PCR-DGGE技术在农田土壤微生物多样性研究中的应用

变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)在微生物生态学领域有着广泛的应用。研究采用化学裂解法直接提取出不同农田土壤微生物基因组DNA,并以此基因组DNA为模板,选择特异性引物F357GC和R515对16S rRNA基因的V3区进行扩增,长约230bp的PCR产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行分离后,得到不同数目且分离效果较好的电泳条带。结果说明,DGGE能够对土壤样品中的不同微生物的16S rRNA基因的V3区的DNA扩增片断进行分离,为这些DNA片断的定性和鉴定提供了条件。与传统的平板培养方法相比,变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术能够更精确的反映出土壤微生物多样性,它是一种有效的微生物多样性研究技术。     

茶园土壤微生物群落基因多样性

应用PCR技术,直接从土壤中抽提总DNA,扩增16S rDNA V3 片段,采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析16S rDNA V3 片段的多态性,研究了杭州西湖梅家坞不同植茶年龄(8、50和90年)、不同利用方式(茶园、荒地和林地)的土壤微生物群落基因多样性.结果表明：不同植茶年龄和不同土地利用方式影响土壤微生物群落的基因多样性.荒地、茶园和林地土壤微生物群落基因多样性指数明显不同(P<0.05),其排列顺序为荒地>茶园>林地.不同植茶年龄的土壤中,50年茶园土壤的微生物群落基因多样性指数、微生物量碳和基础呼吸明显高于8年和90年茶园土壤(P<0.05).     

高通量测序技术在线虫多样性研究中的应用

土壤线虫多样性是土壤生态学研究的热点之一, 然而对土壤线虫群落组成及多样性的研究通常受到分类学和方法学的限制。当前, 分子生物学技术的快速发展丰富了我们对土壤线虫多样性的认识, 但也存在一定的局限性。本文综述了常用分子生物学技术如变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)、末端限制性片段长度多态性分析(terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)、实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)和高通量测序(high-throughput sequencing, HTS)技术近年来在线虫多样性研究中的应用, 重点从土壤线虫DNA提取方法、引物和数据库的选择、高通量测序技术和形态学鉴定结果的比较等方面阐述了高通量测序技术在线虫多样性研究中的优势与不足, 并提出选择合适的线虫DNA提取方法结合特定引物和数据库进行注释分析, 仍是今后使用高通量测序技术开展线虫多样性研究的重点。当研究目标是土壤线虫多样性时, 优先推荐富集线虫悬液提取DNA的方法, 因此, 研究人员应根据具体目标选择最优组合开展实验研究。     

土壤微生物群落多样性解析法:从培养到非培养

土壤微生物群落多样性是土壤微生物生态学和环境科学的重点研究内容之一.传统的土壤微生物群落多样性解析技术是指纯培养分离法(平板分离和形态分析法以及群落水平生理学指纹法).后来,研究者们建立了多样性评价较为客观的生物标记法(磷脂脂肪酸法和呼吸醌指纹法).随着土壤基因组提取技术和基因片段扩增(PCR)技术的发展,大量的现代分子生物学技术不断地涌现并极大地推动了土壤微生物群落多样性的研究进程.这些技术主要包括:G+C％含量、DNA复性动力学、核酸杂交法(FISH和DNA芯片技术)、土壤宏基因组学以及DNA指纹图谱技术等.综述了这些技术的基本原理、比较了各种技术的优缺点并且介绍了他们在土壤微生物群落多样性研究中的应用,展望了这些技术的发展方向.     

七鳃鳗遗传多样性与演化研究进展

七鳃鳗(Petromyzonidae)是目前已知最古老的脊椎动物中惟一的幸存者.对其资源保护和演化发育生物学的研究正日益受到重视.本文从染色体、蛋白质和DNA水平总结近年来七鳃鳗遗传多样性与演化方面的研究进展.重点介绍了限制性酶切片段长度多态性、DNA随机扩增多态性、DNA扩增片段长度多态性、微卫星DNA标记等技术及线粒体DNA和功能基因研究应用于七鳃鳗种群遗传多样性、遗传分化、遗传结构、种质鉴定与渔业资源管理及系统进化等方面的新进展.     

苔藓植物分子系统学研究概况

结合同工酶分析技术及随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)和DNA序列测序3种分子生物学技术,对苔藓植物的分子系统学研究概况进行了介绍,并指出了在苔藓植物分子系统学研究中存在的一些问题.     

