一种简单的高产2,3-丁二醇发酵生产方法

利用一株克雷伯氏菌(Klebsiellasp.LN145)在以葡萄糖和磷酸氢二铵为主要成分的培养基中发酵生产2,3-丁二醇。在补料发酵培养过程中,通过补糖,2,3-丁二醇和3-羟基丁酮的最大产量分别达到了84.0 g/L和10.5 g/L,二醇的摩尔转化率达到理论水平的91%,转化速率达到1.8 g/(L.h)。     

2,3-丁二醇生产菌株生产能力的比较和培养基优化

对5株克雷伯氏肺炎杆菌 (包括两株乳酸途径被敲除的工程菌株) 发酵生产2,3-丁二醇能力进行了比较,其中K. pneumonia HR521 LDH (乳酸合成途径中ldhA基因被敲除) 具有最佳的发酵性能。通过正交试验优化了其发酵培养基的主要组分,优化后的培养基组成为：葡萄糖 90 g/L,(NH4)2HPO4 3 g/L,玉米浆 (CLSP) 6 g/L,乙酸钠 5 g/L,KCl 0.4 g/L,MgSO4 0.1 g/L,FeSO4·7H2O 0.02 g/L,MnSO4 0.01 g/L。在优化后的发酵培养基中进行摇瓶发酵,24 h发酵乙偶姻和2,3-丁二醇的终浓度为37.46 g/L,比未优化前增加了10 g/L,2,3-丁二醇得率达到了理论得率的90.53％,生产强度1.56 g/(L·h),检测不到副产物乳酸的生成,利于后提取工艺的进行和工业生产的应用。     

1,3-丙二醇生产的研究进展

作为一种重要的化工材料,1,3-丙二醇凭借其自身的优点,在工业生产中具有很高的应用价值。但其传统的生产方法,操作繁琐、技术难度大、设备投资高,已无法满足对1,3-丙二醇的日益增长的需要;而微生物发酵法又面临着产率低、发酵条件难以控制等弊病。相反,基因工程技术在1,3-丙二醇生产过程中扮演着越来越重要的角色。简要综述了1,3-丙二醇研究及生产工艺的进展。     

生物法生产2,3-丁二醇研究进展

2,3-丁二醇是一种重要的化工原料,可广泛应用于多个领域。二战期间由于合成橡胶需要大量1,3-丁二烯,2,3-丁二醇生产空前发展。近年来,由于聚对苯二甲酸丁烯树脂、γ-丁内酯,Spandex弹性纤维及其前体的需求增长,2,3-丁二醇的需求和产量也稳步增长。多年来,生物法生产2,3-丁二醇虽然得到了广泛的研究,但一直没有实现工业化。本文从产生2,3-丁二醇的菌种及2,3-丁二醇的生理意义、代谢途径、旋光异构体的形成机理、影响发酵的因素与产物的提纯等方面对生物法生产2,3-丁二醇进行了综述并提出了生物法生产2,3-丁二醇要解决的几个问题。     

产1,3-丙二醇基因工程菌发酵条件的研究

利用途径工程的方法,将来源于克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶基因dhaB和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT构建成多顺反子重组质粒pSE-dhaB-dhaT并在大肠杆菌JM 109中进行表达,在大肠杆菌中构建一条新的产1,3-丙二醇代谢途径。研究表明,重组菌株JM 109/pSE-dhaB-dhaT在微好氧条件下,尝试用廉价的乳糖为诱导物、维生素B12为辅酶,可以将甘油转化为1,3-丙二醇,产量达15.34 g/L,甘油转化率为35.7%,对低成本生产1,3-丙二醇作了有益的探索。     

产1,3-丙二醇新型重组大肠杆菌的构建

利用PCR技术从大肠杆菌(Escherichia coli )中扩增出1.16 kb的编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD,将其连接到表达载体pEtac,得到重组载体pEtac-yqhD,重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。SDS_PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为43 kD,同核酸序列测定所推导的值相符。对含有yqh-D的基因工程菌进行表达研究表明：37 ℃,以1.0 mmol /L IPTG诱导4 h,1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力达到120 u/mg蛋白,而对照菌株的酶活力为0.5 u/mg蛋白。再将含甘油脱水酶基因dhaB和含1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的重组质粒共转化大肠杆菌JM109得到重组大肠杆菌JM109（pUCtac-dhaB, pEtac-yqhD）,该菌株在好氧条件下,以1.0mmol/L IPTG诱导可将50 g/L甘油转化为38.0 g/L 1,3-丙二醇。首次发现1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶在好氧条件下表现出较高的活性。     

一株1,3-丙二醇生产菌的分离鉴定及其发酵特性

从活性污泥中分离筛选得到一株能代谢甘油生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的菌株2-1,通过形态学鉴定、生理生化试验、16S rRNA序列分析对菌株分类学地位进行鉴定,用MEGA 4.1软件构建的系统发育树显示菌株2-1与Klebsiella pneumoniae(CP001891)的亲缘关系最近。16S rDNA序列同源性比较发现,菌株2-1与模式菌株同源率为95.4%,疑似为新种。对菌株2-1在5 L发酵罐中进行发酵特性研究,分批补料发酵时得到较高的1,3-PD终浓度,达到63.5 g/L,此时生产强度为2.19 g/(L.h),底物转化率0.64 mol/mol。     

