SiRNA干扰HSV-1即刻早期基因α22效应的初步分析

以HSV1即刻早期基因α22为靶点,应用T7 RNA聚合酶体外合成siRNA-1和siRNA-2序列,脂质体转染法将其导入Hep-2或KMB17细胞,再接种HSV1病毒,通过细胞形态和病毒滴度的测定,初步探索了siRNA干扰α22基因的的效应.结果表明,在Hep-2中,转染siRNA的实验组与对照组的细胞病变时间相同,子代病毒的生长曲线也没有显著差异;而分别转染或共同转染siRNA-1和siRNA-2 于"限制"性细胞KMB-17中,接种病毒后,ICP22特异的siRNA对HSV1的复制则表现了相应的干扰作用,细胞病变慢,子代病毒的最高滴度峰值出现较晚.     

转染E1B55K基因提高Hep2细胞包装肠腺病毒Ad41的能力

人F组腺病毒Ad40、Ad41难以在体外培养的细胞中传代,被称为难养腺病毒(Fastidious adenovirus).本研究观察了在Hep2细胞表达Ad41 E1B55K基因对Ad41复制的促进作用.从Ad41阳性粪便标本中用PCR的方法获得E1B55K基因,构建真核表达载体,转染Hep2细胞,筛选单克隆,用RT-PCR检测了E1B55K基因的表达.用引起293细胞完全CPE比较产毒量的方法对所得细胞克隆进行初步筛选,获得一株产毒相对较强的细胞Hep2-E1B#4.与对照细胞Hep2、Hep2-DNA3相比,等量Ad41接种Hep2-E1B#4产生的细胞病变效应(CPE)程度明显加深.用免疫细胞化学的方法测定产毒的感染滴度,等量Ad41接种后,Hep2-E1B#4产生的子代腺病毒滴度大于对照的9倍;半定量PCR测得Hep2-E1B#4子代病毒基因组拷贝数约为对照细胞的4倍.结果说明转染E1B55K基因促进了Ad41在Hep2细胞的复制,获得的Hep2-E1B#4细胞株可用于Ad41的分离、培养和体外扩增.     

siRNA干扰HSV1 gD糖蛋白基因的研究

以HSV1 gD糖蛋白基因为靶点,设计合成5对siRNA,并构建pEGFP-N1-gD融合表达质粒,脂质体法共转染Vero细胞,利用绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的特征,流式细胞仪筛选特异沉默gD表达的siRNA。然后有效siRNA转染Vero细胞并感染HSV1,通过空斑减数实验,Real-time PCR和子代病毒滴度评价其对HSV-1感染的作用。结果显示siRNA能有效抑制gD-EGFP融合蛋白和感染细胞内gD糖蛋白的表达,但对HSV-1的感染性无明显抑制作用,故选择gD作为siRNA抗病毒靶点还需进一步的论证。     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

Ⅲ型登革病毒D9964株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育纯化及其增殖动力学研究

选育出Ⅲ型登革病毒中国株在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应株并对其生物学特性和增殖动力学进行研究,为研究登革病毒减毒活疫苗奠定基础。Ⅲ型登革病毒中国株D9964经RT-PCR鉴定型别正确后,进行毒种扩增和滴度测定;以4.0MOI接种KMB17细胞,反复传代直至病毒能在细胞中适应和增殖;连续传10代,选育出KMB17细胞适应株,经三轮噬斑纯化筛选适应株,微量滴定法检测10代病毒培养液的感染性滴度;免疫荧光法检测纯化病毒株的抗原性;将病毒纯化株接种KMB17细胞,取第3～7d细胞提取RNA,以Real-time PCR检测病毒适应株在细胞中的增殖动态。结果显示,经适应性培养后Ⅲ型登革病毒中国株D9964能在KMB17细胞中稳定增殖,经噬斑纯化获得了高纯度的细胞适应株,病毒保持了原始毒株良好的抗原性;增殖动力学研究显示第5～6d为病毒在细胞内的增殖高峰期。     

