腐皮镰孢聚丁二酸丁二酯解聚酶基因优化及在毕赤酵母中的表达

聚丁二酸丁二酯是一种可替代传统塑料的生物降解塑料,有助于解决白色污染问题,但其在自然界中往往降解缓慢,获取高效降解微生物或解聚酶是使其快速有效降解的关键。通过构建重组毕赤酵母表达体系以实现腐皮镰孢聚丁二酸丁二酯解聚酶(FSC)的高效表达。根据毕赤酵母偏好密码子优化FSC的基因密码子,并导入毕赤酵母X33中实现其重组表达。进一步通过单因素实验优化了菌株的产酶条件。结果显示,优化后的FSC基因序列中的157个碱基发生改变,G+C含量由59.6%降低到48.3%,序列同源性为77.34%;构建的重组表达载体p PICZα-FSC转入毕赤酵母X33,结合抗性平板初筛、SDS-PAGE和Western bolt验证,以及摇瓶发酵酶活力测定获得了1株具有较高产酶能力的重组菌株L1;进一步确定其摇瓶发酵培养条件:培养基起始p H 6.0,摇床转速220 r/min,甲醇补加量1%,接种量8%,培养时间72 h,培养温度30℃,此优化条件下菌株发酵液酶活力可达110 U/mL。     

重组毕赤酵母表达棘孢木霉几丁质酶Tachi1的酶学性质研究及表达条件优化

【目的】对转棘孢木霉几丁质酶基因tachi1的毕赤酵母工程菌GS-tachi1-K进行诱导表达,研究重组几丁质酶Tachi1的酶学性质,优化表达条件。【方法】对GS-tachi1-K进行甲醇诱导培养,纯化目的蛋白Tachi1进行几丁质酶酶学性质的研究;通过单因素和正交试验对GS-tachi1-K菌株产几丁质酶Tachi1表达条件进行优化。【结果】GS-tachi1-K表达的几丁质酶Tachi1表观分子量约为44 kDa,酶反应最适的温度和pH分别为50℃和5.5,具有较宽的温度、pH适用范围;50℃以下保持较高的酶活力,在碱性条件下稳定性较差;受Ag+、Hg2+、Cu2+、Fe2+和高浓度的SDS及β-巯基乙醇强烈抑制。该菌株的最佳表达条件为:pH为6.5,甲醇诱导浓度为0.5%,起始细胞浓度为OD600=2,甲醇诱导时间为180 h;几丁质酶Tachi1活力可达17.93 U/mL,蛋白表达量为6.19 g/L。【结论】成功实现了棘孢木霉新几丁质酶基因tachi1的毕赤酵母高效分泌表达,工程菌GS-tachi1-K具有高表达量和表达产物酶活性高两个特点,明确了几丁质酶Tachi1的酶学性质和最佳诱导表达条件,为该几丁质酶及其基因的深入研究和开发利用奠定了基础。     

两步培养法测定真菌产孢营养需求

生防真菌产孢条件的测定一般都是通过连续培养方法,即在同一种限定培养基上完成其生长和产孢过程。文中我们提出分离真菌的生长和产孢阶段,测定产孢营养需求的两步培养新方法。6种生防真菌首先在平板上进行营养生长,然后转移至营养成分和浓度确定的新鲜培养基中继续产孢过程来测定菌株产孢阶段实际营养需求。通过与连续培养方法比较,发现只有淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus、金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae二者产孢条件一致,而厚孢轮枝菌Pochonia chlamydosporia、球孢白僵菌Beauveria bassiana、蜡蚧轮枝菌Lecanicillium lecanii、绿色木霉Trichoderma viride菌株产孢的营养条件存在显著的差异。基于这一方法,确定了绿色木霉最佳产孢条件,即起始碳浓度2g C/L,碳氮比10:1,最佳碳氮源组合纤维二糖和酵母浸膏,为真菌生防制剂生产调控提供了依据。     

地生枝顶孢(AT01)胞外多糖发酵条件的研究

研究地生枝顶孢AT01菌株胞外多糖发酵工艺,主要内容包括碳源、氮源、起始pH及接种量等.AT01胞外多糖的最佳培养基组成白砂糖4%,黄豆粉3%,磷酸氢二钾0.5%,氢氧化钙O.3%,MgSO4·7H2O O.05%,pH自然(6.7).最佳培养条件接种量为1O%,起始pH为6.7,装液量为100mL/250mL.     