2,3-丁二醇代谢途径关键酶基因敲除对克雷伯氏菌发酵产1,3-丙二醇的影响

2,3-丁二醇是克雷伯氏菌发酵产1,3-丙二醇的主要副产物,为减少2,3-丁二醇的产生,利用Red重组技术对克雷伯氏菌2,3-丁二醇合成途径关键酶基因budC和budA进行了敲除。突变株发酵性能实验结果表明,所获得的两株突变株生长性能受到不同程度的影响;budC基因的缺失使菌株1,3-丙二醇产量提高了10%,2,3-丁二醇降低为原来的70%,而budA基因缺失则使菌株无2,3-丁二醇和1,3-丙二醇的产生,但乳酸、琥珀酸、乙醇和乙酸的产量较出发菌株都有明显增长。通过进一步对budC基因缺失菌株主要产物分析,推测在该菌中存在2,3-丁二醇回补途径,这一结果为低副产物克雷伯氏菌的改造提供了新依据。     

2，3-丁二醇的发酵及盐析分离工艺

采用克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae CICC 10011）发酵生产2,3-丁二醇,并对2,3-丁二醇的盐析分离工艺进行了考察。通过实验确定了以葡萄糖为底物微氧批式流加发酵的条件,发酵液中2,3-丁二醇和3-羟基丁酮的质量浓度分别为90．98g/L和12．40g/L,2,3-丁二醇的摩尔转化率为82．7％,生产强度达到2．1g/（L·h）。对发酵液中2,3-丁二醇的盐析分离研究表明,K2HPO4和K3PO4对2,3-丁二醇的盐析效果优于K2CO3。当发酵液浓缩70％后,加入质量分数为45％的K,HPO4,2,3-丁二醇的分配系数达到9．10,回收率为79．37％;上相中2,3-丁二醇的质量浓度达到420g／L;此时3-羟基丁酮的分配系数和回收率分别为11．9和83．48％。     

Present state and perspective of downstream processing of biologically produced 1,3-propanediol and 2,3-butanediol

1,3-Propanediol and 2,3-butanediol are two promising chemicals which have a wide range of applications and can be biologically produced. The separation of these diols from fermentation broth makes more than 50% of the total costs in their microbial production. This review summarizes the present state of methods studied for the recovery and purification of biologically produced diols, with particular emphasis on 1,3-propoanediol. Previous studies on the separation of 1,3-propanediol primarily include evaporation, distillation, membrane filtration, pervaporation, ion exchange chromatography, liquid–liquid extraction, and reactive extraction. Main methods for the recovery of 2,3-butanediol include steam stripping, pervaporation, and solvent extraction. No single method has proved to be simple and efficient, and improvements are especially needed with regard to yield, purity, and energy consumption. Perspectives for an improved downstream processing of biologically produced diols, especially 1,3-propanediol are discussed based on our own experience and recent work. It is argued that separation technologies such as aqueous two-phase extraction with short chain alcohols, pervaporation, reverse osmosis, and in situ extractive or pervaporative fermentations deserve more attention in the future.     

培养条件对一株木霉产纤维素酶过程影响的研究

采用固态发酵和连续监测正交实验结果的方法,研究了培养温度、初始pH值、液料比和接种量对一株木霉(Trichodermasp.)发酵过程中微晶纤维素酶活、CMC酶活和滤纸酶活的影响及影响程度。指出液料比在整个发酵过程中是对产酶影响最大的因素,温度在发酵初期影响较大,初始pH和接种量的影响均不显著。总体看来,培养温度、初始pH值、液料比和接种量分别为30℃、4、7和5%是比较合适的。     

核黄素发酵菌种改造研究进展

核黄素是一种水溶性维生素,与动植物的生长密切相关,人体不能合成核黄素,需从外部摄取,因此核黄素的生产具有重要意义。介绍了核黄素的生产发展历程和产核黄素的微生物种类。对枯草芽孢杆菌的核黄素代谢途径及其诱变育种进行了总结,重点介绍了菌种的基因重组改造方法,主要是提高核黄素操纵子表达以及提高Ru5P和GTP两种前体供应量合成途径通量,介绍了近些年新的改造方法,并对未来的发展方向进行了展望。     

肺炎克雷伯氏菌利用甘油生产1,3-PDO发酵优化的研究进展

发展可再生能源,尤其是生物能源,具有显著的能量收益和碳减排效益。随着石油等不可再生资源的减少,许多大宗传统石油化工产品正不断被使用可再生原料的生物制造产品替代。生物发酵法生产1,3-丙二醇(1,3-PDO)顺应了这一潮流,具有广阔的发展前景。提高微生物发酵竞争力,优化发酵法生产1,3-PDO水平,势必增加1,3-PDO的生产效益。对肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)发酵法进行1,3-PDO生产的代谢机理、菌株筛选和利用、发酵参数的选择和优化以及发酵工程策略的设计和监测等进行综述,为利用生物柴油副产物甘油生产有重要工业价值的1,3-PDO产品提供参考。     