Ⅱ型登革病毒D01090株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育及初步鉴定

目的:选育能在人胚肺二倍体细胞KMB17上稳定增殖的Ⅱ型登革病毒适应株,为研发以人源性细胞为基质的登革疫苗候选株奠定基础。方法:将Ⅱ型登革病毒中国株D01090提取病毒基因组,通过RT-PCR法进行登革病毒型别鉴定后,在C6/36和Vero细胞上进行毒种扩增和滴度测定;将D01090毒株以4.0MOI接种KMB17细胞并反复传代至病毒完全适应在细胞内扩增,并连续传代10代,选育出良好的KMB17细胞适应株;病毒培养液经蔗糖梯度离心和超速离心后获得高浓度病毒液,接种KMB17细胞后通过透射电镜超薄切片检测细胞的病理变化;然后经过三轮蚀斑纯化筛选出纯化病毒株,免疫荧光法检测病毒纯化株的抗原性。结果:以Ⅱ型登革病毒中国株D01090基因组为模板,能扩增出511bp的登革病毒特异基因和119bp的Ⅱ型登革病毒型特异性基因。病毒经C6/36细胞扩增后滴度达4.5CCID50/ml,感染KMB17细胞至第三代可产生明显的细胞病变(cytopathic effect,CPE),连续传10代细胞病变速度逐渐增快,至第10代达到增殖高峰,病毒滴度达5.0CCID50/ml;将病毒感染6天后病变达+++的KMB17细胞进行超薄切片后经透射电镜观察细胞的病理变化,镜下可观察到内质网中新组装成的病毒颗粒,细胞周围产生很多分裂的小碎片,伴有游离出胞的病毒;三轮蚀斑纯化后筛选出纯化克隆,免疫荧光法检测病毒的抗原性呈阳性。结论选育出了能稳定传代且病毒扩增量高的Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株,经蚀斑纯化后仍保持较好的抗原性。     

靶向ICP4的小干扰RNA对HSV-1病毒复制能力的影响

HSV-1是一种嗜神经病毒,能引起一系列神经系统严重症状,然而目前抗HSV-1药物易反弹、不能完全清除潜伏的病毒。ICP4对HSV复制、转录起主要调节作用,决定着溶细胞型感染或潜伏状态的平衡点。为了探寻新的抗病毒策略,本课题以HSV-1ICP4基因为靶点,设计合成2对siRNA,并构建重组真核慢病毒表达质粒pL-KO-puror-hU6-siRNA,通过脂质体转染和嘌呤霉素筛选建立靶向ICP4的4个siRNA单克隆细胞系,Real-timePCR法检测细胞系中ICP4的mRNA表达水平,TCID50法检测siRNA对HSV-1病毒复制能力的影响。结果显示靶向siRNA能有效抑制单克隆细胞系中的ICP4表达,并且抑制ICP4的表达后HSV-1病毒复制能力明显减弱,表明靶向ICP4的siRNA对HSV-1复制有明显抑制作用,且多位点siRNA联合干扰对病毒复制有协同抑制效果,有望应用于生物抗病毒药物的制备。     

RNA 干扰沉默缺氧诱导因子1α逆转肺癌细胞耐药性

目的:观察RNA干扰沉默缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对肺癌细胞耐药性的影响。方法:构建靶向HIF-1α小干扰RNA基因,并转染到人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞中。逆转录聚合酶链反应RT-PCR)检测细胞的HIF-1α、多药耐药基因1(MDR-1)以多药耐药相关蛋白基因(MRP)mRNA变化,免疫细胞化学法观察干扰后HIF-1α、P-糖蛋白以及MRP蛋白的变化。MTT法检测不同浓度的顺铂作用下细胞死亡率。结果:HIF-1αsiRNA组中HIF-1α、MDR-1、MRP mRNA水平显著降低(P<0.05),且蛋白水平也显著下降(P<0.05)。HIF-1αsiRNA组细胞死亡率较未转染组均明显增高(P<0.05),转染siRNA阴性组不影响肿瘤细胞的耐药性。结论:HIF-1αsiRNA可显著降低A549/DDP细胞中HIF-1α、MDR-1、MRP表达,从而起到逆转肺腺癌A549/DDP细胞的耐药作用。     

磷脂爬行酶1对干扰素抑制乙型肝炎病毒(HBV)作用的影响

研究磷脂爬行酶1(Phospholipid scramblase 1,PLSCR1)对干扰素抑制HBV作用的影响。设计合成PLSCR1特异性小干扰RNA(siRNA),以完全随机序列的阴性小干扰(NCsiRNA)作为对照,转染HepG2细胞,于转染48h后分别检测PLSCR1mRNA和蛋白水平表达量的变化,筛选出对PLSCR1具有沉默作用的siRNA;将HepG2细胞分为正常对照组和干扰素处理组,将1.3倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因真核细胞表达载体HBV1.3质粒分别与PLSCR1siRNA或NCsiRNA共同转染HepG2细胞或干扰素处理的HepG2细胞,转染48h后检测各组细胞中PLSCR1mRNA表达量及培养液上清中HBsAg表达水平。PLSCR1特异性小干扰RNA siRNA911转染后能够显著抑制HepG2细胞中PLSCR1基因在mRNA和蛋白水平的表达;与HepG2细胞对照组比较,干扰素处理组细胞转染HBV1.3质粒、NCsiRNA+HBV1.3质粒后,细胞培养液中HBsAg表达水平均显著降低(P0.05);而PLSCR1siRNA与HBV1.3共转染IFN处理的HepG2细胞组与共转染HepG2细胞组相比较,细胞培养液中HBsAg的表达水平没有显著差异。提示抑制PLSCR1的siRNA可抑制干扰素的抗HBV活性,提示PLSCR1在干扰素抑制HBV复制中具有重要作用。     

