粗毛淫羊藿的类黄酮异戊烯转移酶基因的克隆与表达分析

药用植物淫羊藿富含异戊烯类黄酮,LC-MS定量分析表明,3～4月份粗毛淫羊藿叶片处于变色期时淫羊藿苷含量最高。通过简并引物和RACE-PCRAL粗毛淫羊藿叶片获得异戊烯转移酶同源基因（命名为EaPTI）。序列分析表明,EaPTI与维生素E合成相关的尿黑酸异戊烯转移酶位于同一进化枝,靠近类黄酮异戊烯转移酶。RT-PCR结果显示,EaPTI在叶片和幼茎中表达显著。     

滇牡丹类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的鉴定及表达分析

在植物中,类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(F3GT)将不稳定的花色素转变为稳定的花色素苷,是花色素苷形成的关键酶。本研究采样RT-PCR技术从滇牡丹中成功克隆获得一个完整的F3GT基因(Pd F3GT1),其含有1 371 bp的开放阅读框(ORF),编码456个氨基酸。该基因推断的蛋白与葡萄(Vitis vinifera)3GT蛋白的相似性为64%;与已知功能的3GT基因进行系统进化分析,结果显示Pd3GT1与葡萄3GT聚类到同一个分支。氨基酸比对显示Pd3GT1蛋白序列还有糖基转移酶家族特有的PSPG-box结构域。半定量PCR结果显示:Pd3GT1在花蕾,花开时期的花瓣中大量表达,在叶和花芽中有微弱表达;在根和茎中没有表达。说明Pd3GT基因表达具有组织表达特异性。该研究将为研究滇牡丹花色素形成机理,以及对滇牡丹类黄酮糖基转移酶的功能鉴定和利用基因工程手段改良花卉品质提供理论依据。     

偏斜淫羊藿化学成分研究

采用70%乙醇超声波辅助提取偏斜淫羊藿（Epimedium truncatum H.R.Liang）叶片中的类黄酮化学成分,利用LC-MS联用技术鉴定其化合物组成,利用HPLC方法测定其主要活性成分的含量并与药典规定药材箭叶淫羊藿（Epimedium sagittatum）主要活性成分的含量进行比较。结果从偏斜淫羊藿叶片中鉴定出6个化合物：朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、3,5,7-三羟基4’-甲氧基-8-异戊烯基黄酮-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖甙、山奈苷。该6个化合物均为首次在该植物中发现。偏斜淫羊藿富含朝藿定C,其含量显著高于箭叶淫羊藿主要活性成分的总含量。结果表明LC-MS可以简单、快速地对淫羊藿化学成分进行定性和定量分析,偏斜淫羊藿富含朝藿定C,具有潜在的药用价值。     

马缨杜鹃Rd3GT1的克隆及对矮牵牛花色形成的影响北大核心CSCD

类黄酮3-O-糖基转移酶(3GT)是花色素苷生物合成途径末端的酶,负责将糖基供体转移至花青素的3-OH位置,在增加花色素苷的稳定性与水溶性方面发挥重要作用。研究马缨杜鹃3GT在花色素苷生物合成中的功能,为马缨杜鹃花色形成及调控研究奠定基础。运用 RT-PCR 技术克隆获得马缨杜鹃3GT基因(Rd3GT1)全长CDS序列,并对其进行生物信息学分析,再利用DNA重组技术完成植物表达载体pBI121-Rd3GT1的构建,利用农杆菌介导法对矮牵牛进行遗传转化,同时对再生植株进行转基因及表型鉴定,并完成基因表达量及花色素苷检测分析。结果表明,Rd3GT1全长CDS序列为1 395 bp,编码464个氨基酸。蛋白多序列比对和系统进化分析表明,Rd3GT1属于3GT家族成员。与野生型相比,转Rd3GT1的矮牵牛植株花色由白色变为粉色,花色素苷与黄酮醇的积累显著增加,同时多个类黄酮合成相关基因表达显著升高。综上,Rd3GT1在花色素苷合成过程中发挥重要功能,可用于其它植物花色改良研究。     