Improved 1,3-propanediol production by engineering the 2,3-butanediol and formic acid pathways in integrative recombinant Klebsiella pneumoniae

In the biotechnological process, insufficient cofactor NADH and multiple by-products restrain the final titer of 1,3-propanediol (1,3-PD). In this study, 1,3-PD production was improved by engineering the 2,3-butanediol (2,3-BD) and formic acid pathways in integrative recombinant Klebsiella pneumoniae. The formation of 2,3-BD is catalysed by acetoin reductase (AR). An inactivation mutation of the AR in K. pneumoniae CF was generated by insertion of a formate dehydrogenase gene. Inactivation of AR and expression of formate dehydrogenase reduced 2,3-BD formation and improved 1,3-PD production. Fermentation results revealed that intracellular metabolic flux was redistributed pronouncedly. The yield of 1,3-PD reached 0.74 mol/mol glycerol in flask fermentation, which is higher than the theoretical yield. In 5 L fed-batch fermentation, the final titer and 1,3-PD yield of the K. pneumoniae CF strain reached 72.2 g/L and 0.569 mol/mol, respectively, which were 15.9% and 21.7% higher than those of the wild-type strain. The titers of 2,3-BD and formic acid decreased by 52.2% and 73.4%, respectively. By decreasing the concentration of all nonvolatile by-products and by increasing the availability of NADH, this study demonstrates an important strategy in the metabolic engineering of 1,3-PD production by integrative recombinant hosts.     

补料分批发酵过程中两阶段发酵生产1,3-丙二醇

在补料分批发酵过程中提高比生长速率不仅减少乙醇、甲酸的生成,而且提高1,3-丙二醇的得率和比生产速率.发酵后期甘油的浓度在15～26 g/L时有利于提高1,3-丙二醇的生产.采取在发酵前期控制菌体较高比生长速率和发酵后期控制适宜甘油浓度相结合的策略,有效地提高了1,3-丙二醇的生产,降低副产物乳酸和乙醇的生成.     

Ethanol Production from Colpomenia sinuosa by an Alginate Fermentation Strain Meyerozyma guilliermondii

With the consumption of energy and the spread of COVID-19, the demand for ethanol production is increasing in the world. The industrial ethanol fermentation microbes cannot metabolize the alginate component of macro algae, which affects the ethanol yield. In this research, the ethanol production process from macro algae by an alginate fermentation yeast Meyerozyma guilliermondii, especially the pretreatment process of Colpomenia sinuosa, was studied. At the same time, the experimental design of Box-Behnken was carried out to achieve the optimum fermentation performance. The concentration of KH₂PO₄ (A: 2–6 g.L⁻¹), pH (B: 4–7), reaction time (C: 60–120 h) and temperature (D: 24–34 °C) were variable input parameters. During the ethanol production process, the algae powder was firstly mixed with water at 90 °C for 0.5 h. Later the fermentation culture medium was prepared and then it was fermented by the yeast Meyerozyma guilliermondii to produce ethanol. And the optimal fermentation parameters were as follows: fermentation temperature of 28 °C, KH₂PO₄ dosage of 4.7 g.L⁻¹, initial pH of 6, and fermentation time of 99 h. The ethanol yield reached 0.268 g.g⁻¹ (ethanol to algae), close to the predicted value of model. The generation of alginate lyase during the fermentation of algae was also examined. The highest alginate lyase activity reached 46.42 U.mL⁻¹.     

氧供应量对Klebsiella pneumoniae利用混合糖生物合成2,3-丁二醇过程的影响分析

以筛选的肺炎克雷伯氏茵（Klebsiella pneumoniaeUV-86）为对象,考察供氧条件分别对茵体生长、葡萄糖和木糖双底物利用和产物合成的影响。研究发现生物量随氧供应量增加而增加。不同供氧条件对茵体消耗葡萄糖过程的影响较小,而代谢木糖的能力随氧供应量的增大而增强。微氧条件下2,3-丁二醇的生物合成能力最强,2,3-丁二醇产量在1．5wm下达到最高为30．1g／L,是好氧时的2．5倍,最大体积产率为0．485g／（L·h）。不同条件下两底物产物分布有所区别,木糖代谢中乙酸生产增强。因此根据不同阶段代谢特点选择适合的供氧策略可以提高过程产量和产率。     

利用废弃物发酵法生产聚羟基烷酸PHAs

聚羟基烷酸(PHAs)是一种可降解聚合物,与石化塑料相比它具有生物降解性及生物相容性等优点,在不久的将来必然有广阔的应用前景。生产PHAs的主要方法是发酵法,在过去的几十年里传统的深层发酵法生产PHAs的工艺已经得到深入的研究,近些年固态发酵法生产PHAs也吸引了越来越多研究者的关注。