维生素B12生物合成基因的克隆技术

美国Genex公司的研究人员克隆了11种编码巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中维生素B12生物合成途径上有关酶的基因,这是一项开发维生素B12高产微生物的专利计划的一部分。这11种基因占整个维生素B12生物合成途径所涉及的20～30基因的很大一部分。巨大芽孢杆菌的一个菌株当它自己合成维生素B12时,可以利用乙醇胺作为单一的氮源。该菌株的许多突变体在维生素B12生物合成途径的某处出现缺陷,因此这些突变体就不能在     

不同发酵材料对甲烷杆菌合成维生素B_(12)的影响

维生素B_(12)也称氰钴胺素,是首先在动物性蛋白质中被发现的一种促生长因素,后来在城市下水道、污水处理厂的活性污泥和沼气残留物中被发现。无论动物或植物都不能合成维生素B_(12),它只能由某些微生物合成,如灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、菲德力丙酸杆菌(Propionibacterium freudereichii)、舒氏丙酸杆菌(P·shermaii)等。在嫌氧发酵过程中,某些甲烷菌如欧氏甲烷杆菌(Methano bacterium omelianski)的生长,也产生维生素B_(12)。日本小野英男于1950年报道了测定酒     

发酵法生产维生素B_(12)

日本石油公司开发了发酵法生产维生素B_(1 2),(Ⅰ)的技术。     

美重组淀粉酶得到该国FDA认可在世界上首次实现商品化

美国CPC International公司(新泽西州恩格尔伍德克列夫斯的子公司Enzyme Bio-Systems(EBS)公司用重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生产的淀粉酶“BMA”已得到美国食品及药物管理局(FDA)的认可。这种“BMA”是来自巨大芽孢杆菌(B.megaterium)的酶,能提高从淀粉生产葡萄糖的过程的产量的作用。由于该菌在大量培养时酶的产率很低,所以由重组枯草芽孢杆菌的生产有很高的实用价值(参阅本刊1987年3月9日     

耐碱性木聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及其酶学性质

摘要：【目的】从耐碱性木聚糖酶高产短小芽孢杆菌中克隆得到带有自身启动子的木聚糖酶基因,将其在巨大芽孢杆菌中进行表达,并对表达产物进行性质分析。【方法】将克隆得到的木聚糖酶基因xynA以及带有自身启动子序列的结构基因, 构建在芽孢杆菌表达载体pWH1520和改造后的载体pWG03中,得到重组质粒pWTEJX和pWGXYN,分别转化到巨大芽孢杆菌BM70中,获得重组巨大芽孢杆菌BMJXH9和BMGpp12;经过诱导产酶培养,均得到分泌表达。【结论】重组巨大芽孢杆菌BMGpp12比BMJXH9产酶活力提高了三倍     

日本石油公司引进用基因操作生产维生素B_(12)的技术

维生素B_(12)是对贫血、肝病、末端神经炎、胃液缺乏病等有效的药物。现在日本每年进口量约3600Kg。市场价每公斤150—200万日元。现采用链霉菌(Streptomyces)等菌发酵法来生产维生素B_(12)。因其分子结构复杂而难以用有机合成法制造,所以它的生产成本、市售价格均高于其他维生素。看来采用基因操作法是开发维生素的好途径。     

美国Mycogen公司在日本寻求开发微生物农药的合伙人

美国 Mycogen 公司(加利福尼亚州圣迭戈)正在日本寻找开发微生物除草剂和重组微生物杀虫剂的合伙人并开始销售。计划是提供该公司的所有技术的独占权,并开发适应包括日本在内的亚洲地区的微生物农药。介绍日本企业和 Mycogen 公司合作的是三菱商事公司。Mycogen 公司是一个风险企业,它探索有用微生物和来自微生物的生理活性物质,设法将它们用于农业。它拥有100多株杀虫谱不同的微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌(Bacillus th-uringiensis,Bt),并从60株中克隆化了毒素基因。它发现了对马铃薯甲虫有效的苏云金芽     

