重组PAI－1在大肠杆菌中的高效表达

纤溶酶原激活物抑制因子－１（ＰＡＩ－１）在天然状态下含量很低。为了进行ＰＡＩ－１的结构与功能的研究,构建了表达重组ＰＡＩ－１的质粒ｐＢＶ２２０／ＰＡＩ－１,并在大肠杆菌中得到了高效表达。最高表达量为菌体总蛋白量的４９％以上,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇ检测,得到了分子量为４３．０ｋＤａ的反应条带。对形成包涵体的表达产物进行变、复性处理及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５的初步纯化,得到了潜伏态的重组Ｐ     

重组PAI－1对u－PA抑制活性的研究

利用大肠杆菌表达的重组纤溶酶原激活物抑制因子－１（ｒＰＡＩ－１）具有许多与天然ＰＡＩ－１相同的性质,ｒＰＡＩ－１对ｕ－ＰＡ抑制活性研究的内容包括：几种化学物质（盐酸胍、尿素、硫氰酸钾、ＳＤＳ、氯化钠等）对ｒＰＡＩ－１的激活作用、盐酸胍激活ｒＰＡＩ－１的浓度与温度效应、显色底物法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纤维蛋白自显影对ｒＰＡＩ－１活性的测定、活性态ｒＰＡＩ－１向潜状态的转变及其与盐浓度和ｐＨ值的关系。     

重组PAI—1对u—PA抑制活性的研究

利用大肠杆菌表达的重组纤溶酶原激活物抑制因子－１（ｒＰＡＩ－１）具有许多与天然ＰＡＩ－１相同的性质,ｒＰＡＩ－１对ｕ－ＰＡ抑制活性研究的内容包括：几种化学物质（盐酸胍,尿素,硫氰酸钾,ＳＤＳ,氯化钠等）对ｒＰＡＩ－１的激活作用,盐酸胍激活ｒＰＡＩ－１的浓度与温度效应,显色底物法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纤维蛋白自显影对ｒＰＡＩ－１活性的测定,活性态ｒＰＡＩ－１向潜状态的转变及其与盐浓度和ｐＨ值的关系。     

在大肠杆菌中高效表达重组Protein A

本文构建了高效表达质粒pPA-3,其在大肠杆菌中表达的重组Frotein A仅含天然Prot—ein A的免疫球蛋白Fc段结台区,表达量达菌体可溶蛋白的20％。sDs—PAGE及western—b1ot结果显示,重组protein A的分子量有4种,即33、32．2,29．5和28．6kDa,其中33kDa与理论计算结果一致,推测其它分子量可能是由于胞内蛋白酶降解所致。一步亲和层析即可将重组Protein A从细胞裂解上清液中纯化出来。火箭电泳及酶联免疫分析结果表明,等蛋白量的该重组Protein A比天然Protein A能结台更多的免疫球蛋白。     

纤溶酶原激活物抑制因子－1突变体E350G，E351K的构建及性质研究

利用ＰＣＲ扩增和合成突变引物的方法,将ＰＡＬ－１的Ｇｌｕ３５０和Ｇｌｕ３５１分别突变为Ｇｌｙ和Ｌｙｓ,在大肠杆菌中表达并分离纯化突变体ＰＡＬ－１（Ｅ３５０Ｇ,Ｅ３５１Ｋ）,用盐酸胍激活并以ＥＬＩＳＡ法确定它与野生型ｒＰＡＩ－１的相对含量。通过对ｕ－ＰＡ,ｔ－ＰＡ抑制的动力学研究表明,突变体与野生型ｒＰＡＩ－１相比,对ｕ－ＰＡ和ｔ－ＰＡ的抑制活性都有明显下降,由活性态向潜伏态转变的半寿期也由０．８３ｈ缩短为０．５７ｈ。     

糖基化、非糖基化、重组PAI－1功能和性质的比较

对从ＨｅｐＧ２细胞培养液中分离得到植基化和非糖基化ＰＡＩ－１（１型纤溶酶原激活物抑制剂）,以及从ｐＹＺＨＢＩ－６６表达菌中纯化的非糖基化重组ＰＡＩ－１的某些性质和功能进行比较,结果显示,糖基化ＰＡＩ－１对ｔＰＡ（组织型纤溶酶原激活物）有较强的抑制,能较显著地被蛋白质变性剂所激活,对热有较强的稳定性,糖基化与非糖基化ＰＡＩ－１在ｐＨ２．５－９．０的范围内都相当稳定。纤维蛋白原和肝素能明显提高两者对ｔＰＡ的抑制作用。     

