乙酸对重组大肠杆菌生长及外源基因表达的影响

在重组基因工程菌ＤＨ５α（ＰＧ－ＦＧＦ）的高密度培养过程中,发现培养液中有大量代谢副产物－乙酸的产生和积累,乙酸的存在抑制了工程菌的生长及外源基因的表达。研究了乙酸在Ｍｇ培养基中对工程菌ＤＨ５α（ＰＧ－ＦＧＦ）生长及外源基因表达的影响。结果表明,乙酸的存在不仅导致重组菌生长速率的降低及延迟期的增长,而且对外源基因产物的表达具有强烈的抑制作用,这为该工程菌的高密度培养及外源基因产物的高表达打下了基础。     

影响大肠杆菌中外源基因表达的因素

大肠杆菌已经被广泛地应用于表达各种外源基因,但是,不同的外源基因在表达效率上却有很大的差异,文章综述了影响大肠杆菌中外源基因表达的因素,这将有助于认识大肠杆菌中外源基因表达的规律,以便采取有效的方法提高外源基因在大肠杆菌中的表达效率．     

大肠杆菌中外源基因表达的研究进展

工程技术已使许多生物活性蛋白基因在大肠杆菌中中得到表达,但不同外基因表达效率并异很大,本文综述了影响外源基因表达的一些因素,以便采取有效方法提高外源基因在大肠杆菌中的表达效率。     

微量元素对大肠杆菌生长和乙酸生成的影响研究

大肠杆菌DA19的代谢特性与培养基中添加微量元素有较大的关系。在基本培养基中,当氮源限制时,添加微量元素可以在一定程度上改善DA19菌体的生长,提高菌体得率YX/G,大大减少乙酸的生成;当氮源充分时,与不添加微量元素相比,DA19在添加微量元素后,菌体浓度大大增加,虽然葡萄糖消耗速率加快,但产乙酸仍然很少,只有不添加时的13％,YX/G提高至少60％。基本培养基中添加0.1～1mL/L的微量元素混合溶液对DA19菌体生长、乙酸生成及葡萄糖消耗没有显著影响。在单独添加不同种类的微量元素时, BO33-、Zn2+、MoO42+、Cu2+没有特别明显的影响,Al3+会抑制菌体生长和葡萄糖利用,而Co2+、Mn2+、Fe2+可以改善细胞生长,特别是添加Fe2+时,细胞生长及乙酸生成等培养结果与添加微量元素混合溶液几乎相同。     

重组基因表达对大肠杆菌生理的影响

重组基因在表达外源蛋白质时常常会耗用大量的宿主细胞资源,从而对宿主造成代谢负荷,代谢负荷使得宿主的生化和生理产生很大的变化,甚至损害宿主正常的代谢功能。而过重的代谢负荷会影响目标蛋白的表达量和表达质量。综述了产生代谢负荷的原因,宿主细胞对代谢负荷的应激反应、以及减轻代谢负荷的策略。     

大肠杆菌不同受体对外源基因表达的影响

自七十年代基因工程建立以来,对基因的分离、导入及其在受体中的表达等方面进行了大量的研究,也取得了可喜的成果.本文把能表达产物并可检测的外源基因重组质粒导入大肠杆菌不同受体菌株中,观察了不同受体对外源基因表达的影响.发现同一基因在不同的大肠杆菌受体中的表达量有很大差异,这说明不同受体对外源基因表达的影响是不同的。     

重组大肠杆菌高密度发酵研究进展

重组大肠杆菌的高密度发酵是提高基因工程产品产量的一个非常有铲的手段,是现代发酵工程研究的一个热点。本文就高密度发酵中影响重组大肠杆菌发酵产率的几个因素,包括宿主菌、培养基、培养条件、补料方法以及高密度发酵过程中存在的问题和对策加以讨论,着重探讨了高密度下大肠杆菌产生的有害代副产物－－乙酸的产生机制、抑制作用机理,以及控制乙酸机累的技术方法。     