七彩红竹中类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆及功能分析

类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(Flavonoid-3-O-glucosyltransferase,3GT)是花青苷(Anthocyanins)生物合成途径中的关键酶,它主要负责将不稳定的花色素转变为稳定的花色素苷,虽然目前已经从其他植物中克隆获得类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶,但是对竹子中的类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶并不清楚。该文以产生花青素的七彩红竹(Indosasa hispida Mc Clure cv.Rainbow)为材料,首先通过3GT的同源比对后设计3GT基因特异引物,获得3GT基因片段;然后运用RT-PCR及RACE技术从七彩红竹茎中克隆得到完整的3GT基因(Ih3GT)。结果表明:Ih3GT基因的c DNA全长序列为1 730 bp,含有1个1 425 bp的开放阅读框(ORF),编码474个氨基酸;系统进化分析显示,七彩红竹3GT与其他禾本科植物的3GT聚类到同一个分支;该基因推断的蛋白与水稻(Oryza sativa)3GT蛋白的相似性为69%,与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)3GT的相似性为67%;经氨基酸序列比对,推断七彩红竹3GT含有糖基转移酶基因家族特有的结构域PSPG-box;半定量PCR的结果显示,七彩红竹3GT基因在微红的幼茎中大量表达,而在其他组织中并不表达,说明Ih3GT具有组织表达特异性。该结果为今后深入研究七彩红竹花色苷的形成机理、鉴定Ih3GT酶活性以及利用Ih3GT基因培育竹子新品种奠定了基础。     

β-氨基丁酸对拟南芥叶片花色素苷的影响

研究发现β-氨基丁酸（BABA）处理减少了拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片花色素苷的积累,而且BABA处理降低了花色素苷合成基因（CHS,LDOX,UF3GT）的表达,却上调了苯丙氨酸解氨酶（PAL）的表达,同时促进了花色素苷降解酶多酚氧化酶（PPO）的活性。叶片对DPPH（1,1-二苯基-2-苦基苯肼）的清除能力、总酚和类黄酮含量以及电导率和细胞死亡率的测定表明BABA降低了叶片的抗氧化能力、电导率及细胞死亡率。结果表明BABA处理抑制了花色素苷在叶片中的积累。     

淫羊藿苷对大鼠正畸牙齿压力区牙周组织RANKL和Wnt3a表达的影响

目的:观察不同剂量的淫羊藿苷对大鼠正畸牙齿移动时压力区牙周组织中RANKL和Wnt3a表达的影响。方法:将24只健康雄性SD大鼠随机分为4组,根据淫羊藿苷灌胃的剂量分为生理盐水组(对照组)、1 mg/kg淫羊藿苷组、3 mg/kg淫羊藿苷组、5mg/kg淫羊藿苷组(实验组),使用50 g力近中移动左侧上颌第一磨牙。通过免疫组化方法检测压力区牙周组织中RANKL和Wnt3a蛋白的表达。结果:生理盐水组上颌第一磨牙压力区牙根和牙槽骨表面粗糙,牙周膜间隙变窄,可见骨吸收陷窝和破骨细胞,不同剂量淫羊藿苷组牙周膜间隙趋于恢复正常,骨吸收陷窝出现明显减少。RANKL和Wnt3a在生理盐水组和淫羊藿苷组的压力区牙周组织中都有表达。与生理盐水组比较,不同剂量淫羊藿苷组压力区牙周组织中RANKL的表达均显著降低,Wnt3a的表达均明显增加,且RANKL的表达随淫羊藿苷剂量的增加而逐渐减少(P0.05),Wnt3a的表达随淫羊藿苷剂量的增加明显增加(P0.05)。结论:不同剂量淫羊藿苷能减少正畸时牙齿移动过程中压力区牙周组织中RANKL的表达,增加Wnt3a的表达,且作用与其剂量具有一定的相关性。     

光照对淫羊藿活性成分生物合成的影响

淫羊藿作为传统的中药材,具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效.其主要功能活性成分为黄酮醇苷成分淫羊藿苷、朝藿定A、B、C等.本实验在武汉植物园内的药园和园外园两个不同生长环境下,研究两种不同光照对巫山淫羊藿(Epimedium wushanense T.S.Ying)WY品系和箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum( Sieb.& Zucc.)Maxim.) LT1、HN3品系4种主要活性成分生物合成的影响.结果显示,在药园环境生长的淫羊藿的光合速率要高于园外园生长的淫羊藿,药园生长的箭叶淫羊藿LT1、HN3品系的4种活性成分含量均高于园外园生长的同品系,而巫山淫羊藿WY品系则相反.光合速率对4种活性成分含量的积累有一定影响,与朝藿定A、B和淫羊藿苷含量呈显著正相关,与朝藿定C含量呈显著负相关.文中对光合速率与活性成分积累间的关系进行了讨论,还针对不同的淫羊藿品系提出了相应的栽培建议.     