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早和目前应用最广的经典表达系统。利用该系统表达重组蛋白具有许多优越性,但其表达效率受诸多因素的影响。本文综述国内外利用大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白的策略,主要包括选择合适的启动子、改变信号肽结构、提高mRNA稳定性、提高翻译效率、表达稀有密码子、降低包涵体形成及蛋白降解,利用融合蛋白与分子伴侣、调控发酵条件实现高密度培养等。     

外源基因在大肠杆菌中的高效表达

为了提高外源蛋白在大杨杆菌中的表达量,人们对大肠杆菌表达系统进行了许多研究。作者综述了有关外源基因在大肠杆菌中高效表达的研究进展。     

重组人干扰素—β在大肠杆菌中的表达与活性分析

利用定点突变技术将人干扰素-β第17位半胱氨酸编码序列突变为丝氨酸(IFN-βser17),DNA序列分析证明了其核苷酸序列的正确性,并在大肠杆菌TAP106中获得高效表达,IFN-βser17表达量达20%,用Westemblot得到单一条带,细胞病变抑制法测定其比活性达(2～3)×107U/mg.INF-βser17的比活性和稳定性均超过天然人IFN-β.     

人白细胞介素－3在大肠杆菌中的高效表达

人白细胞介素－３（ｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３,ｈＩＬ－３）是一种造血前体细胞早期分化的关键调节因子。用ＰＣＲ方法从人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中扩增出０．４４ｋｂ的ＤＮＡ片段,并克隆入ｐＵＣ１９载体中。经ＤＮＡ序列测定,确定０．４４ｋｂ的ＰＣＲ产物合完整的编码人白细胞介素－３成熟蛋白ｃＤＮＡ序列,并在信号肽与成熟蛋白编码序列之间通过突变引入了限制性内切酶位点和ＡＴＧ起始密码。构建的ＰＬ启动子控制下的ｈＩＬ－３ｃＤＮＡ表达质粒,转入大肠杆菌Ｔａｐ１０６,经４２℃热诱导,获得ｈＩＬ－３的表达产物。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示表达产物为１５ｋｄ,约占细菌总蛋白的１５％。表达产物经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证。ｈＩＬ－３表达产物在细胞内形成包涵体,纯化包涵体,使产物纯度提高到７０．８％,产物复性后,能明显促进ｈＩＬ－３依赖细胞株生长,具有明显的生物活性。产物转移到ＰＶＤＦ膜后进行Ｎ端序列分析,Ｎ端１６个氨基酸正确。     

中国人r——干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从中国人淋巴细胞ｍＲＮＡ反转录产物中克隆了ＩＦＮ－ｒ－ｃＤＮＡ,序列分析证实了分子进化规律对ＩＦＮ－ｒｃＤＮＡ序列存在多态性的推论。在此基础上应用ＤＮＡ重组技术,将去信号肽中国人ＩＦＮ－ｒ ｃＤＮＡ克隆到原核表达质粒ｐＢＶ２２０ ＰＲＰＬ启动子下游,转化大肠杆菌ＤＨ５ａ,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人ＩＦＮ－ｒ ｃＤＮＡ,其表达水平占全菌可溶性总     

猪肥胖基因在大肠杆菌中的高效融合表达

采用PCR方法扩增猪肥胖基因编码原成熟蛋白cDNA序列,并在5′端加上BamHⅠ位点,3′端加上EoRⅠ位点,将5′端密码子CCC转变为大肠杆菌常见密码子CCG,扩增得到459bp的片段,克隆于融合表达载体p GEX-2TBamHⅠ和EcoRⅠ位点,酶切、测序正确,经0．1mmol/LIPTG诱导表达出一条约42kD的融合蛋白,其中26kD为pGEX-2T中带有的谷胱苷肽转移酶,16kD是猪肥胖基因表达产物瘦蛋白。利用非融合表达产品制备抗血清,检测融合表达的重组蛋白,Western-blot为阳性。     

重组人αB干扰素在大肠杆菌中的克隆与高效表达

人αB干扰素(IFN-αB)是体内具有多种生物学功能的细胞调节因子,能抵御病毒感染和抑制肿瘤细胞生长,在临床上有广泛而重要的应用价值。IFN-α在治疗低度恶性淋巴瘤、慢性白血病、肝炎等方面显示良好的效果,资料表明IFN-αB抑制病毒作用较αD型干扰素强30倍。本文利用基因重组技术构建IFN-αB高效表达菌株E.coli XL-Blue/pBm,经酶(?)鉴定、DNA测序、SDS-PAGE、Western Blot及生物活性测定等分析鉴定,表明能特异性地表达具有生物活性的26 kD IFN-αB。表达水平达到23％(占总菌体蛋白比值),比活为1.0×10~6/mg,具有良好的应用前景。     