利用RNAi技术分析VP16对HSV-1增殖过程的影响

目的:探讨在RNAi技术条件下,HSV-1感染Vero细胞过程中,病毒间层蛋白VP16的生物学功能。方法:用T7RNA聚合酶体外合成针对VP16 mRNA的3种T7siRNAs。用Lipofectamine 2000脂质体转染Vero细胞后接种HSV-1,感染后12、24、36、48、60和72h,分别收取实验组和对照组标本,Karber法计算病毒滴度值,绘制子代病毒一步生长曲线。结果:病毒子代一步生长曲线显示,转染siRNAs的实验组Vero细胞接种HSV-1后24h(24h pi),病毒滴度明显低于对照组;12h pi也观察到病毒滴度低于对照组的现象;siRNAs具有协同作用,三种siRNAs同时作用时干扰效果最为明显;实验组病毒滴度高峰出现时间后移12h左右。结论:HSV-1间层蛋白VP16对病毒复制、成熟起重要的生物学作用。     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子1α逆转肺癌细胞耐药性

目的：观察RNA干扰沉默缺氧诱导因子1α（HIF-1α）对肺癌细胞耐药性的影响。方法：构建靶向HIF-1α小干扰RNA基因,并转染到人肺腺癌耐顺铂细胞株A549／DDP细胞中。逆转录聚合酶链反应RT—PCR）检测细胞的HIF-1α、多药耐药基因-（MDR-1）以多药耐药相关蛋白基因（MRP）mRNA变化,免疫细胞化学法观察干扰后HIF-1α、P-糖蛋白以及MRP蛋白的变化。MTT法检测不同浓度的顺铂作用下细胞死亡率。结果：HIF-1αsiRNA组中H1F-1α、MDR—1、MRPmRNA水平显著降低（P〈0．05）。且蛋白水平也显著下降（P〈0．05）。HIF-1αsiRNA组细胞死亡率较未转染组均明显增高（P〈0．05）,转染siRNA阴性组不影响肿瘤细胞的耐药性。结论：HIF-1αsiRNA可显著降低A549／DDP细胞中H1F-1α、MDR-1、MRP表达,从而起到逆转肺腺癌A549／DDP细胞的耐药作用。     

SUMO-1小干扰RNA的构建及其干扰效果检测

目的:构建小泛素相关修饰物-1(SUMO-1)基因的小干扰RNA(siRNA),并检测其对SUMO-1基因表达的干扰效果。方法:根据SUMO-1基因序列设计一条合理的SUMO-1siRNA,并将其克隆到pSliencer2.1-U6neo载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行酶切和测序鉴定;将构建的SUMO-1siRNA重组质粒单独转染或与带HA标签的SUMO-1表达载体共同转染人胚肾293T细胞,收集细胞裂解物,以抗HA和SUMO-1的抗体用Western印迹检测siRNA的干扰效果。结果:构建了SUMO-1siRNA重组质粒,干扰效果可达80%以上。结论:构建的SUMO-1siRNA为进一步进行蛋白质SUMO-1化修饰的研究奠定了基础。     

特异性干扰PB-1基因对H5N1高致病性禽流感病毒复制的影响

针对H5N1高致病性禽流感病毒PB-1基因,通过RNA干扰技术,设计siRNA,研究其抑制病毒复制的效果.siRNA转染MDCK细胞并接毒后,病毒滴度测定、Real-time PCR和间接免疫荧光试验结果显示,所设计的siRNA(ps-PB1-777)具有明显的抑制病毒复制的效果,PB-1基因的拷贝数和病毒蛋白表达都下降.设计的siRNA可显著抑制高致病性禽流感病毒的复制.因此,本研究中PB-1基因的有效siRNA可为预防和治疗H5N1高致病性禽流感提供合理的技术支持和物质储备.     