武夷山地衣表生和内生芽孢杆菌种群的多样性

摘要:【目的】分析武夷山地衣表生和内生芽孢杆菌种群的多样性。【方法】从武夷山自然保护区采集扁枝衣属(Evernia)、珊瑚枝属(Stereocaulon)、孔叶衣属(Menegazzia)等分属于7科9属的地衣样品9份,分离地衣表面附生(表生)和内生芽孢杆菌,并根据16S rRNA基因序列同源性对分离得到的芽孢杆菌进行种的鉴定。【结果】未从扁枝衣属、树花属(Ramalina)和茶渍属(Lecanora)的3个样品中分离出表生或内生芽孢杆菌,从另外6个样品中分离出芽孢杆菌34株,分别鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)和绿芽孢杆菌属(Viridiibacillus)的24个种。类芽孢杆菌属、芽孢杆菌属是这些地衣表生、内生芽孢杆菌的优势种群,分别占分离得到菌株的41.2%(14株)和35.3%(12株);短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和绿芽孢杆菌属为首次报道从地衣中分离获得。从不同的地衣样品分离的表生和内生芽孢杆菌的种类、数量存在差异。蜈蚣衣属(Physcia)表生的芽孢杆菌数量最多、可达3.85×106 cfu/g,而珊瑚枝属表面附生和内生芽孢杆菌的种类最多、共有12个种。分离到的芽孢杆菌大部分来自单独的一种地衣;台中类芽孢杆菌(Paenibacillus taichungensis)、土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)等4个种存在于2－3种地衣中;蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)分布最广,在蜈蚣衣属、珊瑚枝属等4种地衣中都有存在。【结论】武夷山地衣表生和内生芽孢杆菌存在种类和数量的多样性。     

重组植物培育法的开发

日本制纸公司成功地开发了不残留标识基因(标记基因)而可导入多重基因的植物基因重组技术。首先用烟草确立了该技术,接着又用白杨高效率地获得性状转化体,这项基因导入技术被命名为MAT(Multi-Auto-Transformation)载体系统。日本制纸公司将其技术应用于白杨和桉树、松树等制纸用树木的重组育种。该公司用基因重组抑制木质素的生物合成系,进行树木育种(适合纸浆化的),要抑制木质素生物合成系,进行单基因操作是不够的,所以开发了多重基因导入法。     

筛选脱氮假单胞菌启动子提高维生素B_(12)产量

维生素B_(12)(VB_(12)/钴胺素)具有多种生理学功能,广泛应用于制药、食品等行业。脱氮假单胞菌是维生素B_(12)常用工业菌株之一。通过筛选高表达启动子来过表达VB_(12)合成途径基因,能有效提高菌株的VB_(12)生产能力。通过对脱氮假单胞菌中某些编码热激蛋白和分子伴侣基因前含启动子在内的非编码序列用启动子在线预测软件进行分析,选取P_(ibpA)、P_(cbpA)、P_(dnaJ)、P_(htpG)、P_(dnak)、P_(grpE)的非编码区与编码绿色荧光蛋白的GFP报告基因相连,通过酶标仪检测GFP的荧光信号值,对编码热激蛋白和分子伴侣基因前的非编码区所含有的启动子的表达强度进行评估,以获得高表达的启动子对VB_(12)合成途径的基因进行过表达。结果表明,含有启动子P_(dnak)的非编码区,其表达的GFP荧光值最高。进而构建强启动子P_(dnak)与维生素B_(12)合成途径基因cobA的过表达重组菌,发酵数据表明,与对照菌株相比重组菌株维生素B_(12)产量提高21.5 mg/L。筛选高表达启动子用于维生素B_(12)合成途径关键基因的表达,是一种有效的提高维生素B_(12)产量的方法。     

转录组分析揭示玉米大斑病菌对解淀粉芽孢杆菌胁迫响应机制

在植物病害生物防治系统中,生防微生物的生物防治机制是关注的重点,而植物病原物如何响应并抵抗或缓解生防微生物胁迫的机制往往被忽略.本文以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)为生防互作系统,利用RNA-seq技术研究S.turcica对B.amyloliquefaciens生防胁迫响应的分子机制,结果表明,与对照S.turcica样品比较,B.amyloliquefaciens发酵液处理的S.turcica样品中共有393个基因显著差异表达,其中168个基因上调表达,225个基因下调表达.已知解淀粉芽孢杆菌的抗菌物质一般作用于真菌细胞壁、细胞膜,通过破坏细胞壁及细胞膜的结构抑制真菌生长,因此,本研究在差异表达基因中重点分析S.turcica细胞壁、细胞膜结构相关基因,发现S.turcica上调表达细胞壁组分蛋白(1-6)-beta-D葡聚糖生物合成途径基因、麦角固醇合成途径Delta(14)甾醇还原酶基因、脂肪酸合成酶基因、抗氧化相关的抗坏血酸过氧化物酶基因、谷胱甘肽硫转移酶基因、腺苷三磷酸结合盒转运蛋白基因;下调表达调控细胞凋亡的Metacaspase基因.这说明S.turcica通过调节芽孢杆菌抗菌活性物质的靶标蛋白或合成途径的基因表达,以缓解B.amyloliquefaciens的生防胁迫作用,是一种涉及多个基因和多个信号途径共同参与调控的复杂网络.该研究结果将为研究病原真菌对生防微生物胁迫的抗性机制奠定基础.     