石榴PgUGT基因表达特性与重组表达分析北大核心CSCD

由糖基转移酶参与的糖基化反应是植物次生代谢产物合成中最广泛的一种修饰方式,也是次生代谢产物结构多样性的机制之一。该研究基于石榴(Punica granatum L.)转录组数据,以石榴果皮为材料,采用RT-PCR克隆得到石榴UDP-糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase,UGT)基因(PgUGT);采用生物信息学技术对编码蛋白的基本特性进行分析,并构建系统发育树;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在果实发育期内的表达模式;结合果实发育期内的总类黄酮和总花色苷含量,分析了基因表达与总类黄酮和总花色苷合成的关系;构建PgUGT的原核表达载体,对其进行原核重组表达。结果表明:(1)成功克隆得到石榴PgUGT基因(GenBank登录号为MW414607);PgUGT基因具有一个1557 bp的开放阅读框(ORF),编码518个氨基酸,预测蛋白分子质量为55.9 kD,等电点为6.55,为不稳定的亲水蛋白;PgUGT具有糖基转移酶家族保守的PSPG基序,属于GT-B糖基转移酶基因家族。进化树分析表明,该编码蛋白属于拟南芥UGT的F类群,与葡萄和草莓的UGT亲缘关系较近。(2)qRT-PCR结果表明,石榴PgUGT基因的表达量在果实发育期内呈先升后降的模式,与总类黄酮含量的逐渐下降和总花色苷含量的逐渐上升趋势并不完全一致。(3)成功构建原核表达载体pCZN1-PgUGT;重组原核表达结果显示,重组质粒在大肠杆菌中为可溶性表达,表达的蛋白分子量约为58 kD。该研究结果为PgUGT基因在石榴类黄酮糖基化反应中的作用及功能奠定了基础。     

盐胁迫对两种淫羊藿属植物生长及各器官总黄酮含量的影响

采用不同浓度NaCl(0、100、200、300和500 mmol/L)的Hoagland's培养液处理两种淫羊藿属植物--淫羊藿、箭叶淫羊藿幼苗,处理30 d后分别测定其株高、叶表面积、干物质生物量以及根、茎、叶的总黄酮含量,以明确淫羊藿属两种药用植物的抗盐特性.结果显示:(1)盐胁迫对淫羊藿和箭叶淫羊藿的生长均有影响,随着NaCl处理浓度的增加,淫羊藿、箭叶淫羊藿的株高和叶表面积均逐渐显著减小;各器官干物质生物量逐渐降低,但淫羊藿的干物质下降量较小(不显著),且同一处理下淫羊藿的生物量明显小于箭叶淫羊藿.(2)随着NaCl胁迫浓度的增加,除淫羊藿茎的总黄酮含量一直呈下降趋势外,淫羊藿根、叶和箭叶淫羊藿根、茎、叶均呈现在低浓度范围内总黄酮含量增加,且箭叶淫羊藿的含量高于淫羊藿;而在高浓度盐胁迫下,其总黄酮含量均呈下降的趋势,且淫羊藿的含量高于箭叶淫羊藿.研究表明,淫羊藿的抗盐性明显高于箭叶淫羊藿,适于高盐土壤环境种植,但在低盐环境条件下,种植箭叶淫羊藿可显著提高总黄酮产量并提高经济效益.     

葡萄风信子MaGT1基因的克隆及其表达分析

该研究以葡萄风信子(Muscari ameniacum)‘亚美尼亚’为试材,克隆了花青素合成途径过程中的类黄酮糖基转移酶基因MaGT1(GenBank登录号MK652470)。该基因开放阅读框全长1 338 bp,编码445个氨基酸,预测蛋白分子量为49.301 kD,理论等电点为5.40。结构分析显示,MaGT1蛋白具有PSPG保守结构域、UDP 糖基转移酶家族结构域和UDP 葡萄糖醛酸基/葡萄糖基转移酶保守域(UDPGT)。进化分析表明,MaGT1蛋白与油棕、海枣、葡萄亲缘关系相近,聚类于类黄酮糖苷糖基转移酶类分支,以UDP 葡萄糖/鼠李糖为主要糖供体。花青苷含量测定显示,花青苷仅在葡萄风信子着色的花中积累,在根、鳞茎和叶以及未着色的花蕾(S1)中几乎检测不到花青苷,且随着花的发育,花青苷含量不断增加,并在衰败期(S5)达到最高。荧光定量PCR分析表明,MaGT1基因的表达具有显著的时空特异性,并在花中优势表达,而在根、鳞茎和叶片中微量表达;在花发育不同阶段,MaGT1基因的表达量随着花发育不断增加,并在盛花期达到峰值。研究表明,MaGT1蛋白催化反应是花青素合成途径中的重要修饰步骤。该研究结果为进一步分析MaGT1基因在葡萄风信子花青素合成和调控中的功能提供了依据。     