利用三阶段葡萄糖添加策略减少乙酸合成并促进重组大肠杆菌生产L-苯丙氨酸

为了降低副产物乙酸的积累和提高L-苯丙氨酸的产量,分别优化了L-苯丙氨酸发酵的初始葡萄糖浓度和葡萄糖的指数流加策略.结果表明,20 g/L的初始葡萄糖浓度可以控制细胞的比生长速率低于临界值0.3 h-1,显著地降低了乙酸的积累,提高了L-苯丙氨酸的产量.采用预设比生长速率μ3* =0.4(h-1)进行葡萄糖的指数流加取得了实际最大比生长速率0.29 h-1,使细胞的比生长速率低于临界值,促进了L-苯丙氨酸的合成,最终获得L-苯丙氨酸的产量达48.45 g/L,比本实验室原有水平提高了37％.     

生长抑制激素基因在大肠杆菌中的表达

从pSom5中提纯生长抑制激素基因片段,在体外与大肠杆菌pBD_2质粒DNA重组连接,转化受体细胞D_2A_1,获得7株工程菌,在IPTG诱导下进行表达。采用β-半乳糖苷酶底物亲和层析法纯化,得到一纯净的分子量为50000道尔顿左右的蛋白质。对此蛋白质及其经CNBr化学裂解的产物进行放射免疫分析,证实化学合成的生长抑制激素基因已在大肠杆菌D_2,A_1中成功地表达,每升培养基中获得生长抑制激素41.69mg,占菌体总蛋白质的0.71%。     

乙酸积累对基因工程菌培养的影响及与培养基pH的关系

在rIL-2工程菌K_(802)(pLY—4)高密度培养中,发现培养液中有大量代谢副产物乙酸积累,乙酸的存在对工程菌的生长和产物的表达均有明显的抑制作用,这种抑制作用是制约工程菌高密度培养的重要因素。为了减小这种抑制作用,初步研究了培养基pH与乙酸抑制作用的关系,发现适当提高培养基pH值,能减小乙酸的抑制作用;高密度培养时,提高培养基的pH后,虽然仍有大量乙酸积累,但产物的表达水平和菌密度都有提高。     

抗性库蚊酯酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用抗性库蚊酯酶基因,引入原核表达载体pRL439,转化大肠杆菌HB101细胞,获得表达。通过酶切、Southern杂交鉴定重组质粒。研究了重组菌酯酶的活性,重组质粒pRLB1表达的酯酶具有高酶活并能高效降解酯酶的特异性底物α乙酸萘酯(αNA)和β乙酸萘酯(βNA);经对重组菌进行细胞固定化后降解农药三氯杀虫酯(7504),反应时间短,降解效率高     

解毒酶基因的克隆及其在大肠杆菌和蓝藻中的表达(英文)

近几年来 ,在明确了杀虫药剂抗性机理的基础上 ,从杀虫药剂抗性的昆虫中分离出高抗性基因 (即解毒酶基因 ) ,将该基因克隆到表达载体 pRL 4 39上 ,得到表达载体 pRL B1,将其转化大肠杆菌HB10 1,获得了可以表达解毒酶基因的转基因工程菌株。同时构建了穿梭表达载体 pDC B1,并转化大肠杆菌HB10 1后 ,在抗生素氨卞霉素 (30 μg/mL)和卡那霉素 (30 μg/mL)平板上挑选阳性克隆 ,将阳性克隆的细胞、蓝藻和结合质粒以三亲结合转移的方式转入蓝藻。斑点杂交、Southern分析结果表明已经获得了Synechococcussp .PCC 794 2转基因工程藻。     

霍乱毒素B亚单位工程菌MM2的表达与lac启动子的关系

研究了不同碳源(葡萄糖、乳酸和乙酸)以及IPTG诱导对工程菌MM2表达霍乱毒素B亚单位(CTB)的影响,ctb基因位于lac启动子的下游。在YC培养基中分别加入0.048mol/L的葡萄糖、0.102mol/L的乳酸和0.167mol/L的乙酸,它们在完全氧化后可产生相同的能量。结果表明,加入葡萄糖会大幅度降低ctb基因的表达水平,其原因和培养过程中pH值下降有关;加入乳酸可提高ctb基因表达水平1.15倍,且不抑制菌体生长;加入乙酸可提高ctb基因的表达水平0.9倍,但对菌体生长有抑制作用。不同时间及不同浓度的IPTG诱导未能提高ctb基因的表达水平,说明lac启动子对ctb基因的表达没有影响或影响很小。     

