恶性疟原虫杂合多肽抗原融合基因的克隆和表达

合成了５对寡核苷酸片段,分别连接在两种恶性疟原虫杂合多肽（４５肽和５８肽）抗原基因片段（ＨＰＦＧＡ和ＨＰＦＧＢ）的头部和尾部,将这两种片段分别与霍乱毒素Ｂ亚单位（ＣＴ－Ｂ）基因末端融合。两种杂合多肽抗原分别含有数个红内期和红外期有代表性的、并能被Ｔ或Ｂ淋巴细胞识别的保护性抗原表位,ＣＴ－Ｂ基因前端具有促使分泌的信号肽序列。将这两种融合基因的不同重组质粒分别转化大肠杆菌,对转化菌的培养上清检测表明融合蛋白被分泌性表达,既具有恶性疟原虫和ＣＴ－Ｂ抗原性,又保持了ＣＴ－Ｂ与其受体神经节苷脂ＣＭ１结合的生物学活性。     

恶性疟原虫杂合多肽抗原融合基因的克隆和表达

合成了５对寡核苷酸片段，分别连接在两种恶性疟原虫杂合多肽（４５肽和５８肽）抗原基因片段（ＨＰＦＧＡ和ＨＰＦＧＢ）的头部和尾部，将这两种片段分别与霍乱毒素Ｂ亚单位（ＣＴ－Ｂ）基因末端融合。两种杂合多肽抗原分别含有数个红内期和红外期有代表性的、并能被Ｔ或Ｂ淋巴细胞识别的保护性抗原表位，ＣＴ－Ｂ基因前端具有促使分泌的信号肽序列，将这两种融合基因的不同重组质粒分别转化大肠杆菌，对转化菌的培养上清检测表明融     

人恶性疟杂合多肽抗原基因化学合成及克隆

本文报道用固相亚磷酰胺法合成人恶性疟杂合多肽抗原基因。基因全长为216bp,分为10个寡聚核苷酸片段分别合成,然后经T4 DNA连接酶按设计顺序连接成完整的杂合抗原基因,重组到噬茵体M13 mp 18 RF DNA内,转染大肠杆菌JM109。用分子杂交和酶切分析筛选出重组克隆体。经序列分析,证明所合成的人恶性疟杂合多肽抗原基因与所设计完全一致。     

重组痘苗病毒表达乙肝核心抗原基因的研究

pMM2066质粒EcoR I酶切回收ATG前只有12bp的乙肝核心抗原基因片段,将此基因片段插入痘苗转移载体pGJP-5的P7．5启动子后,组建成P5-C2066质粒,通过细胞内同源重组技术,于BudR存在条件下用人TK-143细胞筛选出三株能表达HBcAg的重组痘苗病毒株。感染细胞上清液1：64稀释时仍能用ELISA法测到HBcAg活性,同时也能测到滴度相近的HBeAg活性。免疫电镜可见平均为26．6nm的HBcAg颗粒。进行了不同量的重组痘苗病毒感染不同细胞,和不同培养温度对HBcAg表达影响的观察。     

关于重组乙肝表面抗原纯化收率的研究

本文采用回归分析法研究了超速离心纯化时,固定一次溴化钾密度梯度比例,选择不同的二次溴化钾梯度比例对下一步ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ柱层析纯化收率的影响。结果表明：回归分析不仅能揭示纯化的最佳条件,即,二次溴化钾超速离心时溶液由２４０ｍｌ（１．０４ｇ／ｍｌ）：８００ｍ１（１．２８ｇ／ｍｌ）：６００ｍｌ（１．３２ｇ／ｍｌ）：５０ｍｌ（１．３４ｇ／ｍｌ）构成时柱层析收率最高。而且还能解释层析纯化中出现的异常结果。     

恶性疟原虫子孢子CS抗原融合基因的克隆

利用381-A型DNA合成仪,参照恶性疟原虫子孢子CS抗原决定簇相应氨基酸的核苷酸序列,设计了CS-Ⅰ和CS-Ⅱ两个片段。以噬菌体M13mp18质粒作为载体,将两片段进行磷酸化、退火、连接和克隆,经过原位杂交,序列分析,获得了(NANP)_(10)重复串联基因的重组质粒M13mp18-CS。再以酶切,从重组质粒中回收(NANP)_(10)次的片段,将其片段基因与CT-B基因融合,最后将融合基因CT-B-CS插入载体PMC055中,成功地得到含有(NANP)_(10)与CT-B基因融合的重组质粒pMC055-CS。     