PES1基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-30细胞的生长抑制

目的:构建PES1基因的慢病毒干扰载体,研究其对乳腺癌细胞ZR75-30生长的影响。方法:设计针对PES1基因的siRNA引物,克隆到pSIH1-H1-Puro载体,包装成慢病毒,测定病毒的滴度,感染人乳腺癌细胞ZR75-30,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果,并通过生长曲线研究敲低PES1对ZR75-30细胞生长的影响。结果和结论:构建了具有明显干扰效果的PES1基因的siRNA慢病毒载体,能够有效抑制ZR75-30细胞内源的PES1 mRNA和蛋白水平,敲低PES1能够抑制ZR75-30细胞的生长。     

HSV在两种细胞培养上抗原出现规律(的观察)及细胞敏感性的比较

本实验观察比较了Hep—2细胞和兔肾细胞对单纯疱疹病毒的敏感性。用免疫荧光法和免疫酶标法检测了细胞培养上HSV抗原出现的规律。实验结果指出:Hep—2细胞和兔肾细胞对HSV的敏感性一致;接种病毒后6小时,可以在Hep—2细胞和兔肾细胞上发现HSV抗原;免疫荧光法和免疫酶标法是进行病毒学研究和病毒感染早期诊断的可靠方法。     

共表达人p53、GM-CSF和B7-1基因的重组腺病毒的构建

 为开展肿瘤的复合基因治疗 ,构建以串联方式携带人野生型p53、GM CSF和B7 1基因的重组腺病毒穿梭质粒pBB 1 0 2 .将pBB 1 0 2与腺病毒包装质粒GT40 50共转染 2 93细胞 ,通过细胞内同源重组获得重组腺病毒BB 1 0 2 .在 2 93细胞中扩增病毒 ,并通过氯化铯密度梯度超速离心纯化病毒 ,获得高滴度和高纯度的病毒 .分别经免疫组织化学分析、ELISA和流式细胞分析 ,检测BB 1 0 2介导的人野生型p53、GM CSF和B7 1基因在喉癌细胞Hep 2中的表达 .结果表明 ,BB 1 0 2能够有效地将其所携带的目的基因导入Hep 2细胞并使其在细胞中高效表达 ,表达高峰期为转染后 2～ 4d ,此后随时间递减 ,可持续 1 0d以上 .     

SV40T抗原肝细胞特异性表达载体的构建与鉴定

目的构建在肝细胞中特异性表达SV40T抗原的表达载体并进行鉴定。方法通过Gateway技术构建SV40T慢病毒载体p LV-Puro-ALBSV40T并通过菌落PCR筛选鉴定,将其与辅助质粒p LV-helper1、p LV-helpe2、p LV-helper3共转染293T细胞包装慢病毒并在荧光显微镜下进行滴度值测定。用SV40T慢病毒载体转染肝癌Hep G2细胞,并在荧光显微镜下行转染效率测定;实时荧光定量PCR检测转染细胞SV40T基因的表达水平。结果 Gateway技术构建的慢病毒载体p LV-Puro-ALBSV40T经鉴定完全正确;慢病毒包装48 h后视野下可见清晰绿色荧光表达,病毒滴度为1.73×108 TU/m L。慢病毒载体成功转染Hep G2细胞,转染效率约70%,并通过RT-PCR检测SV40T表达水平明显升高。     

二株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

目的从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLCMK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物信息学分析。结果树鼩腹泻粪便样品在KMB17、Vero和LLC-MK2细胞上经连续3代次传代后,均能产生细胞病变。经电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析和轮状病毒鉴别筛查,推测其为呼肠孤病毒。病毒基因组全长S1基因扩增、序列测定和分析结果表明,KMB17培养上清中获得的病毒与I型原型株T1L同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和90%,因此该病毒定义为呼肠孤病毒I型。而LLC-MK2和Vero细胞上清中的病毒S1基因与III型原型株T3D核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和92%,因此为呼肠孤病毒III型。结论对今后树鼩和其他宿主呼肠孤病毒的分离鉴定有一定的指导意义。     

HSV-1感染细胞中HTRP基因的克隆及表达纯化

在对单纯疱疹病毒1型（HSV－1）感染KMB－17细胞后的早期基因反应的研究中,从HSV－1感染后细胞特异性cDNA文库中筛选出一个1381bp基因一HTRP,基因测序分析表明为与HSV－1感染相关基因（GenBank登录号：AF450482）,含有完整的ORF框架,cds全长924bp,编码308个氨基酸。构建了pGEX-HTRP表达质粒,在大肠杆菌B21加获得了较高的表达,采用Glutathione Sepharose4B进行亲和纯化后获得较高纯度的HTRP蛋白。用该蛋白免疫小鼠后制备的特异抗血清,在蛋白印迹实验中表现出抗体的特异性。     

重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法设计引物扩增获得目的基因小鼠MIP-1α和B7-1基因的全长编码序列cDNA,将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,其产物转化感受态细胞,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析。MIP-1α和B7-1目的基因质粒转染293T细胞,观察绿色荧光蛋白（GFP）表达,采用Western Blot法检测其蛋白表达,实时荧光定量PCR,检测慢病毒浓缩液的滴度。结果成功构建了重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,实时荧光定量PCR证实MIP-1α、B7-1基因重组慢病毒载体的滴度均达2.00E＋8 TU/mL。结论本研究成功构建并包装出高滴度的小鼠MIP-1α和B7-1基因重组慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定了基础。