论分子生物学技术在环境微生物研究中的应用

随着分子生物学技术在新时期的高速发展,越来越多的新方法、新技术被应用于环境微生物研究,本文简要介绍了荧光原位杂交、变性梯度凝胶电泳、末端限制性酶切片段长度多态性分析、基因芯片技术等在环境微生物研究中的应用,不仅可以在环境微生物研究中最大限度的获取微生物遗传信息,并可以对环境中微生物的多样性进行全面分析。     

鸡的遗传多样性的研究方法及研究进展

遗传多样性是生物学研究中的一个重要领域,研究鸡的遗传多样性,不仅能加强生物多样性的保护。同时对起源进化、分类鉴定及遗传育种等都有重要的意义。本文对目前DNA水平鸡的遗传多样性的研究方法和研究进展进行了详细的阐述。重点介绍了DNA分子标记的特征;概括了在鸡遗传多样性分子标记的方法,包括微卫星分子标记(SSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性标记(RAPD)、限制性片段长度多态性标记(RFLP)和单核苷酸多态性标记(SNP)。本文综述了最近有关鸡DNA水平的遗传多样性的研究方法在系统学、遗传结构、生物地理等研究中的应用情况;提出在研究鸡遗传多样性时,可根据研究的目的,选择合适的方法。     

新疆一号冰川土壤细菌多样性的研究*

应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分离PCR扩增的16S rDNA来研究土壤微生物的多样性。直接从新疆一号冰川不同海拔高度的土壤样品中提取总DNA。用两套细菌通用引物分别扩增16S rDNA的V3和V6/V9高变区的特异性片段,PCR产物进行DGGE分析。PCR-DGGE图谱表明,PCR产物经DGGE检测到的条带清晰且分离效果好。结果表明,PCR-DGGE是一种快速研究微生物群落结构的有效方法。     

不经培养的农田土壤微生物种群构成及系统分类的初步研究

采用一系列的现代分子生物学技术,避开传统的分离培养过程,探讨自然界中微生物种群的基因多样性。经过直接从土壤中抽提总DNA,并对总DNA中16S rDNA V3可变区序列作PCR扩增、变性梯度凝胶电泳等,对农田土壤微生物种类分布进行初步的研究,发现不同的农田土壤间的菌种差异相当显著,同时对部分农田微生物的系统分类作了初步尝试,为农田土壤微生态和高效菌肥的研究提供了新的实验依据。     

Diversity and ecology of soil fungal communities: increased understanding through the application of molecular techniques

Fungi fulfil a range of important ecological functions, yet current understanding of fungal biodiversity in soil is limited. Direct DNA extraction from soil, coupled with polymerase chain reaction amplification and community profiling techniques, has proved successful in investigations of bacterial ecology and shows great promise for elucidating the taxonomic and functional characteristics of soil fungal communities. These community profiling techniques include denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), temperature gradient gel electrophoresis (TGGE), single-strand conformation polymorphism (SSCP), terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP), amplified rDNA restriction analysis (ARDRA), amplified ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA) and cloning, and are generally coupled with DNA sequencing. The techniques and their potential limitations are discussed, along with recent advances that have been made possible through their application in soil fungal ecology. It is unlikely that a single approach will be universally applicable for assessing fungal diversity in all soils or circumstances. However, judicious selection of the methodology, keeping the experimental aims in mind, and the exploitation of emerging technologies will undoubtedly increase our understanding of soil fungal communities in the future.     

Genotypic Microbial Community Profiling: A Critical Technical Review

Microbial ecology has undergone a profound change in the last two decades with regard to methods employed for the analysis of natural communities. Emphasis has shifted from culturing to the analysis of signature molecules including molecular DNA-based approaches that rely either on direct cloning and sequencing of DNA fragments (shotgun cloning) or often rely on prior amplification of target sequences by use of the polymerase chain reaction (PCR). The pool of PCR products can again be either cloned and sequenced or can be subjected to an increasing variety of genetic profiling methods, including amplified ribosomal DNA restriction analysis, automated ribosomal intergenic spacer analysis, terminal restriction fragment length polymorphism, denaturing gradient gel electrophoresis, temperature gradient gel electrophoresis, single strand conformation polymorphism, and denaturing high-performance liquid chromatography. In this document, we present and critically compare these methods commonly used for the study of microbial diversity.     

可可西里土壤样品中细菌多样性的分析

本实验采用纯培养和免培养相结合的方法对来源于可可西里的一份土壤样品中的细菌多样性进行了初步研究。纯培养实验使用了6种分离培养基, 共得到细菌19株, 其中放线菌7株, 非放线菌细菌12株。这些菌株分别属于叶杆菌属(Phyllobacterium)、贪食菌属(Variovorax)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、小月菌属(Microlunatus)、原小单胞菌属(Promicromonospora)、韩国生工菌属(Kribbella)和芽孢杆菌属(Bacillus) 8个属。免培养分析采用基于通用引物PCR 扩增的细菌16S rRNA 基因文库的方法以及变性梯度凝胶电泳(DGGE)。16S rRNA基因文库分析结果表明, 该土壤样品细菌群落可划分为19个OTUs, 分属于5个不同纲, 优势顺序为β-Proteobacteria (75%), α-Proteobacteria (9%), γ-Proteobacteria (7%), Actinobacteria (7%), Firmicutes (2%)。变性梯度凝胶电泳分析表明, 该样品细菌多样性指数Shannon-wiener index为2.68, 表明其中微生物多样性较低, 这可能和其所处的极端环境有一定关系。比较纯培养和免培养的实验结果发现, 土壤中的一些优势细菌并没有被有效地分离, 需要在针对特定微生物设计特定培养基及培养条件进行选择性分离上做更多的探索研究。     

现代分子生物学技术在冰川微生物生态研究中的应用

研究冰川中微生物的多样性对于揭示环境气候变迁,研究生物进化,开发微生物资源具有重要意义,现代分子生物学的发展为研究冰川微生物的多样性提供了行之有效的方法.简要综述了16S rDNA文库构建、变性梯度凝胶电泳、限制性片段长度多态性和荧光原位杂交等技术的原理及在冰川微生物生态研究中的应用现状.     

