱼肥胖基因与人、猪、鼠的相比,核苷酸同源性分别为84%、86%、95%;氨基酸的同源性分别为84%、82%、96%.构建了原核表达载体pET-28a-li,利用IPTG在大肠杆菌中进行了诱导表达,并对表达产物进行了初步纯化和生物活性检测,结果表明,鲤鱼肥胖基因在大肠杆菌中进行了高效特异性融合表达,融合蛋白质分子量约为20 kD,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的20.3%.表达产物经过纯化和复性能够明显抑制小鼠的摄食和生长,说明表达产物Leptin具有明显的生物学活性[动物学报 51(1)95-100,2005].     

家蚕浓核病毒(镇江)株主要结构蛋白基因的克隆及表达

家蚕浓核病毒(Bombyx mori densovirus,BmDNV)是一种昆虫细小病毒.与其它昆虫细小病毒感染昆虫体内多种组织不同,家蚕浓核病毒只感染家蚕中肠上皮组织的圆筒型细胞,感染该病毒细胞的细胞核可以被孚尔根和甲基绿浓染,在病毒感染的早期中肠上皮组织细胞数量增加,形成褶皱,最后感染细胞脱落到肠腔中[1-3].自从20世纪70年代末日本学者证实家蚕浓核病是由于家蚕浓核病毒感染引起的以来[4],已经分离得到了多个病毒株系[5-8].根据它们在血清学、理化特性、品种感受性和病理特征等方面的差异,分为BmDNV-1(伊那株)和BmDNV-2(以山梨株为代表)[8-11].     

中华蜜蜂蜂毒镇静肽基因的cDNA克隆和表达

从中华蜜蜂 (Apisceranacerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR扩增得到大小约为2 5 0bp的cDNA片段 ,测序得到的片段长度为 2 34bp ,为蜂毒前镇静肽原 (preprosecapin)基因编码区的cDNA .以 3′RACE方法 ,扩增和测定了 3′端非编码区 2 19bp序列 .中蜂前镇静肽原cDNA序列与已报道的欧洲意蜂该基因cDNA序列具有 92 %同源性 ,氨基酸序列具有 87%同源性 .代表成熟肽镇静肽的最后 2 5个氨基酸序列 ,中蜂与意蜂同源性为 88% .3′端非编码区cDNA序列与欧洲意蜂序列有 73 1%同源性 .将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟肽编码区与 3′非编码区部分克隆 ,构建了镇静肽与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX AcSecapin .将载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)进行融合表达 .表达产物与抗GST抗体在 2 9kD处有很强的交叉反应 .大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白 ,通过亲和层析柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF1基因克隆及在E.coli中的表达

猪圆环病毒(porcinecircovirus ,PCV)属圆环病毒科(Circoviridae) ,为单股负链DNA病毒,以滚环方式进行复制,是目前已知的最小的动物病毒之一.PCV有2种基因型即PCV 1和PCV 2 ,两者细胞培养均不引起病变.前者广泛存在于猪源肾细胞中,但并不引起感染猪发病,其基因组为1 75 9bp ;后者首先由Allan等[1 ] 从患断奶猪多系统衰弱综合症(postweaningmultisystemicwastingsyndrome ,PMWS)的猪群中分离到,被证明为PMWS的重要病原.PCV 2主要侵害感染猪的免疫系统[2 ] ,从而诱发猪体的免疫抑制.PCV 2常和呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)…     

家蚕抗菌肽CMIV基因结构改造及表达产物的研究

参照天然抗菌肽ＣＭＩＶ组分的氨基酸序列,作了近５０％的改动,根据大肠杆菌偏爱的密码子,设计并人工合成了抗菌肽基因片段．将人工合成的抗菌肽类ＣＭＩＶ基因先重组到测序载体ｐＵＣ１１８上,经过序列分析,发现克隆于载体ｐＵＣ１１８上的基因片段与设计的序列完全一致．再将该基因片段重组到表达载体ｐＥＴ２８（ａ）上,抗菌肽以融合蛋白的形式表达．融合蛋白经镍－金属离子胶亲和层析纯化后,再用ＣＮＢｒ裂解,最终产物具有与天然抗菌肽相同的生物学活性     

猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株S基因的克隆、序列分析及线性抗原表位区的鉴定

以猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得的3个相互重叠的cDNA克隆覆盖了S基因,序列比对结果表明:PEDV CH/JL株S基因与CV777、Brl/87、JS、KPEDV和Chinju99毒株S基因核苷酸序列的同源性分别为96.97%、96.87%、96.41%、94.02%和93.93%,氨基酸序列的同源性分别为96.17%、95.88%、96.10%、92.36%和92.05%;分子进化树分析结果显示,PEDV CH/JL株S基因与JS毒株S基因亲缘关系最近,处于同一群。利用DNAstar Protean程序预测了PEDV CH/JL株S蛋白一个抗原表位区(83~276aa),将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,在终浓度1.0mmol/L的IPTG诱导下获得了表达,Western blot结果显示,预测的抗原表位区GST融合蛋白能与猪流行性腹泻病毒多克隆抗血清反应,提示该抗原表位区含有线性抗原表位。     

人胶源神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

胶源神经营养因子（Ｇｌｉａｌｃｅｌｌｉｎｅｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ)是大鼠B49细胞系中分离纯化得到的一种蛋白质^[1],由于其对多巴胺神经元的专一性的神经营养作用而被发现。GDNF成熟蛋白由134个氨基酸组成,具有两个N-糖基化位点。它属于TGF-β基因家族但与该家族其它成员的氨基酸序列同源性仅为20%,可能是一个新的亚家族。最近研究表明,它对发育中的运动神经元也有很强的神经营养作用^[1]。对啮齿类^[3,4],灵长类的弥猴^[5]的活体试验表明,胶源神经营养因子是一种治疗神经退化发夹知病如帕金森氏症、肌萎缩性脊髓索硬化症等的非常有效的潜在药物。由于GDNF在体内含量极低而且公在发育早期表达,因而只有通过基因工程方法才能获得大量的GDNF。本文报道采用PCR方法从中国入基因组DNA 中扩增出编码GDNF的基因,并实现在大肠杆菌中的高效表达。这为进一步研究GDNF的结构和生物学功能打下了坚实的基础。     

CXXC5多克隆抗体的制备及表达研究

CXXC5基因是从人类胚胎心脏的cDNA文库中克隆出来的一个人类锌指基因,包含zf-CXXC5结构域,该基因编码322个氨基酸,在物种进化上高度保守.为了进一步研究该基因的功能,需要获得CXXC5蛋白并制备其抗体.通过PCR扩增方法扩增得到了CXXC5部分编码区序列,然后将其连接到PGEX4T-1上,转化到大肠杆菌BL...     

拟南芥abi5基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达和纯化

拟南芥abi5基因编码了一个碱性亮氨酸拉链类转录因子,它在ABA信号转导过程中发挥着关键调控作用。本文以拟南芥为材料,通过RT-PCR扩增、克隆了包含abi5基因编码区的片段。核苷酸序列分析表明,所克隆的基因与NCBI数据库收录的abi5基因（GenBank登录号NM129185.3）有99.0%的一致性;氨基酸序列存在4个残基差异。所克隆的abi5基因被进一步亚克隆至pET-32a表达载体。序列测定核实构建正确的重组质粒（pET32a-ABI5）转化入大肠杆菌BL21 Star（DE3）中诱导表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析柱分离纯化、SDS-PAGE分析和质谱鉴定。结果表明,重组abi5基因在大肠杆菌表达的较适宜条件为：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）终浓度为0.3 mmol L-1、30℃下诱导4 h,可达到细菌裂解液上清蛋白的29.1%。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后的ABI5融合蛋白在SDS-PAGE电泳分析时呈现一条蛋白带。该条带经串联质谱分析证明为重组ABI5融合蛋白。     

Cloning and characterization of a levanbiohydrolase from Microbacterium laevaniformans ATCC 15953