单链抗体scFv-GCN4在大肠杆菌中的重组表达及活性检测

目的:重组表达融合GST或MBP标签的单链抗体scFv-GCN4,对其进行分离纯化,并检测其生物学活性。方法:构建pBAD-MBP-scFv-GCN4及pBAD-GST-scFv-GCN4表达载体,使用大肠杆菌(Escherichia coli)Top10菌株表达并亲和纯化重组蛋白MBP-scFv-GCN4及GST-scFv-GCN4。构建p ET30a-Nus-GCN4载体,使用E.coliBL21(DE3)菌株表达重组蛋白Nus-GCN4及Nus。以重组的GCN4为特异性抗原,通过Pull-down技术和WesternBlot技术,检测MBP-scFv-GCN4及GST-scFv-GCN4的抗体活性及特异性。结果:重组菌株E.coli Top10可高效表达可溶性的MBP-scFv-GCN4和GST-scFv-GCN4蛋白,通过亲和纯化,均得到了高纯度的重组蛋白。重组菌株E.coliBL21(DE3)可高效表达可溶性的Nus与Nus-GCN4蛋白。Pull-down及WesternBlot结果显示,重组蛋白MBP-scFv-GCN4及GST-scFv-GCN4均可以高效、特异地识别重组的GCN4抗原。结论:重组抗体GST-scFv-GCN4及MBP-scFv-GCN4均可在E.coli中高效表达,并且具有良好的抗体活性及特异性。     

重组截短型人源结缔组织生长因子在大肠杆菌中的表达

用RT－PCR法从人胎盘组织中克隆出人源结缔组织生长因子（h-CTGF)cDNA序列867bp,将此cDNA亚克隆至表达载体pET-9a,重组质粒转化BL21（DE3）pLysS,诱导出N端缺失61个氨基酸残基的截短型rh－CTGF,表达量占总菌体蛋白的7％,主要以不溶性包涵体形式存在,采用离心、洗涤和凝胶过滤分离纯化后,行活性检测表明截短型rt-CTGF无刺激增殖活性,并对用原核表达rt-CTGF作了讨论,为制备抗体、CTGF表达调控和功能研究打下了基础。     

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的高表达

用RT-PCR法从人肝总RNA库中克隆出人载脂蛋白Al的cDNA序列,再通过重叠PCR将载脂蛋白AI的第179位精氨酸密码子突变成半胱氨酸密码子,即载胎蛋白AI米兰突变体基因。将此目的基因克隆至表达载体pQE30,重组质粒转化JMl09宿主菌,经表达试验筛选出高表达克隆;工程菌经诱导后表达出含6个氨基酸前肽的载脂蛋白AI米兰突变体。表达产物主要以可溶形式存在,但也有部分为包涵体。     

中国人γ－干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达

应用RT-PCR技术从中国人淋巴细胞mRNA反转录产物中克隆了IFN-γcDNA,序列分析证实了分子进化规律对IFN-γcDNA序列存在多态性的推论.在此基础上应用DNA重组技术,将去信号肽中国人IFN-γcDNA克隆到原核表达质粒pBV220 P_RP_L启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人IFN-γcDNA,其表达水平占全菌可溶性总蛋白的44.4%,初步复性后生物学活性测定结果表明γ-IFN表达量为0.45×10⁷～2.34×10⁷单位/L.     

sIL-16在大肠杆菌中的表达及活性分析

用PCR法扩增本室保存的sIL-16cDNA片段,插入含T7启动子的表达载体pET28a( )中构建重组质粒pET-sIL16,转化大肠杆菌BL21(DE3),低温经IPTG诱导蛋白表达,过Ni^2 螯和层析柱一步纯化表达蛋白,重组蛋白与Jurkat细胞共同孵育后,观察它对细胞表面IL-2R表达的影响,结果发现IPTG诱导蛋白表达后,经SDS-PAGE电沪,可以看到在18kD左右出现明显蛋白表达条带,表达量占菌体可溶蛋白的40％左右,纯化蛋白的纯度达90％以上,经重组蛋白处理过的Jurkat细胞表面IL-2R的表达水平比未经它处理的细胞增高了18.54％。