弱氧化醋杆菌阿拉伯糖醇脱氢酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

The partial genomic library of Acetobacter suboxydans was constructed using Yeast\| E.coli shuttle plasmid YEp352 as vector.Two positive transformants,designated as DH5α(pAD91) and DH5α(pAD98),were obtained by screening the growth of transformants on the agar plate in which D\|arabitol was used as the sole carbon source.The results of Southern blot and restriction endonuclease analysis showed that the two recombinants are identical.The insert is about 2.3kb.Arabitol dehydrogenase activity assay indic…     

嗜水气单胞菌TPS-30株丝氨酸蛋白酶基因与溶血素基因在大肠杆菌中的融合表达

嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶和溶血素是该菌重要的致病因子与保护性抗原。致病性嗜水气单胞菌TPS-30株为江浙一带鱼类暴发病病原主要血清型O:9的代表株。研究利用PCR方法扩增嗜水气单胞菌TPS-30株的丝氨酸蛋白酶基因(Spe)和溶血素基因(Hly),将基因Spe和Hly通过柔性片段进行融合,并将融合片段插入pET32a的多克隆位点,构建成重组融合表达载体pET32a-Spe-Hly。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得融合蛋白Spe-Hly。表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期大小约130kD相吻合的融合蛋白带。纯化融合蛋白并对鲫鱼进行免疫攻毒试验。结果表明,丝氨酸蛋白酶基因和溶血素基因融合表达载体构建成功,并成功获得了融合蛋白Spe-Hly,对鲫鱼的免疫保护率达81.4%。这为基因工程亚单位多价疫苗的开发提供基础。       

里氏木霉纤维二糖酶bgl II基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链,并以之为模板进行 RT-PCR合成约1.4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型表达载体pJW2中,经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子,温度诱导后,经酶活测定,bgl II基因在大肠杆菌中得到了表达,酶活为0.75IU/mL.     

水稻矮缩病毒最外层外壳蛋白基因(S_2)cDNA克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

从水稻矮缩病毒（Ｒｉｃｅｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ,ＲＤＶ）中国福建分离物中克隆分离了最外层外壳蛋白基因（Ｓ２）全长ｃＤＮＡ,并对其进行了序列分析,结果表明ＲＤＶＳ２ｃＤＮＡ全长３５１２ｂｐ,仅含一个３３４８ｂｐ的阅读框架,编码一个含有１１１６个氨基酸的蛋白（Ｐ２）。与基因库中已知基因序列比较,发现它与日本ＲＤＶＨ株系相应片段的核苷酸和氨基酸同源率分别为９４６％和９５４％,与轮状病毒ＶＰ２氨基酸序列有一定的同源性。Ｓ２核苷酸序列二级结构预测结果表明,５’端５０个核苷酸的二级结构为一个发夹结构和一个茎环结构。Ｐ２有４个富含亮氨酸的区域,位于Ｎ端亲水区域的１０个氨基酸（ＡＡ６９～７８）残基形成一个α螺旋,这些特点均与轮状病毒ＶＰ２的结构特征相似。ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析表明在大肠杆菌中分段高效表达了Ｓ２编码蛋白的Ｎ端和Ｃ端。     

从大肠杆菌C-8制备和纯化唾液酸

大肠杆菌产生的多聚唾液酸是一类线性的同聚合体,这由２００个左右的唾液酸通过α２,８酮苷键连接。我们在前文［１］中已就产多聚唾液酸的菌种筛选及产酸条件作了叙述。本文将对多聚唾液酸的水解、唾液酸的纯化及鉴别进行研究,为今后应用打下基础。１材料和方法１...