An extracellular levanbiohydrolase gene, levM, from Microbacterium laevaniformans ATCC 15953 was cloned and its nucleotide sequence was determined. Nucleotide sequence analysis of this gene revealed a 1863 bp open reading frame coding for a protein of 621 amino acids. The deduced amino acid sequence of the levM gene exhibited 28-47% sequence identities with levanases, levanfructotransferases, and inulinases. The LevM was overexpressed by using a T7 promoter in Escherichia coli BL21 (DE3) and purified 24-fold from culture supernatant. The molecular weight of this enzyme was 68,800 Da based on the sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The optimum pH and temperature of this enzyme for levan degradation was pH 6.0 and 30 degrees C, respectively. Thin-layer and high-performance liquid chromatography analyses proved that the enzyme produced mostly levanbiose from levan in an exo-acting manner. The recombinant enzyme also hydrolyzed inulin, 1-kestose, and nystose, indicating that the enzyme cleaves not only beta-2,6-linkage of levan but also beta-2,1-linkage of fructooligosaccharides. This is the first report on a gene encoding a levanbiohydrolase that produces levanbiose as a major degradation product.     

A novel cry2Ab gene from the indigenous isolate Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki

A novel cry2Ab gene was cloned and sequenced from the indigenous isolate of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. This gene was designated as cry2Ab25 and its sequence revealed an open reading frame of 1,902 bp encoding a 633 aa protein with calculated molecular mass of 70 kDa and pI value of 8.98. The amino acid sequence of the Cry2Ab25 protein was compared with previously known Cry2Ab toxins, and the phylogenetic relationships among them were determined. The deduced amino acid sequence of the Cry2Ab25 protein showed 99% homology to the known Cry2Ab proteins, except for Cry2Ab10 and Cry2Ab12 with 97% homology, and a variation in one amino acid residue in comparison with all known Cry2Ab proteins. The cry2Ab25 gene was expressed in Escherichia coli BL21(DE3) cells. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) revealed that the Cry2Ab25 protein is about 70 kDa. The toxin expressed in BL21(DE3) exhibited high toxicity against Malacosoma neustria and Rhagoletis cerasi with 73% and 75% mortality after 5 days of treatment, respectively.     

美洲大蠊3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达

旨在通过5’-RACE获得美洲大蠊3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,为进一步研究其功能奠定基础.通过3’-RACE技术,PCR扩增获取编码美洲大蠊GAPDH蛋白的全长cDNA序列;采用生物信息学方法推导出该序列编码的氨基酸序列及其理化性质;预测信号肽、蛋白疏水性、可溶性、跨膜区结构、二级结构、三级结构,并构建系统发育树;构建原核表达载体pET28a-GAPDH,IPTG诱导重组蛋白表达,并用Histag抗体Western blotting验证.结果显示,美洲大蠊GAPDH基因,其完整阅读框含999个碱基,编码332个氨基酸.序列分析显示,该蛋白与家蚕GAPDH相似性为89％,具有GAPDH保守功能域,经IPTG诱导获得重组蛋白.     

滨藜（Atriplex patens）核糖体失活蛋白基因的克隆和分析

为开发利用新疆野生植物滨藜,采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR),从滨藜（Atriplex patens）叶中克隆核糖体失活蛋白（ribosome inactivating proteins ,RIPs）基因的完整读码框ORF片段.序列分析表明,该片段大小为843 bp,编码1 条长280个氨基酸肽链, 其中N 端的26个氨基酸是信号肽.滨藜核糖体失活蛋白（ApRIP）属Ⅰ型核糖体失活蛋白.同源性比较分析显示,滨藜RIP与藜科植物藜的核糖体失活蛋白,天花粉蛋白（TCS）和美洲商陆蛋白（PAP）基因序列的同源性分别为82%,41%和55%.氨基酸序列比对和SWISS-MODEL同源模建分析表明,滨藜RIP的3′端氨基酸肽链具有与其它RIP相同的活性中心位点"EAARXKXI".     

Structure and expression of the alkB gene of Escherichia coli related to the repair of alkylated DNA

When the alkB gene of Escherichia coli that controls sensitivity of bacteria to methyl methanesulfonate was placed under the control of the lac regulatory region on a multicopy plasmid, the gene product, AlkB protein, was overproduced. By monitoring the band on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, the protein was purified to near physical homogeneity. An amino-terminal sequence and total amino acid composition of the purified AlkB protein were in accord with the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the alkB gene, determined by the phage M13 dideoxy method. It was concluded that the AlkB protein is comprised of 216 amino acids and has a molecular weight of 23,900. The nucleotide sequence analysis also revealed that the ada and alkB genes are adjacent on the E. coli chromosome and that the first initiation codon for AlkB protein overlaps with the termination codon for Ada protein. We constructed hybrid plasmids carrying an alkB'-lacZ' fusion, with or without the ada control region, and investigated expression of the alkB gene in response to the alkylating agent. We obtained evidence that the ada and alkB genes constitute an operon.     