一种费氏丙酸杆菌细胞离位转化生产维生素B_(12)的方法

为建立费氏丙酸杆菌的半连续耦合发酵工艺,克服DMB对维生素B_(12)连续发酵的不利影响,考察了费氏丙酸杆菌菌体细胞离位转化合成维生素B_(12)的可行性,优化了其离位转化工艺,确定了最佳的转化时机、转化体系及DMB添加方式,具体如下:当发酵进行至84 h时,将发酵液离心,收集菌体,然后用离心上清液重悬菌体,配成5倍浓度的菌液,加入终浓度为4.5 mg/L的DMB,于30℃条件下转化48 h,维生素B_(12)的产量达到108.06 mg/L,转化效率为2.26 mg/(Lh)。     

91年12月销售重组胰岛素

新北欧药物公司在12月销售5种重组人胰岛素制剂。这是用美国Zymogenetics公司开发的酵母为宿主,利用基因操作技术制造的。该公司现也已申请引进配合型和注射制剂等,1992年将胰岛素制剂更换成重组人胰岛素,分割该公司和日本市场的盐野义制药公司、美国Eli Lilly公司从1986年销售重组人胰岛素。日本决定1992年用基因操作技术制造胰岛素。丹麦Novo Nordisk公司开发用蛋白分解酶将猪胰岛素(有一个氨基酸序列与人的不同)变换成人型的制造     

不同来源的尿卟啉原Ⅲ转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素B_(12)的影响

S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖型尿卟啉原Ⅲ转甲基酶(S-adenosy-L-methionine uroprophyrinogen Ⅲ methyltransferase,SUMT)催化尿卟啉原Ⅲ(uroprophyrinogen Ⅲ,urogen Ⅲ)中心碳原子C-2和C-7甲基化生成前咕啉-2,是维生素B_(12)生物合成途径中的一步关键酶。本文分别克隆了荚膜红细菌来源的RCcob A1,RCcob A2和脱氮假单胞菌来源的PDcob A,并在VB_(12)生产菌株脱氮假单胞菌中过表达和发酵。通过对三株重组菌维生素B_(12)发酵结果分析可知,SUMT(PDcob A),SUMT1(RCcob A1)和SUMT2(RCcob A2)的表达有利于维生素B_(12)产量的提高,与对照菌株相比分别提高了16.48%,10.2%和31.86%。根据摇瓶发酵的结果在5 L发酵罐上进行了放大实验,p BBR122-PblaRCcob A2的产量为144.5 mg/L,相比对照菌p BBR122-Pbla(111.3 mg/L)产量提高了29.83%左右。结论:SUMT的表达可以在一定程度上解除维生素B_(12)合成途径中的瓶颈,提高维生素B_(12)产量。     

海绵共生萎缩芽孢杆菌C89 PPTase bap基因的异源表达

【背景】磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)催化非核糖体肽合成酶(NRPS)中肽酰载体蛋白(PCP)从无活性的脱辅基形态转化为有活性的全辅基形态,从而启动非核糖体肽类化合物的生物合成。【目的】鉴定贪婪倔海绵共生萎缩芽孢杆菌C89中Sfp型PPTase Bap,验证Bap激活NRPS中PCP的能力。【方法】通过BLAST和氨基酸多序列比对鉴定萎缩芽孢杆菌C89中Sfp型PPTase Bap。将bap基因在sfp基因突变株枯草芽孢杆菌168中异源表达,通过重组菌枯草芽孢杆菌168-bap的代谢物检测非核糖体肽类化合物Surfactin。【结果】Bap为Sfp型PPTase,检测到重组菌枯草芽孢杆菌168-bap中Surfactin的产生。【结论】本研究为海洋萎缩芽孢杆菌中NRPS基因簇的异源表达奠定了基础。     

苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因穿梭质粒的构建

在农业生产中长期使用化学农药已对环境和生态平衡造成一定破坏作用,同时有不少害虫也逐渐产生抗药性从而引起某些害虫的大流行,给农业生产带来巨大损失。应用苏云金杆菌杀虫蛋白基因(Bt基因)可构建具有抗虫作用的抗虫工程菌,这样通过拌种或植物叶面喷雾可达到快速、经济、有效的防治虫害的目的。国际上抗虫工程菌研究应用很快,如美国将BI基因转入到一种正常情况下定居在植物组织中的棒杆菌,将这种工程菌拌玉米种子,这样随植物生长该菌在植物体内大量繁殖,当玉米螟在茎和叶取食时,即因食用表达苏云金杆菌毒蛋白的工程菌而死亡。 田颖川等已克隆了苏云金芽孢杆菌内毒素基因CryIA(b)和CryIA(c)。本文将Bt基因CryIA(c)插入到大肠-枯草穿梭载体pBE-2中构建成Bt毒蛋白基因穿梭质粒pAMY,利用电穿孔法转人大肠杆菌DH5a,枯草芽孢杆菌B.subtilis BR151,IA511,野生型蜡状芽孢杆菌B.cereusa-47,短芽孢杆菌B.brevis A-5和枯草芽孢杆菌90-8,获得了具有较高杀虫活性的工程菌克隆。     

用杀虫基因操作常绿树细胞

美国维斯康星大学Madison分校、美国Agracetus公司及加拿大The Forest Bioteehnology Center的研究组将苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白基因插入白唐桧(松树)的细胞获得成功。研究组用从基因转化细胞生长的植物组织研究对食唐桧树芽的毛虫的效果。这种毛虫给美国北部和加拿大的树和唐桧树带来毁灭性灾害。研究组使用基因枪将含有编码BT杀虫基因质粒的金微粒打入唐桧树的胚细胞。这种细胞形成愈伤组     

代谢工程在核黄素生产上的应用

核黄素(维生素B2)为天然水溶性的B族维生素,是维持机体代谢所必须的营养物质。目前核黄素的工业化生产主要有微生物发酵法和化学半合成法两种,其中微生物发酵法以生产工艺简单、原料廉价、环境友好以及资源可再生等优点而倍受世界核黄素生产商的青睐。代谢工程是近二十年来发展起来的新型学科,主要利用分子生物学技术对细胞进行遗传修饰,从而改进产物生成或细胞特性。为进一步提高核黄素产量,通过代谢工程手段构建出了核黄素高产菌株,其中尤以枯草芽孢杆菌最为成功。要得到较高的核黄素产率,必须保证碳架、能量等价物以及氧化还原辅(酶)因子在细胞代谢过程中处于适当的比率。以枯草芽孢杆菌进行核黄素生产为例,主要从增强碳源和能源利用效率、增强核黄素生物合成途径代谢流以及解除核黄素生物合成过程中的反馈调节方面综述了代谢工程在指导核黄素生产方面的应用,并讨论了其未来的发展方向。     

Genex公司宣布一种新的抗体设计

Genex公司(盖瑟斯堡,马里兰州)已提出关于设计和生产一些新的单链抗体的专利申请,这些抗体是该公司利用其专有的遗传操作技术研制成的。Genex公司认为,一旦被广泛获得,这些单链抗体能革新用于诊断、治疗、传感装置和分离技术的一些抗体的用途。这些单链抗体是通过将轻链可变区的特定区域和重链可变区的特定区域与一些短肽衔接物连接后构成的杂种分子。通过用计算机分析,Genex公司的科学家们设计出了这些肽衔接     

巨大芽孢杆菌分子伴侣GroES和GroEL新基因的克隆及同源性分析

巨大芽孢杆菌作为革兰氏阳性细菌的一种,是良好的重组蛋白的表达宿主.本研究利用PCR技术从巨大芽孢杆菌基因组克隆出一条1.9Kb的基因片段.核酸序列分析结果表明,该片段全长1984bp,包含2个ORF,分别与芽孢杆菌来源的GroES和GroEL基因有高度的相似性.氨基酸序列比对发现,GroES蛋白与枯草芽孢杆菌来源的GroES蛋白氨基酸序列同源性为91%,GroEL蛋白氨基酸序列同源性为90%.