基因乙肝表面抗原纯化工艺的初步改进

本文研究了新的层析介质（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）对原纯化工艺中ＳｅｐｈａｒｓｅＣＬ－４Ｂ柱层析纯化后的乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）组分及ＤＮＡ组分的进一步纯化效果。结果表明：该层析介质可以提高ＨＢｓＡｇ的纯度和收量,并对初步提纯ＤＮＡ组分中的乙肝表面抗原有一定意义。并首次发现ＤＮＡ组分中乙肝表面抗原的ＳＤＳ－ＰＡＧＢ图谱较正常基因乙肝表面抗原的图谱缺少３０ＫＤ的条带。     

日本血吸虫SjRAD23基因的克隆表达及基因重组抗原的免疫保护效果

辐射敏感蛋白23具有核苷酸切除修复功能,在泛素蛋白酶体途径中起到重要作用。本研究利用PCR技术克隆了日本血吸虫辐射敏感蛋白23(Sj RAD23)编码的c DNA序列,成功获得Sj RAD23的基因序列,其ORF为1 053 bp。构建Sj RAD23基因重组表达质粒p ET28a(+)-Sj RAD23,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达,重组蛋白在上清和沉淀中都有存在。利用免疫组化技术检测该蛋白在虫体的分布情况,该蛋白广泛分布在日本血吸虫虫体被膜。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,免疫小鼠血清中检测到较高水平的特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a。Western blotting分析显示重组蛋白能够被日本血吸虫成虫可溶性抗原免疫小鼠血清所识别。用重组蛋白r Sj RAD23免疫结果与206佐剂对照组比较,r Sj RAD23在BALB/c小鼠中诱导了35.94%减虫率,40.59%肝脏减卵率。结果表明Sj RAD23具有作为疫苗候选分子的潜力。     

乙肝病毒表面抗原基因在胡萝卜中的克隆及表达

构建HBV表达抗原（HBsAg)植物表达载体并在胡萝卜植株中表达。采用自行构建adr亚型HBsAg基因克隆T-adr,再次酶切获得860bp含PreS2的HBsAg基因片段,将其插入到植物表达载体pBPC55,新质粒命名为pBPC91adr。将其与含除草剂抗性基因及GUS蛋白基因的筛选质粒pBPC93共同经基因枪（PDS-1000/He)转化胡萝卜悬浮细胞,经含除草剂（Biolaphos)的培养基筛选及植物激素诱导分化,获得除草剂抗性胡萝卜幼苗,结果为转化后8周,自胡萝卜细胞中分化出除草剂抗性胡萝卜幼苗,提取新分化幼苗总DNA,特异性引物PCR扩增后可见860bp扩增带;Southern-Blot证明有HBsAg基因整合,胡萝卜蛋白萃取物的Western-Blot及ELISA检测证实有HBsAg蛋白表达。利用基因枪转化使质粒pBPC91adr中HBsAg基因在胡萝卜幼苗内整合并表达,提示以植物生产疫苗具有可行性。     

含preS2的乙肝表面抗原基因的表达

HBV是一个含有部分单链区的环状双链DNA病毒,由表面抗原蛋白与脂构成的表面外壳和含核心抗原蛋白与病毒基因组的核心组成。编码病毒外壳蛋白即表面抗原的编码区是个大的开放读码区,它可分为S基因、preS2区和preS1区三部分,有三个相应的、彼此位相相同的翻译起始密码子ATG,分别编码分子量为24K和27K的主要S蛋白,     

重组CHO细胞乙肝表面抗原诱导小鼠细胞免疫应答的研究

为了研究重组CHO细胞乙肝表面抗原(CHO-rHBsAg)在小鼠中诱导T细胞免疫应答的能力,全面评价疫苗的免疫原性,以CHO-rHBsAg免疫BALB/c小鼠,常规制备小鼠脾脏淋巴细胞并在体外以抗原或特异多肽刺激;采用ELISA法测定抗原特异性T淋巴细胞分泌的细胞因子,乳酸脱氢酶法(LDH)测定抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性,酶联斑点法(ELISPOT)测定CTL频数(CTLp),应用流式细胞仪分析T淋巴细胞亚群。结果显示,rHBsAg可在小鼠中诱导Th1及Th2类细胞因子;加铝佐剂的rHBsAg较未加佐剂的抗原可诱导较高水平的IFN-γ、CTL克隆及较高百分比的CD8+T淋巴细胞亚群。重组CHO细胞来源的HBsAg可在BALB/c小鼠中诱导一定程度的细胞免疫应答。     

带有PreS的重组乙肝表面抗原在毕赤酵母中的表达

带有ＰｒｅＳ区的乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）有望成为新一代更高效的乙肝疫苗。利用毕赤属酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达系统,表达了带有ＰｒｅＳ区免疫决定簇的理组乙肝表面抗原Ｓ１Ｓ、ＳＳ１和Ｓ２Ｓ。对表达产物的性质鉴定表明,产物可以形成２具有相应的Ｓ、ＰｒｅＳ１或ＰｒｅＳ２抗原性的颗粒,表达水平高于啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）表达系统。     