四翅滨藜AcDHN基因的克隆及其抗逆功能分析

脱水素（dehydrin,DHN）是一类胚胎发育后期丰富蛋白（LEA）,在植物脱水条件下能保护细胞内蛋白质和膜结构免受破坏。本研究中,从四翅滨藜（Atriplex canescens）cDNA文库克隆得到逆境胁迫相关蛋白基因AcDHN的全长cDNA（登录号：JN974246）,并进行序列分析。将4cD鼢别插入到原核表达载体pET28a和双元表达载体pYES-DEST52中,通过转化大肠杆菌和酿酒酵母进行原核表达分析和真核表达分析。结果表明：AcDHN序列全长为1408bp,完整的开放阅读框长为1017bp,由338个氨基酸残基组成,预测蛋白质分子量为38.3kDa,理论等电点为6．47,AcDHN与仙人掌中DHN蛋白同源性为55％。AcDHN基因在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达出分子质量约45．2kDa的融合蛋白。重组酵母菌株能表现出艮好抗逆性,特别是对NaCl、低温、Na2CO3和NaHCO3胁迫的抗逆性,其中抗碱胁迫能力表现最强。     

霍乱毒素B亚单位基因（CtxB）的克隆及其表达

从霍乱弧菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＥＲ方法获取霍乱毒素Ｂ亚单位基因（ＣｔｘＢ）。序列分析结果表明,ＣｔｘＢ基因编码１２４个氨基酸,其中编码６２位Ｔｈｒ的密码子与文献报道有差异。将ＣｔｘＢ基因插入质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－２,构建ｐＧＥＸ－ＣＴＸＢ表达质粒,转化大肠相菌ＢＬ２１（ＤＥ３０,筛选表达菌株ＣＴＸＢ／ＢＬ２１。工程株经ＩＰＴＧ诱导表达,可产生大量的表达蛋白,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,融合蛋白分子     

人源化抗肝癌单链抗体与牛蛙核糖核酸酶融合基因的构建及表达

利用RT-PCR的方法从牛蛙肝脏中克隆牛蛙核糖核酸酶(RC—RNase)基因并进行序列测定;将人源化抗肝癌单链抗体(scFv)基因与RC—RNase基因相连接,制备scFv—RC—RNase融合基因表达质粒,转化大肠杆菌B121(DE3),用IPTG诱导进行表达。以SDS-PAGE和免疫印迹法对表达产物进行分析鉴定。序列分析表明,扩增出的RC—RNase基因片断大小约为405bpc,经SDS—PAGE和免疫印迹分析显示,scFv—RC—RNase融合基因表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达产物出现相对分子质量约为38000的一条新生蛋白带,与预期结果相符。融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的18．5％,主要以包涵体形式存在。表明成功地构建了抗肝癌scFv—RC—RNase融合基因,并在大肠杆菌中获得有效表达,为进一步进行肝癌的导向治疗研究奠定了基础。     

意大利蜜蜂丙糖磷酸异构酶基因的克隆及其原核表达与纯化

从意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的肌肉组织中提取总RNA,采用RT-PCR的方法克隆蜜蜂第16号染色体上的丙糖磷酸异构酶基因的cDNA序列,将测序结果(GenBank登录号EU76098)与推导的氨基酸序列分别与GenBank中的其他物种进行同源比对分析。结果表明,该基因全长744bp,为完整的阅读框,编码247个氨基酸,成熟蛋白的理论分子量为26.89kD。比对结果显示AmTPI与家蚕、德国小镰、黄粉虫、丽蝇蛹集金小蜂、水稻等物种的基因相似性达69%以上,蛋白相似性达59%以上。将目的基因克隆到pGEX-4T-2融合表达载体上,并在大肠杆菌中得到成功表达,4h的表达量为总蛋白的42.1%。为了进一步探讨产物的酶学特性,实验还对表达产物进行纯化与浓缩。实验还构建增强型荧光真核表达质粒,为进一步研究AmTPI在真核细胞中的表达情况奠定基础。