芜菁UF3GT基因的克隆及表达特性

目的:克隆‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁的UDP-葡萄糖∶类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(UF3GT)基因并研究其表达特性。方法:利用RT-PCR方法克隆‘津田’芜菁BrUF3GT1基因和‘赤丸’芜菁BrUF3GT2基因,并进行生物信息学分析;通过Northern杂交检测BrUF3GT1和BrUF3GT2基因的UV-A诱导表达特性;对BrUF3GT1和BrUF3GT2基因进行原核诱导表达。结果:BrUF3GT1和BrUF3GT2的开放读框为1407 bp,编码468个氨基酸残基;氨基酸序列分析显示,BrUF3GT1和BrUF3GT2与拟南芥UF3GT的同源性为87%,从第16~453位氨基酸残基的肽段具有糖基转移酶家族成员的结构域;BrUF3GT1和BrUF3GT2基因具有高度同源性,核苷酸序列在7个位点存在差异,推导的氨基酸序列在1个位点存在差异;Northern杂交结果显示,UV-A可以诱导BrUF3GT1和BrUF3GT2基因表达,基因的表达量与处理时间相关;原核诱导表达及纯化后可以获得相对分子质量分别约为51.88×103和51.89×103的BrUF3GT1和BrUF3GT2蛋白。结论:克隆了‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁的UF3GT基因,为初步阐明2种芜菁的花青素生物合成机理奠定了实验基础。     

Characterization of a novel Na+/H+ antiporter gene InNHX2 and comparison of InNHX2 with InNHX1, which is responsible for blue flower coloration by increasing the vacuolar pH in the Japanese morning glory

The reddish-purple buds of the wild-type Japanese morning glory (Ipomoea nil) change into blue open flowers, and the shift in the flower coloration correlates with an increase in the vacuolar pH of the flower epidermal cell. In the mutant deficient in the InNHX1 gene for the vacuolar Na(+)/H(+) antiporter, the vacuolar alkalization occurs only partially, and reddish-purple buds become purple open flowers. While most of the plant NHX genes characterized are generally expressed in leaves, stems and roots and induced by NaCl treatment, the InNHX1 gene is expressed predominantly in the flower limbs at around 12 h before flower opening. It is expressed very sparsly in leaves, stems and roots, and no induction occurs in response to NaCl treatment. Here, we identified a novel vacuolar Na(+)/H(+) antiporter gene InNHX2, which is expressed in leaves, stems and roots and is induced in response to NaCl treatment. In addition, relatively higher expression of InNHX2 was observed in the flower limbs shortly before flower opening. We also discovered that both the InNHX1 and InNHX2 proteins can catalyze both Na(+) and K(+) transport into vacuoles. These results suggest that InNHX2 performs dual functions: to confer salt tolerance on the plant and to promote partial vacuolar alkalization in the petals. The implication is that the InNHX2 protein is probably one of the components responsible for converting reddish-purple buds into purple open flowers by partially increasing the vacuolar pH in the absence of major InNHX1 activity.     

A constitutively expressed Myc-like gene involved in anthocyanin biosynthesis from Perilla frutescens: molecular characterization,heterologous expression in transgenic plants and transactivation in yeast cells