MXR1基因对毕赤酵母工程茵代谢调控的影响

为了研究毕赤酵母中转录因子Mxrlp在毕赤酵母代谢调控中所起的作用,构建一株以南极假丝酵母脂肪酶B基因(CALB)作为报告基因,MXR1基因完全缺失的毕赤酵母基因工程菌株.将重组质粒pPIC9K-CALB转化毕赤酵母GS115,利用三丁酸甘油酯平板筛选得到分泌表达CALB的重组茵GS115/pPIC9K-CALB.通过重叠延伸PCR方法获得一段中间含有博来霉素抗性基因sh ble,两翼大约各有1 200 bp与毕赤酵母MXR1基因上下游同源的基因片段,将此片段用氯化锂法转化毕赤酵母细胞GS1 15/pPIC9 K-CALB后,利用博来霉素抗性及CALB酶活力丧失双重筛选的方法得到一株MXR1基因完全缺失的毕赤酵母基因工程菌株.该菌株在以甲醇为唯一碳源的培养基中不生长,在以乙醇、葡萄糖或者甘油为唯一碳源的培养基中生长缓慢.结果表明转录Mxrlp因子在毕赤酵母中的多条代谢途径中起着关键性的作用,主要涉及甲醇、乙醇、甘油和葡萄糖等代谢途径.     

麦根腐平脐蠕孢有性生殖生物学研究

本文报道麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana(有性型为Cochliobolus sativus)人工诱导形成子囊座,并获得该菌A和a两种不同交配型。子囊座形成的最佳条件是:以麦秆浸汁琼脂为培养基(pH6—6.5)。以透析袋为培养基物,24℃培养1周,移至20℃培养2周。培养中光照不是重要因素。在无培养基物的培养基上不形成子囊座。对不同地区、不同寄主植物上麦根腐平脐蠕孢72个菌株交配型测定结果,两个不同交配型在自然界分配比例为1:1,交配型菌株的分布与地理、寄主植物的差异无相关性。     

一株高产胞外壳聚糖酶的优良新菌株

经过对1,000多株细菌和真菌的筛选,获得一株直生顶孢霉(Acremonium strictum)菌株F-480,抗生素诱变后,选育出一株高产胞外壳聚糖酶的优良突变菌株CH-208,通过最适碳源、氮源、诱导物、微量元素,通气量以及培养起始pH的考察,用正交试验方法,对培养基组成和培养条件进行优化,酶活力比原菌株提高了1倍。     

重组人小分子抗体ScFv-Fc发酵条件的优化及纯化

目的:研究重组人小分子抗体ScFv-Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,以及ScFv-Fc的纯化方法。方法:分别从甲醇浓度、pH、诱导时间等方面对毕赤酵母重组菌株产生ScFv-Fc的发酵过程进行了优化;通过硫酸铵沉淀结合protein A亲和层析柱,对ScFv-Fc的纯化方法进行了研究。结果:确定ScFv-Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件为:在pH5.2的条件下,以0.5%甲醇诱导72 h。经过protein A亲和层析柱纯化后,ScFv-Fc纯度可达94%以上。结论:确定了ScFv-Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件以及纯化方法,为重组抗体分子诊断、治疗试剂的开发以及抗体的人源化奠定了物质基础。     

甲醇毕赤酵母表达木质素过氧化物酶的研究

将含有黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosprium)木质素过氧化物酶基因的甲醇毕赤酵母工程菌进行了鉴定和筛选,筛选得到木质素过氧化物酶活力高的菌株PMLIP08。确定了一步法发酵的最优葡萄糖浓度,优化其发酵培养条件,结果表明葡萄糖的添加量为10g/L时,发酵条件为pH3.0,诱导温度24℃,培养时间12h,甲醇添加量1.1%,诱导时间72h后发酵液中酶活可达4888U/L。     

重组人小分子抗体ScFv-Fc发酵条件的优化及纯化

目的：研究重组人小分子抗体ScFv—Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,以及ScFv—Fc的纯化方法。方法：分别从甲醇浓度、pH、诱导时间等方面对毕赤酵母重组菌株产生ScFv-Fc的发酵过程进行了优化;通过硫酸铵沉淀结合proteinA亲和层析柱,对ScFv—Fc的纯化方法进行了研究。结果：确定ScFv—Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件为：在pH5．2的条件下,以0．5％甲醇诱导72h。经过proteinA亲和层析柱纯化后,ScFv—Fc纯度可达94％以上。结论：确定了ScFv-Fe在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件以及纯化方法,为重组抗体分子诊断、治疗试剂的开发以及抗体的人源化奠定了物质基础。