Separation of fluorescence-labelled terminal restriction fragment DNA on a two-dimensional gel (T-RFs-2D) - an efficient approach for microbial consortium characterization

Fingerprinting techniques provide access to understanding the ecology of uncultured microbial consortia. However, the application of current techniques such as terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) has been hindered due to their limitations in characterizing complex microbial communities. This is due to that different populations possibly share the same terminal restriction fragments (T-RFs) and DNA fragments may co-migrate on DGGE gels. To overcome these limitations, a new approach was developed to separate terminal restriction fragments (T-RFs) of 16S rRNA genes on a two-dimensional gel (T-RFs-2D). T-RFs-2D involves restriction digestion of terminal fluorescence-labelled PCR amplified 16S rRNA gene products and their high-resolution separation via a two-dimensional (2D) gel electrophoresis based on the T-RF fragment size (1(st) D) and its sequence composition on the denaturing gradient gel (2(nd) D). The sequence information of interested T-RFs on 2D gels can be obtained through serial poly(A) tailing reaction, PCR amplification and subsequent DNA sequencing. By employing the T-RFs-2D method, bacteria with MspI digested T-RF size of 436 (±1) bp and 514 (±1) bp were identified to be a Lysobacter sp. and a Dehalococcoides sp. in a polychlorinated biphenyl (PCB) dechlorinating culture. With the high resolution of 2D separation, T-RFs-2D separated 63 DNA fragments in a complex river-sediment microbial community, while traditional DGGE detected only 41 DNA fragments in the same sample. In all, T-RFs-2D has its advantage in obtaining sequence information of interested T-RFs and also in characterization of complex microbial communities.     

Comparison of methods for total community DNA extraction and purification from compost

The differences on DNA yield and purity of three different DNA extraction protocols were compared with regard to the use for PCR and other molecular analyses. Total DNA was extracted from compost by the three protocols, and then was purified by spin-bind cartridges after being precipitated by PEG8000. The detection performed on a nucleic acid and protein analyzer showed that all three methods produced high DNA yields. The agarose gel electrophoresis showed that the fragments of crude and purified DNA had a length of about 23 kb. A eubacterial 16S rRNA gene-targeted primer pair was used for PCR amplification, and full length 16S rDNAs were amplified from all the purified DNA samples. After being digested by restriction endonucleases, the restriction map of amplified rDNA showed identical genetic diversity. The products of PCR using primer pair GC341F and 907R were also used for denaturing gradient gel electrophoresis analysis. The results indicated that high-quality DNA was extracted from compost by the three protocols, and each of the protocols is adapted to extract microbial genome DNA from compost expediently and cheaply.     

不同覆土基质微生物结构特征研究及其对双孢蘑菇产量的影响

覆土是影响双孢蘑菇产量、质量和出菇整齐度的重要因子,利用现代分子生态学的方法快速、准确地对不同覆土基质微生物结构特征进行检测,以进一步了解微生物群落与双孢蘑菇相互作用关系。测定了不同覆土的理化特性,应用PCR技术对不同覆土材料提取总DNA,扩增细菌16S rDNA和真菌28S rDNA,运用变性梯度凝胶电泳技术对PCR产物进行分析,研究双孢蘑菇不同覆土基质微生物结构特征。结果表明：不同处理的覆土材料微生物群落的基因具有多样性,其中细菌群落基因多样性存在差异,使用纯泥炭与粉碎稻草处理差异最大,相似性仅为62%;通过真菌28S rDNA变性梯度凝胶电泳结果显示,粉碎稻草处理多样性指数最高,达3.576,但随着泥炭比例的提高,覆土处理中真菌群落的多样性相对减少;栽培试验发现,双孢蘑菇子实体形成量、总产量可能与覆土中的真菌群落多样性呈负相关。     

堆肥中微生物总DNA的高效提取

采用化学裂解和酶解相结合的方法,选择加入PVPP的高盐缓冲液作为细胞裂解的反应体系,并以PEG-8000进行DNA沉淀,从高有机含量的堆肥样品中进行微生物总DNA的提取。结果表明,从4种性质不同的堆肥中均获得了高质量的微生物总DNA,所得的DNA分子片段在23kb左右;每克干重堆肥的总DNA提取量为63.54±12.08μg~106.50±28.36μg,A260/A280大于1.6,A260/A230大于1.8,不用经过纯化可以直接进行PCR扩增和限制性酶切;以该DNA为模板进行微生物区系的DGGE分析,显示了丰富的微生物多样性。该方法减少了通常环境样品DNA提取过程中的纯化步骤,减少了DNA的损失,为从事微生物分子生态学,尤其是那些针对高有机含量以及获取极为不易的环境样品的研究而言是十分有益的。