The coordinate expression of anthocyanin biosynthetic genes in leaves and stems of a red forma of Perilla frutescens is presumably controlled by regulatory gene(s). A Myc-like gene (Myc-rp) was isolated from a cDNA library prepared from the leaves of red P. frutescens, and its deduced amino acid sequence shows 64% identity with that of delila from snapdragon. The Myc-rp gene was expressed in leaves and roots of both red and green P. frutescens equally. Comparison of deduced amino acid sequence of Myc-rp with that of Myc-gp, the second allele isolated from a green forma of P. frutescens, indicates that the 132nd amino acid, alanine, existing in MYC-RP was changed to serine in MYC-GP. The heterologous expression of these two alleles of Myc-like gene in tobacco and tomato resulted in an increase of the anthocyanin contents in flowers of tobacco and vegetative tissues and flowers of tomato. However, the flowers of transgenic tobacco expressing the fragment with a partial deletion (encoding 1–115 amino acids deleted) of Myc-gp gave no change in anthocyanin accumulation, but some morphological changes of the flower were observed. In yeast, the MYC-RP/GP and Delila protein exhibited transactivation activity on the GAL-1 promoter from yeast and the promoter of dihydroflavonol 4-reductase (DFR) gene from P. frutescens. A transactivation domain of MYC-RP/GP and Delila could be located in the region between the 193rd and the 420th amino acid of MYC-RP/GP proteins. Our data indicate that this Myc-like gene presumably functions in the regulation of anthocyanin biosynthesis similarly in different tissues of dicot plants.     

天山雪莲UDP葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆及功能分析

UDP葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(Flavonoid-3-O-glucosyltransferas,3GT)是植物重要的次生代谢产物生物合成途径中的关键酶。文中采用现代生物信息手段,经3GT的同源比对后设计基因特异引物,运用RT-PCR及RACE技术从天山雪莲Saussurea involucrata Kar.et Kir.叶片中克隆得到3GT基因的全长序列(GenBank Accession No.JN092127)。3GT基因的cDNA全长序列含有1个1 548 bp的开放阅读框(ORF),编码516个氨基酸,该基因推断的蛋白与草莓GT6蛋白的相似性为91%,与毛杨梅3GT的相似性为89%;经序氨基酸序列比对,推断的天山雪莲3GT具有糖基转移酶基因家族特有的结构域PSPG-box。半定量PCR的结果显示,天山雪莲3GT基因在叶及愈伤组织中表达量最高,在根中有少量表达,茎中不表达。将该基因构建到含有35S启动子的植物表达载体上,利用农杆菌介导的遗传转化法进行同源转化,将筛选到的含有转3GT基因的愈伤组织进行悬浮培养,并用紫外分光光度法测量其黄酮含量是非转基因愈伤组织总黄酮平均值的2.06倍。     

黑果枸杞LrTTG1基因的克隆及表达分析

以黑果枸杞为材料,利用RT PCR和RACE技术克隆了花青素合成相关基因LrTTG1（GenBank登录号为MH633481）。序列分析表明,LrTTG1基因cDNA全长1 453 bp,包含1 029 bp开放阅读框,编码342个氨基酸,含有5个WD40重复基序。同源比对结果表明,LrTTG1与茄子SmTTG1的氨基酸序列相似性较高,达到83.73%。qRT PCR分析显示,LrTTG1基因在茎、叶、花、青果、紫果和黑果中均有表达,且在青果中的表达水平（最高）约为黑果（最低）的4倍;紫外胁迫下LrTTG1基因的表达随胁迫时间的延长呈先降低后升高的变化趋势。花青素含量分析表明,黑果的花青素含量最高（11.3 mg/g）,分别约为紫果（ 1.2 mg/g）和青果（0.53 mg/g）含量的9.4倍和21.3倍。研究表明,随着黑果枸杞果实的发育,LrTTG1基因的表达量呈现下降趋势,而花青素的含量则呈上升趋势,两者呈负相关关系;推测LrTTG1基因在黑果枸杞花青素合成中可能具有重要的调节作用。     

Molecular cloning and tissue-specific expression of two cDNAs encoding polyketide synthases from Hypericum perforatum

Two previously uncharacterized cDNAs encoding for polyketide synthases (PKSs), designated as HpPKS1 and HpPKS2, were isolated from Hypericum perforatum. The full-length HpPKS1 was 1573bp containing an open reading frame (ORF) of 1161bp encoding for a 386 amino acid protein. The full-length cDNA of HpPKS2 was 1559bp with an ORF of 1182bp encoding for a 393 amino acid protein. The highly conserved catalytic amino acid residues common to plant-specific PKSs were preserved in both genes. HpPKS1 and HpPKS2 exhibited distinct tissue-specific expression patterns in H. perforatum. The HpPKS1 expression was highest in flower buds and lowest in root tissues. The expression of HpPKS2 was found to be high in flower buds and leaf margins and low in leaf interior parts, stems and roots. The expression of the HpPKS1 was found to correlate with the concentrations of hyperforin and adhyperforin while the expression of HpPKS2 showed correlation with the concentrations of hypericins and pseudohypericins in H. perforatum tissues.