旋毛虫基因重组抗原的纯化

根据旋毛虫基因重组抗原蛋白的特点,筛选出裂解处理工程菌菌体的方法,并探索了用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００（ＨＲ）柱层析纯化重组蛋白的程序。用本法处理和纯化后,重组蛋白的纯度可达９０％以上。所纯化的三种重组抗原蛋白均能与猪旋毛虫病血清发生特异性反应而不与正常猪血清和猪囊虫病血清反应,其中以重组蛋白ＲＰ３４的特异性最强,ＲＰ３７较弱,ＲＰ４６介于两者之间。研究结果表明,本纯化方法易于操作、设备简单和特异性蛋白回收率高,是处理和纯化旋毛虫基因重组抗原的最佳程序。     

分子筛层析法分析重组乙肝表面抗原聚集物的形成

分子筛层析作为分析蛋白质颗粒聚集物的一种有力工具,被用于研究重组乙肝表面抗原聚集物的形成。已去除聚集物的表面抗原放置在不同的理化条件下或经过不同的纯化方法处理后,应用HPLC分析其聚集物的形成。为研究发酵过程中是否形成表面抗原聚集物,酵母细胞破碎后立即用Sepharose 4 FF层析柱分离为不同的组分,并分别进行HPLC分析。结果发现,在纯化过程和酵母发酵阶段都有表面抗原聚集物的产生。     

毕赤酵母表达的重组乙肝表面抗原SS1的纯化及性质鉴定

对毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达的重组乙肝表面抗原ＳＳ１的纯化以及蛋白质的理化性质及免疫原性进行了进一步的研究。采用单抗亲和层析的方法,一步纯化即可得到纯度为９５％的纯化蛋白质。ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定表明,纯化的ＳＳ１融合蛋白同时具有良好的Ｓ和ＰｒｃＳ１抗原性。ＣｓＣ１密度梯度离心和电镜检测的结果则表明,这一重组抗原可以形成与ＨＢＶ亚病毒颗粒类似的颗粒结构。在ＢＡＬＢ／     

基因诱变、重组、克隆

950826引人大受多个寡囊棱苷酸介导的插人物的快速方法[英]/Warrilow,D.…,BioTechnique$.一1992,13(1).·42～45[译自DBA,1992,11(17),92-095373 新方法可将4个彼此分开的25bp的插入物导入小鼠Moloney白血病病毒原病毒的一个525bp的片段。可通用于制造大型多个插入物。引物经退火与单链模板连接,并进行突变链的合成。产物经限制酶酶切后进行电泳,以区分载体的、异源双链的以及插入的DNA。接着将突变异源双链DN。A克隘到抑铡甲基化的双链载体,以防甲基导致的错配修复。用限制酶分析来筛选克隆。通过双链定序确认所需的序列。因为合成…     

基因诱变、重组、克隆

923552甲醇利用型嗜甲基菌属耐热菌株的高效电激转化[英]/Haider,M.Z.…/Acta Biotechn01.一1991,21(4)一295~301[译自DBA,1902,11 (7),92一03606〕 采用pUC19、pBR322、pCMi、pUC/CAT以及由pSAS片段与pUC19的重组质粒(P USM4、pUSFio、pUSMZo)作为载体。分别用感受态、原生质体和电激三种转化法转化万eth好。夕瓜-105属菌株KISRI一5112(NCIB 12138)、KISRI一512(NCIB 12137和KISRI一6.1(NCIBiZi36)。在25产F、3 kV、1 .5一5 kV/cm电激条件下成功地转化了质粒(P UCM20的转化率达180万转化子/拼9 DNA),并稳定…     

基因诱变、重组、克隆

922825使用诬式亲和融合法从大肠杆菌中经蛋白水解得到的盆组蛋白的祖定性〔英〕/Murby,M.…,Bi-oteehnol.Appl.Bioehe。一二1991,14(3)一336~346〔译自DBA,1992,11(s),92一0122‘]一31一本技术包括:构建一些融合基因,‘已们编码一些目标蛋白,如人的原胰岛素(Pl)、大鼠蛋白-二硫化物异构酶(PDI)硫氧还蛋白同源区1等 (即蛋白A的IgG一结合蛋白(22)和蛋白G的白蛋白结合区(BB)间的融合),在IgG一Sephar-ose上纯化。对ZZPI(质粒pRIT37)和ZZPIBB (质粒pRIT38)进行SDS一PAGE和Western印迹揭示,产生的Pl在体内是稳定的。从大肠杆…